Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe NS45037 R21 ve R01 ES014901) fon tarafından desteklenmiştir.

1. Kültür ortamının hazırlanması (C2 ortamı) <ol><li> Steril, tek kullanımlık 500 ml Erlenmeyer şişesine, listelenen sırada, aşağıdakileri ekleyin: <table border="1"><tbody><tr><td> Miktar </td><td> Bileşen </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (düşük glukoz) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> yağ asidi serbest BSA (DMEM 20mg/ml) </td><td> 50 mcg / ml </td></tr><tr><td> 2.8 ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 1.4 mM </td></tr><tr><td> 4 ml </td><td> insülin / transferrin / selenyum (100x) </td><td> 10 ug / ml insülin 5.5 ug / ml transferrin 38.7 nM selenyum </td></tr><tr><td> 0.4 ml </td><td> NGF (125 ug / ml) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> Ham F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> Yavaşça t Swirl17 x 100 steril ek kap tüplerde tüp başına o mix ve tablet 10 ml. </li><li> -80 At ° C&#39;nin </li><li> Önemli notlar: <ul type="disc"><li> Kullanımı hemen önce NGF çözülmesini sağlayın. </li><li> NGF stok solüsyon aliquoting önce, astar öncesi protein ile doku kültürü plastik serolojik pipet iç duvarları plastik NGF yapışmasını en aza indirmek için. Kolay yaklaşım BSA ihtiva eden birkaç kez DMEM karışımı Pipeti etmektir. DMEM karışımı ile NGF tüpü birkaç kez çalkalayın. </li><li> Ücretsiz sistein insülin disülfür bağları istikrarsızlaştırmak olabilir, çünkü F-12 son ekleyin. </li><li> Capo 4 kristaller oluşabilir, çünkü cilt olarak daha büyük 10 ml Dondurmayın </li><li> 2 kat daha fazla C2 orta donma-çözülme etmeyin. </li></ul></li></ol> 2. Cam lameller hazırlanması <ol><li> Biz sadece ince Alman cam lamelleri (önerilen kaynak ve katalog numarası için bkz Tablo 1) Bu protokolde sürekli çalışmak bulduk. </li><li> Politetrafloroetilen (PTFE veya Teflon) kapak gömlekleri (Fisher katalog # 09-911-765) ile 300 ml cam şişe numune için% 70 nitrik asit 75-100 ml ekleyin. </li><li> Eldiven, damla, nitrik asit çözeltisinin içine tek tek lamelleri. Kavanozun dibinde üzerinde hiçbir 2-3 lamelleri daha kalın bir katman yaratmak için yeterli lamelleri ekleyin. </li><li> Yavaşça fazla 185 den rpm orbital çalkalayıcı sette oda sıcaklığında 6-8 saat lamelleri ile kaplar sallayın. </li><li> Bir çeker ocak çalışarak, dikkatle asit boşaltacaktır ve yerel düzenlemelere göre atın. Ultra saf doku kültürü dereceli su ile bir kez lamelleri durulayın, daha sonra konteyner 75-100 ml su ekleyin. Su bulanık hale gelirse lameller birden çok kez durulanmalıdır olabilir. Yavaşça en fazla 185 rpm orbital çalkalayıcı sette gece boyunca oda sıcaklığında sallayın. </li><li> 3 gün toplam nitrik asit / günlük doku kültürü dereceli su üstünde tekrarlayın. </li><li> Nihai boşaltacaktırdoku kültürü dereceli su ve zorlukla lamelleri kapsayacak kadar aseton ekleyin. </li><li> Bu aseton boşaltacaktır ve düzgün atmayın. </li><li> 150 mm cam petri için lamelleri aktarın. Ancak lamelleri kapsayacak kadar aseton ekleyin. Lamelleri çanak tek bir katmanda olduğundan emin olun. </li><li> Aseton bir çeker ocak gecede buharlaşmasına izin verin. </li><li> Sterilize etmek için 1.5 saat boyunca 180 ° C&#39;de bir kurutma fırında lamelleri. </li></ol> 3. Kültür lameller hazırlanması <ol><li> Diseksiyon bir gün önce, steril bir teknik kullanılarak, bir 24 gözlü doku kültürü plakası, her sıra için 1 cam coverslip (yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanan) ilave edilir. Her oyuğa steril bir poli-D-lizin solüsyonu (0.5 M Tris tampon pH 8 içinde 100 mg / ml), 200 ul ekleyin ve 4 ° C&#39;da gece boyunca levha depolamak. </li><li> Diseksiyon gün ve ideal diseksiyon başlamadan önce, her bir kuyudan poli-D-lizin çözüm aspire ve her iyi 5 kez yıkayınsteril doku kültürü dereceli su ile. </li><li> ° C inkübatör 37 her plaka ve mağaza için 200 ul düşük glukoz DMEM ekleyin. Kaplama hücreleri önce yaklaşık 1 saat, düşük glukoz DMEM kaldırmak ve 250 ul C2 orta başına da ekleyin. 37 Mağaza plakaları ° C&#39;de% 5 CO 2 altındaki hücreleri kaplı olmalıdır hazır olana kadar. </li></ol> 4. Diseksiyon ve Üstün Servikal ganglion İzolasyonu <ol><li> Daha az gliyal hücreleri vardır, çünkü sempatik nöronlar ayrışmış kültürler, genellikle prenatal hasat üstün servikal gangliya çözülmesi (SCG) (embriyonik günde 19-21) sıçan yavru ile hazırlanır. Ancak bu aynı protokolü erken postnatal (1 ila 3 gün önce) sıçan yavrularına veya perinatal fare yavruları başarıyla kullanılabilir. </li><li> CO 2 inhalasyon yoluyla gebe sıçan Euthanize. Karın Tıraş ve% 70 etanol ile cildinizi yıkayın. Steril şartlarda laparotomi çıkarın ve steril bir 150 mm Petri kabındaki laparotomi yerleştirin. ÖnlemekDiseksiyon sırasında bağırsak veya barajın diğer iç organların zarar. </li><li> Embriyonik yavrular uyutmak için bir buz kabı üzerine yavrular ile Petri yerleştirin. Uterin boynuz ve amniyon zarının serbest embriyolar parçalara ayır. Yavrular euthanize için omuz altında orta hat boyunca her yavru, omuriliğin kesin. Bu aynı zamanda SCG diseksiyonu sırasında karotid arterden kanama azaltır vena kava, keserse. Bir kez penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş steril bir Leibovitz L-15 orta (veya herhangi bir hava tamponlu ortama) yer embriyolar, uterin horn serbest kesilmiştir. </li><li> 150 mm petri Sylgard ile yarım dolu sırtlarını üzerinde embriyo yerleştirin. Steril 20 gauge iğneler kullanarak, hafifçe SCG diseksiyonu kolaylaştırır boyun, hyperextending, göğüs ve kafa pin. </li><li> Submandibular bezleri ortaya çıkarmak için clavicles seviyesinde boyun orta hattan bir kesik boyunca edin. Ince forseps (kullanarak bezleri çıkarın no. 4 ya da hiç. 5 Dumont) kas tabakası açığa çıkarmak. </li><li> Klavikula yakın sternokleidomastoid kası kesmek için ince forseps kullanın. Sonra yavaşça kaldırın ve trakea yanında omohyoid kas sarın. Bu kas çok ince, bu nedenle altta yatan karotis arter yırtılma ve SCG önlemek için çok derin kesme kaçının. Bu kas tabakaları yok olduktan sonra, karotis arter ve vagus siniri açıkça görünür olmalıdır. </li><li> SCG sadece karotis arter bifurkasyon altında yatıyor. Ince forseps (no. 4 veya 5 no.) Kullanarak, ganglion açığa karotis arter her iki uzak doku diseke künt. 2 ince forseps kullanılarak, yukarıda SCG uzanan karotid arterinin bölümü olarak kendisini SCG kaldırmak için, sırası ile, hemen yukarıda karotid arteri kavramak ve aşağıda SCG arasında rostral ve kuyruk uçları. Bu gelişme bu aşamada SCG boyunca uzanır boğumlu ganglion, aynı zamanda bu aşamada kaldırılacak olması muhtemeldir. Boğumlu ganglion identifie olabilirYuvarlak şekli ve çıkıntı büyük vagal sinir tarafından d. Bu karotis arter dallarından biri boyunca uzanır. Bunun aksine, SCG badem şeklindedir ve karotid arterinin çatallaşma doğrudan altına alır. L-15 orta ve antibiyotik içeren steril 35 mm&#39;lik kültür kabına disseke doku yerleştirin. Sonraki adımlara ilerleyen önce tüm yavrular gelen SCG çıkarın. </li><li> Ince forseps kullanarak hafifçe diseksiyon (özellikle vagus siniri ve boğumlu ganglion) sırasında karotis arter ve kaldırılan diğer dokulardan SCG ayırın. Gangliondan kapsül kaldırmak için ince pens kullanın. Bu büyük ölçüde kültüründe nöron dışı hücre sayısı azalır. L-15 orta içeren başka bir steril 35 mm çanak ganglionlarda aktarın. </li><li> SCG ayırmak için, L-15 orta kaldırmak ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi içinde 2 ml Kollajenaz (nihai konsantrasyon: 1 mg / ml) / Dispase (nihai konsantrasyonu 5 mg / ml) ile değiştirir. Inkübasyon40 dakika boyunca 37 ° C&#39;de te. </li><li> 15 ml steril bir konik bir santrifüj tüpüne aktarılır ve SCG BSA (nihai konsantrasyon 1-2 mg / ml) ile takviye L-15 ile 10 ml hacim getirmek. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 x g&#39;de santrifüje. Süpernatant atın ve BSA ile takviye L-15 ile bir kez daha yıkayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, tüm L-15 kaldırmak ve C2 orta ~ 2 ml gangliya tekrar süspansiyon. Bir yangın cilalı bükük ucu pipet ile hücreleri öğütmek, triturasyonun cam hücre yapışmasını en aza indirmek için önce pipetle BSA/L15 kaplı olduğundan emin olun. Hafifçe 3-4 kez çiğnemek. Büyük topaklar yaklaşık 1 dakika boyunca çözmek ve bir 15 ml konik tüpe hücre süspansiyonu aktarmak izin. Kalan SCG daha C2 medya ekleyin ve çiğnemek. Topaklar yerleşmek verildikten sonra, ikinci triturasyonun gelen birinci triturasyonun sonra toplanmıştır olduğu üzere hücre süspansiyonu transfer. Ganglia çoğunlukla uzaklaşılmış, kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. DDördüncü triturasyonun sonra kalan topaklar iscard. </li><li> Sıçan yavrusu (tipik olarak 12-16 PUP) bir altlık ayrışmış hücreleri için, ek bir C2 ortamı eklenerek 8-10 ml hücre süspansiyonu olarak orta toplam hacme getirmek. Hafifçe bir pipet kullanılarak tekrar süspansiyon hücreleri ve hücre yoğunluğu belirlemek için, küçük bir alikotu kaldırın. Süspansiyon, hücre süspansiyonu alikotu 250 ml başına ayrıca hücreleri korumak için emin olmak, daha sonra arzu edilen kültür hücre yoğunluğu elde 2X, ve hücre süspansiyonu hacmini ayarlamak. Dendritik büyüme morfometrik çalışmalar için, 24 kuyucuğu düşük yoğunluklu biz genellikle plak hücreleri (kisi iyi ~ 5 x 10 4 hücreli). </li><li> Bizim laboratuvar cam Desiccators yerine doğrudan CO 2 inkübatörde SCG kültürleri kuluçkaya. Serumsuz ortamda yetişen sempatik nöronlar biraz daha yüksek CO2 konsantrasyonu (yaklaşık% 6.5) daha iyi performans için bu yapılmaktadır. Ayrıca biz o antibiyotik kullanmayınur medya bunu akson uzantısı ve Desiccators sürdürme kültürlerini inhibe çünkü kültürlerin bir alt kümesi olarak geliştiğinde kontaminasyon yayılmasını en aza indirmek gibi görünüyor. Bu sistemi kullanarak, rutin kadar 8 hafta için SCG kültürleri korumak. Bir kez kaplama, SCG kültürleri alt steril su içeren cam Desiccators içinde porselen desikatöre plaka üzerine yerleştirilir. CO 2 yaklaşık 120 ml 35.5 ° C için kapalı mühürleme ve inkübatör seti içine tüm desikatöre vermeden önce desikatöre enjekte edilir </li></ol> 5.. Beslenme ve Kültürleri Bakım <ol><li> Kültürler, genellikle ilk medya değişimi ile kaplanmış 24 saat sonra meydana gelen, haftada 3 gün beslenir. Steril bir bent-ucu pipet kullanarak, hafifçe çukur başına medyanın yaklaşık yarısını çekebilirsiniz. Temiz steril bükük ucu pipet kullanarak, taze C2 ile kaldırıldı orta hacimli değiştirin. </li><li> Kültürden nöronal olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için, mitotik ajan, anti-CYTosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, nihai konsantrasyon 1-2 uM), genellikle 48 saat boyunca ilk medya değişimi de kültür ortamı (örneğin, 24 saat sonra kaplama) ilave edilir. ARA-C, bu konsantrasyon, genellikle olmayan tüm nöronal hücreleri çıkarmak için yeterli olur. Ek ARA-C tedavi gerekiyorsa, bu nöronlar üzerine toksik etkileri en aza indirmek için her besleme yapılması tavsiye edilir. </li></ol> 6. Matrigel veya BMP-7 ile Dendritik Büyüme indükleyen <ol><li> Dendritik büyümesini teşvik etmek için, non-nöronal hücrelerde elimine edildikten sonra ya da Matrigel BMP-7 kültürler eklenir ve kültürde ARA-C seviyeleri önemli ölçüde azalır. Tipik olarak, bu in vitro 5. günde orta Matrigel veya BMP-7 ekleme, fakat dendritik büyümesi, in vitro bir zaman noktasında eklendi Matrigel veya BMP-7 tarafından indüklenen edilebilir. Matrigel veya BMP-7 C2 ortamına ilave edilir ve yukarıda açıklandığı gibi kültürler beslenir. </li><li> Matrigel ve BMP-indüklenen dendritik büyüme zamanıve konsantrasyon bağımlı. Maksimal etkisi için, Matrigel 50-75 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon C2 ilave edilir; BMP-7 50 ng / ml&#39; lik nihai bir konsantrasyon C2 besiyerine eklenir. Den daha büyük 100 ug / ml veya 100 den büyük BMP-7 konsantrasyonlarının Matrigel konsantrasyonları ng / ml nöronal toksisite neden olduğu bildirilmiştir. Dendritik süreçler (gibi morfolojik kriterlere göre belirlenir) yaklaşık 48 saat maksimum etkili konsantrasyonlarda Matrigel veya BMP-7 için ilk maruz kaldıktan sonra belirgin hale gelir. Sağlam dendritik büyümesini teşvik etmek için, kültürler BMP-7 her besleme azından orta içeren ile beslenir. Eşdeğer sonuçlar benzer konsantrasyonlarda 20,21 azından BMP&#39;ler 2, 4, 5 ve 6 kullanılarak elde edilmiştir. </li></ol> 7. BMP-7-kaynaklı dendritik Büyüme İmmünositokimyasal Analizi <ol><li> Dendritik arborization of istenen ölçüde elde edildikten sonra, kültür 0.1 M fosfat tampon içinde% 4 paraformaldehit ile sabitlenir. En iyi fiksasyon bir% 4 paraformaldehit iyi yarısı orta yerine ve 10-15 dakika da bu işlem 3-5 defa tekrarlayarak chieved. </li><li> 15 dakika - fosfat tamponlu salin (PBS) ile yarım% 4 paraformaldehit değiştirilmesi ve 10 üzerinde bu adımı üç kez tekrarlayarak kültürleri durulayın. </li><li> Tüm PBS kaldırmak ve hücreler geçirgenliği, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, her sıra için 200 ul% 0.1 Triton X-PBS ile 100 ekleyin. </li><li> Aspirasyon Triton çözüm çıkarın ve 200 ul başına iyi engelleme tampon solüsyonu (PBS% 3-5 BSA ve% 1 keçi serumu) ekleyin. Oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe. </li><li> Engelleme tamponu çıkarın ve 1:2000 oranında sulandırılmış primer antikor, mikrotübül ilişkili protein-2 (map2) ekleyin - tampon engelleme 1:5000. 4 de bir gece boyunca oda sıcaklığında ya da ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe kültürler </li><li> Primer antikor çözeltisi kaldır, oda sıcaklığında 15 dakika zarfında üç kere PBS ile kültür yıkanır. </li><li>PBS ile seyreltilerek sekonder antikor ile birlikte inkübe kültürler karanlık oda sıcaklığında 1-2 saat için% 1 BSA ile desteklenmiş. </li><li> Sekonder antikor çözümü çıkartın ve karanlık oda sıcaklığında 10-15 dakika içinde üç kez PBS ile kültürler yıkayın. </li><li> Cam hakkında Mount lamelleri sekonder antikor tagged florokrom için uygun pH sulu montaj orta bir damla hücre tarafı aşağı kayar. Montaj orta kuruması için oda sıcaklığında bir gece slaytları tutun. 4 saklayınız slayt görüntüleme kadar ° C. </li><li> Slayt görüntüleme önce oda sıcaklığına denge sağlaması için bekletin. Epifloresans için donanımlı bir faz-kontrast mikroskopta floresan resim al. Tipik olarak, tek bir nöronun tamamı dendritik çardak bir 20X objektif ve uygun filtreler kullanılarak yakalanabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Perinatal ra SCG ayrışmış sempatik nöronlarts ve serum ve ganglionik gliyal hücreleri ve yokluğunda büyüme map2 immünopozitif süreçler (Şekil 1) uzatmak için başarısız değil, daha ziyade, tipik olarak, sadece tek bir sürecin akson 14,15 uzanır. BMP-7 (Şekil 1) ya da Matrigel maruz kalma dendritler 17,18 arasında, morfolojik biyokimyasal ve fonksiyonel kriterlere uygun sayıda süreçlerin oluşumu indüklemektedir. Matrigel veya BMP-7 birinin dendrit destekleyici aktivite konsantrasyonu ve zaman bağımlı 17,18,20 olduğunu. Maksimal dendritik büyüme 50 ve 75 mg / ml veya BMP-7 30 ve 100 arasında ng / ml ve yarı maksimal etkileri genellikle ~ 2 ng / ml, BMP-7 konsantrasyonlarda gözlenir arasındaki Matrigel konsantrasyonları kullanılarak görülmektedir. Ancak, dendritik büyüme önemli değişiklikler 300 pg / ml kadar düşük BMP-7 konsantrasyonları ile tespit edilebilir. Matrigel veya BMP-7 birine dendritik yanıt &lt;nöronların% 50 dendrit-p ya maruz kaldıktan sonra 24 saat içinde ikinci bir sürecin oluşturulması ile, nispeten yavaş<html> ajan romoting. Ancak, ilk BMP-7 maruz kaldıktan sonra 3 gün içerisinde, hemen hemen bütün nöronlar maksimum etkili Matrigel veya BMP-7 konsantrasyonları yanıt. Nöron başına Dentritlerin sayısı tedavinin ilk 10 gün içinde meydana gelen değişim çoğu, BMP-7 sürekli maruz kalma ile birlikte artmaya devam ediyor. 4 hafta sonra, BMP-7 ile tedavi edilen nöronların tipik olarak 17 ikincil, üçüncül ve hatta dörtlü dendritik dalları sergilemek 6-8 birincil dendrit vardır. Dendritik çardak bu artış, aksonal büyüme önemli bir değişiklik olmadığı ortaya çıkar ve karşılaştırılabilir dendritik yanıtları BMPs 2, 4, 5 veya 6 20,21 benzer konsantrasyonları kullanılarak elde edebilir. Dendritik büyüme de endojen ganglionik gliyal hücreleri 15,22 ile eş-kültürleme sempatik nöronlar tarafından ortaya çıkarılan olan, ancak, dendritik tepkisi, bu şartlar altında önemli derecede daha yavaştır. . Jpg &quot;/&gt; Şekil 1. BMP-7 kültürlü sempatik nöronlar dendritik büyümeyi destekler. Non-nöronal hücrelerin in vitro 2. günde 48 saat başında anti-mitotik tedavisi ile kültürler SCG çıkartılmıştır. In vitro 5. gününde başlayarak, kültürlerin 50 ng / ml (B) BMP-7 ile desteklenmiş ya denetim orta (A) ya da orta ile tedavi edildi. In vitro (BMP tedavi 5 gün sonra) günde 11, kültürler map2 karşı mAb ile boyama yapıldı, bir protein öncelikle dendrit ve nöronal somata bulundu. Gibi floresan temsil fotomikrografı de gösterildiği gibi, kontrol koşullar altında yetiştirilen nöronlar MAP-2 immünopozitif süreçler dendritlerin eksikliği (A) tarafından kanıtlandığı gibi, dendritler yoktur; aksine, nöronlar (B) tipik olarak birkaç şevli MAP-2 immünopozitif sahip BMP-7 maruz dendritler.

<ol>
	<li>Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons.">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).</li><li>Miller, J. P., Jacobs, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+neuronal+structure+and+function.">Relationships between neuronal structure and function.</a> J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).</li><li>Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+specificity+and+long-term+information+storage.">Synapse specificity and long-term information storage.</a> Neuron. 18, 339-342 (1997).</li><li>Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+year+of+the+dendrite.">The year of the dendrite.</a> Science. 275, 178-179 (1997).</li><li>Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+consequences+of+abnormal+cortical+development:+insights+into+developmental+disabilities.">Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities.</a> Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).</li><li>Connors, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+mechanisms+in+neurodevelopmental+disorders.">Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders.</a> Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).</li><li>Pardo, C. A., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+autism.">The neurobiology of autism.</a> Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).</li><li>Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+neurodevelopmental+disorders:+meeting+at+the+synapse.">Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse.</a> Science. 302, 826-830 (2003).</li><li>de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia.">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li><li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer's+disease.">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li><li>Jagadha, V., Becker, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology:+an+overview+of+Golgi+studies+in+man.">Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man.</a> Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+I.+Conditions+under+which+neurons+form+axons+but+not+dendrites.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites.</a> Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).</li><li>Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li><li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li><li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li><li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).</li><li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu model avantajları şunlardır: (a) kültürler, diğer hücre tipleri 17,23 yoksun sempatik nöronlar, homojen bir nüfusu oluşur, (b) simpatetik nöronlar büyüme faktörü gereksinimleri kullanımına olanak sağlamaktadır ki, iyi kurulmuş bulunmaktadır tanımlanan orta ve tanımlanan çeşitli medya ve yüzeyler 23 büyüyen ve sempatik nöronlar sürdürmek için iyi çalışır; (c) Bu kültürlerinde nöronlar Matrigel, BMP-7 ve DPP diğer BMP ve dendrit terfili aktivite düzgün cev...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 mm Yuvarlak Coverslip # 1 Kalınlık, Alman cam </td></tr><tr><td> Bent ucu pipetleri </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lizin </td><td> Sigma </td><td> P0899-100mg </td><td> Stok solüsyonu 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Damıtılmış su </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Hiçbir Güzel forseps Dumont. 4 ve 5 </td><td> Güzel Bilim Araçlar (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 gauge iğne </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 orta </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (-Ca, Mg-) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM Düşük glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> İnsülin / Transferrin / Selenyum </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Yağ-asitsiz BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 besleme ortamında (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Sitozin arabinozide </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Tekrarlanan donma-erime döngüleri kaçının </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc </td><td> 345-BP BMP7-07h </td><td> BMP 4, 5 ve 6 eşit yanı BMP-7 olarak çalışmak ve ticari olarak elde etmek için bazen kolay </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Balıkçı </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-sıçan antikoru map2 </td><td> Sternberg Monoclonals A.Ş. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 keçi-anti-fare </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Montaj medya </td><td> Antifade kiti Moleküler Probları Prolong </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

Dendritik çardak şekli bir nöron 1-3 alabilirsiniz toplam sinaptik girdi belirler ve türleri ve bu girişlere 4-6 dağılımı etkiler. Dendritik büyüme ve plastisite Altered desen deneysel modellerde 7 bozulmuş nörodavranışsal fonksiyonu ile ilişkilidir ve nörogelişimsel bozukluklar 8-10 ve nörodejeneratif hastalıkların 11-13 hem de görülen klinik belirtiler katkıda düşünülmektedir. Bu gözlemler kesin dendritik morfoloji düzenleyen fonksiyonel öneminin altını ve dendritik büyümesini kontrol mekanizmalarının belirlenmesi sadece normal gelişimi sırasında nasıl düzenlendiği sinirsel bağlantıda anlayışını ileriye değil, aynı zamanda çeşitli nörolojik hastalıklar için yeni tedavi stratejileri üzerinde fikir verir olabileceğini düşündürmektedir. Dendritik büyüme Mekanik çalışmalar büyük ölçüde durumu o tarafından kolaylaşırdınöronlar deneysel onlar kendi vivo nüsha ile kıyaslanabilir bir dendritik çardak detaylandırmak hangi birine dendritler uzatmak değil bir devlet değişimi yapılmasına olanak fa modeli sistemi. Perinatal kemirgenler üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış sempatik nöronların primer kültürlerinde böyle bir model oluşturacaktır. Serum ve ganglionik gliyal hücreleri yokluğunda tanımlandığı besiyerine zaman, sempatik nöronlar akson olan tek bir süreç uzanır ve bu durum unipolar kültürü 14,15 in ay hafta sürer. Bununla birlikte, kültür ortamına ya kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya 16,17 Matrigel 18 ilavesiyle dendritler için morfolojik, biyokimyasal ve fonksiyonel kriterlerini karşılamak birden çok işlem genişletmek için, bu nöronlar tetikler. Sempatik perinatal kemirgen SCG ayrışmış nöronlar ve tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen nöronların 19 homojen bir nüfus vardırMatrigel, BMP-7 ve decapentaplegic (DPP) ve 60A alt familyaya 17,18,20,21 diğer BMP ve dendrit terfili aktivite düzgün cevap verdiğini. Önemli olarak, Matrigel-ve BMP indüklenen dendrit oluşumu hayatta hücre büyümesi ya akson 17,18 değişiklik olmaksızın ortaya çıkar. Burada, biz onlar Matrigel veya BMP seçici dendrit destekleyici aktivite duyarlı böylece perinatal sıçanların SCG türetilen sempatik nöronların ayrışmış kültürleri nasıl ayarlanacağını açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons at JoVE.com

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Bu seçici perinatal sıçan üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış primer sempatik nöronlar, dendritik büyümesini teşvik etmek için kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya Matrigel kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

inducing-dendritic-growth-in-cultured-sympathetic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Görüntüleme.  University of California, Davis. Bu seçici perinatal sıçan üstün servikal gangliya (SCG) ayrışmış primer sempatik nöronlar, dendritik büyümesini teşvik etmek için kemik morfogenetik protein-7 (BMP-7) veya Matrigel kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır.

Video: Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Nörobilim

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.