Biz mali destek için Wellcome Trust ve ERC minnettarız. IMGG bir EMBO üyesidir. KLH bir BBSRC tarafından finanse edilen doktora öğrencisidir. Biz mikroskopları ile bakım ve yardım için teknik ve hücre kültürü destek ve Dr Andrew Doherty Philip Rubin ve Patrick Tidball teşekkür ederiz.

1. Hücre Kültürü, Viral Transdüksiyon ve Protein Ekspresyonu <ol><li> In vitro (DIV) içinde 14-25 gün süreyle poli-L-Lizin-kaplı cam lamelleri üzerinde embriyonik günde 18 (E18) sıçan yavru kültüre yüksek yoğunluklu hipokampal nöronlar. </li><li> 6-24 saat önce canlı deneyleri, süper ekliptik pHluorin (SEP) ile etiketlenmiş ilgi membran proteini içeren zayıflatılmış Sindbis virüs iletiminde hücreler. </li><li> Şartlandırılmış ortam 1mL içeren coverslip doğrudan psödoviriona-içeren orta ekleyin ve kültür inkübatöre geri. Viral iletimi sonrasında protein ekspresyonu için titre ve zaman virüs toplu bağlı olarak değişir ve önceden canlı hücre deneyler başlamadan her parti için belirlenmelidir. </li></ol> 2. FRAP-FLIP Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> Ekipman set-up <ol><li> Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokal mikroskop görüntüleme odasına coverslip aktarın.Görüntüleme sırasında güç dalgalanmaları en aza indirmek için, mikroskop görüntüleme önce en az 20 dakika,% 100 lazer çıkışı ile açıldıktan sağlamak. </li><li> Derhal, önceden ısıtılmış ile kültür ortamı yerini (37 ° C) 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.5 mM CaCI2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH değerine ayarlanır içeren hücre dışı kayıt solüsyonu NaOH ile 7.4 &#39;) ve Zeiss Axiovert arasında önceden ısıtılmış aşama (37 ° C) üzerine haznesi yerleştirin. Ekstraselüler kayıt çözeltisi osmolarite da kültür ortamı içinde 10 mOsm sağlamak üzere ayarlanmaktadır. Anlamlı buharlaşma deney timecourse sırasında oluşur kaydıyla, bu CO 2 bağımsız çözüm kısa deneyleri (&lt;10 saat) için uygundur. 1-2 mM sodyum bikarbonat ile ilave tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Görüntü yakalama parametreleri tanımlama <ol><li> İlk olarak, rekombinant pro ifade Bir nöron tanımlamakilgi protein ve de odak noktası haline getirmek. </li><li> Bir 63X yağ itiraz, düşük güçte lazer 488nm lazer ışığı uyarım kullanarak tüm hücre bir görüntü kazanır. Photobleaching en aza indirmek için, toplam tarama hızı &lt;1 saniye tutarak hızlı bir nominal hızının (7-9) ve düşük piksel çözünürlüğü (512-512) kullanın. </li><li> ROI (~ 1.5-2.5 x optik zoom) içeren bir çerçeve yakalamak için resim ve yakınlaşma için dendrit bir kısmını seçin. Mümkün olan yerlerde, spesifik olmayan nedeniyle kazanım oluştuğu için photobleaching olup olmadığını belirlemek üzere, referans dendritler gelen ölçümler elde edilebilir, böylece görüş alanını içeren çeşitli işlemler sağlar. </li><li> Filtreleri, iğne deliği, tarama hızı ve minimal lazer uyarılma ile ancak sınırlı doygunluğu ile maksimum floresans dedektör kazanç sağlamak için ayarlayın. Büyük bir iğne deliği çapı (2μm dikenleri ve üçlü dendritler için uygundur) foton toplama maksimize etmek, tavsiye edilir. Dedektörü kazanç, küçük floresans artışlarla algılayacak kadar güçlü olmalıdırphotobleaching önce ilk görüntüleri, doymuş piksel% 10 üstesinden olmadığı gibi. </li><li> Önceden / post-ağartıcı ve deney geri kazanım aşamaları için kullanılmak üzere bu yapılandırma kaydedin. </li><li> Sonraki photobleach bölgelerin tanımlanması; sonraki tekrarlanan photobleaching aşaması için ilk photobleach ve komşu bölgeleri için bir yatırım getirisi seçerek. Komşu bölgeleri tarama (genellikle 5 mikron, bkz. 2) arasındaki difüzyon ile kurtarma önlemek için yeterince geniş olduğundan emin olun. </li><li> Photobleach İB&#39;leri hem çamaşır suyu parametreleri ayarlayın. İlk photobleach optik yakınlaştırma ve ROI hacmine bağlı olarak, 1-5 yinelemeler arasında gerektiren hızlı (0.1-0.5 sn) olmalıdır. Taarruzcu bölgeleri için, lazer eksitasyon taarruzcu bölgelerin sürekli photobleaching sağlamak için ayarlanabilir ancak fototoksik zarar vermeden edilmelidir. </li><li> Bir kılavuz olarak, tekrarlayan photobleaching ph% 100 lazer ilk photobleach için uyarma ve% 10 kullanınase. </li></ol></li><li> Görüntü edinimi <ol><li> Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, aşağıda 4 blok belirtilen bir değişken zaman aralıklı görüntü sırası olarak FRAP-FLIP deneyi gerçekleştirmek: BLOK 1: 3-10 önceden çamaşır suyu bazal görüntüleri, düşük lazer gücü de, hiçbir zaman gecikmesi BLOK 2: Photobleach tam lazer güçte santral yatırım getirisi, 1-5 yineleme BLOK 3: 3-10 post-ağartıcı kurtarma görüntüleri 4 BLOK: 1 tipik bir zaman aralığında görüntü yakalama ile orta güçte lazer bölgeleri kuşatan tekrarlayan photobleach - 5 saniye, soruşturma altında protein toparlanma hızına bağlı. </li><li> Sonuç olarak, 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 15mm glükoz, 1.5 mM CaCI2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM MES (floresans gidermek için) ya da 50 mM ile tamamlanır içeren PH6 azından tamponlu kayıt çözeltisi ile hücre dışı kayıt çözeltisi yerine NH4Cl 90 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glükoz, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM içerenMgCl2, 20-25 mM HEPES, pH7.4 (düşük pH intraselüler mağazalarda proteinleri ortaya çıkarmak için), (bakınız Şek. 2). </li><li> Istatistiksel analiz sağlamak için, her rekombinant protein için en az 10 ila 20 veri setleri toplayın. Önyargı sonuçları önlemek için, emin görüntüleme koşulları çoğaltır tutarlı korunur. Herhangi bir veri eksik ağartma, önemli bir odak düzlemi sürüklenme veya fototoksik hücre hasarı görülür kümeleri atın. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> ImageJ yazılımı ile görüntüleri açın. </li><li> Stackreg eklenti (eklentiler → stackreg → dönüşümü ile zaman serisi boyunca oluşmuş olabilir xy düzleminde küçük dalgalanmaları hesaba yığınları Hizala: katı cisim → <ok> ). </ok></li><li> Zeiss konfokal çekilen görüntüler için, bir metin dosyası olarak zaman değerleri (eklentiler → EKK Araç → göster EKK Toolbox rapor etmek EKK Araç eklenti kullanmak → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> )ve bir analiz elektronik tabloya bu değerleri aktarmak. </apply></apply></li><li> FRAP-FLIP deney sırasında floresans dalgalanmaları ölçmek için, bireysel piksel bölgeler (~ 20pixels) içine photobleached kesimi bölmek ve her zaman noktası (F) bu İB&#39;nin ortalama floresan ölçmek. Hızlı bir şekilde bu değerleri elde etmek için, ImageJ YG&#39;ni Yöneticisi &#39;analiz aracı (→ Araçlar → YG Müdürü Analiz) kullanarak birden İB&#39;leri seçin ve&#39; Arsa Z ekseni profili &#39;komutu (kullanarak piksel başına ortalama floresan rapor Görüntü → Yığınları → Arsa Z eksen profil). </li><li> Bir arka plan, olmayan floresan bölgenin floresan yoğunluğu ölçmek için bu adımı yineleyin. </li><li> Deneysel gürültü çıkarmak ve ortalama öncesi ağartılmış temel ölçü bütün değerleri bölmek için plan değerleri çıkarılarak her noktada floresan Normale. </li><li> Spesifik olmayan düzeyini değerlendirmek için bitişik olmayan photobleached dendritlerin floresan ölçünedinimi sırasında photobleaching. Non-spesifik photobleaching için düzeltme &#39;FRAP-FLIP&#39; verilerin yorumlanması için tavsiye edilmez ve mümkün olduğu kaçınılmalıdır. </li><li> Belirgin bir iyileşme ROI yer almıştır eğer hesaplamak için, ilk 5-10 önlemler (mesafe kadar taşınmış) ortalama gelen dizinin son 5-10 önlemlerin ortalama çıkarma ve istatistiksel anlamlılık belirler. Ekzositoz paterni (yani ekzositoz noktaları veya omurga vs mili kurtarma) değerlendirmek için kurtarma ve sivil kurtarma İB&#39;leri sınıflandırır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Tipik FRAP-FLIP deneyinin sonuçları Şek. 2. Burada, Eylül ile etiketlenmiş AMPA tipi glutamat reseptörü, bir alt birim GluA2 ifade Bir nöron seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached edilmiştir. Şekil 2.A görüntülendi ve (beyaz kutu bölgeleri) photobleaching için seçilmiştir İB&#39;leri işaret edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir. Şekil 2.B, deney süresi boyunca ölçülen ROI olarak floresans yoğunluğunu göstermektedir. Bu örnekte, bir dakika süre geri kazanım ağartılmamış reseptörleri yanal difüzyonu yoluyla ROI girmesine izin vermek için ilk photobleach sonra kaydedilmiştir. Komşu bölgeleri photobleached zaman, reseptörler bu son derece hareketli fraksiyonu floresans sinyal merkezi bölgeden tıkalı olup, bölge içinde olanlar dışarı seyreltilir. &#39;FLIP&#39; dizisi içinde gözlenen floresans (mesafe kadar taşınmış) artış dolayısıyla dendritik mili SEP-GluA2 yerleştirilmesi atfedilebilir. Düşük pH yıkama ve pH 7.4 &#39;+ NH4Cl Ayrıca, sırasıyla ölçülen floresans yüzeyi elde edilir teyitÖlçülen ROI içinde hücre içi, sekestre proteinlerin oranı proteinleri ve ortaya koymaktadır. FRAP aksine, bu metodoloji photobleached bölgede floresans iyileşme bir büyük ölçüde azaltılmış seviyesi ile sonuçlanan, nedeniyle ekzositoz için geri kazanım izole eder. Güvenilir bir matematiksel model Bugüne kadar uygun ve kurtarma bu seçici beyazlatma tekniği kullanılarak kaydedilen izleri analiz etmek için geliştirilmiştir. Bir mono üstel kurtarma ile kurtarma iz sığdırmak için, ancak mümkündür: F (t) = A s - A 0 e (-t / τ) F (t) t zamanında floresans olduğunda, A s, kararlı bir değerdir A 0 0 zamanında offset, τ sabit zamanı. Kurtarma büyüme ekleme ve difüzyon arasındaki istikrarlı bir duruma tekabül bir dengeye ulaşmak için belirli bir oranı ile sabittir. Önemli olarak, zaman sabiti bu ekstrakteANALİZ ekzositoz sabiti zaman yansıtmıyor ve yalnızca tek bir protein için karşılaştırmalı tedavisi için de kullanılabilir. Dahası, floresans iyileşme beklenen desen photobleached bölge boyunca alt etki gözlenmiştir olasıdır. Bir photobleached segmenti içindeki küçük ROI analizi ekzositoz &quot;noktaları&quot; ortaya çıkarmak için gerekli olabileceği ve bu hesaplanan oranı etkileyecek dendrit arasında bu lekelerin yoğunluğu değişkenliği gibi karşılaştırılabilir uzunlukları bölgeleri analiz etmek önerilir. Şekil 3, görüş alanı içinde birden çok dendritler ile büyük bölümü Getirisini photobleach uygulayarak Bu protokolün bir uzantısı gösterir, sadece tek bir dendrit ağartma seçici tekrarlanan izledi. Bu yaklaşım geleneksel &#39;FRAP&#39; ve paralel olarak elde edilecek &#39;FRAP-FLIP&#39; veri sağlar. Bu örnekte, hipokampal nöronlar kainat sınıfının bir glutamat reseptör subunit ile enfekte olmuştur; GluK2 SEP-etiketli. Priogörüntüleme için r, bu nöronlar-edildi protein sentezini bloke etmek cylcohexamide (200μg/ml az 2 saat) ile muamele edilir. Ilgili ölçülen İB&#39;leri (Şekil 3.B) böyle, floresan kurtarma &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü maruz dendrit yalnız standart FRAP dendrit karşı geri dönüşüm lateral difüzyon ve geri dönüşüm nedeniyle iyileşme oranı görüldüğü gibi. FRAP karşı &#39;FRAP-FLIP&#39; kurtarma eğrileri, geri dönüşüm göreli katkıları (mesafe kadar taşınmış rec = 11.05%) ve (mesafe kadar taşınmış fark =% 9.35) difüzyon lateralden mesafe kadar taşınmış değerleri karşılaştırarak varılabilir. Şekil 2 aksine, kurtarma protein sentezinin inhibisyonuna bağlı olarak istikrarlı bir devlet düzeyinde değil, korumak değildir, gösterir kullanılabilir reseptör havuzu (gözlenen yaklaşık% 20 düşüş tükenmesi için geçici bir artış ve buna karşılık gelen, sinyal açılan kapatma sonraki kayıt dönemi boyunca). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Şekil 1. Bu şematik SEP-tagged reseptörleri kullanarak, bir &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü karşı düzenli FRAP sonuçlarını göstermektedir FRAP vs FRAP-FLIP protokol müdürleri şematik. Geleneksel FRAP floresans kurtarma sol tarafta gösterilir. Merkez ROI ölçülen floresan kurtarma, geri dönüşüm ve / veya dendritik mile de novo ekzositoz yoluyla photobleached YG ve reseptörlerinin ekleme dışından yanal difüzyon f olmayan photobleached EYL-etiketli reseptörlerinin bir arada atfedilir. Buna karşılık, sağ tarafta gösterildiği kuşatan İB&#39;nin tekrarlayan photobleached gösterir nasıl yanal difüzyon nedeniyle bu modifiye &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü sessizlikleri kurtarma. Bunun gibi, herhangi bir ölçülen floresan kurtarma ROI doğrudan ekleme atfedilebilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Şekil 2.Dendritik mil üzerinde plazma zarı içine SEP-GluA2 yerleştirilmesi A) SEP-GluA2 dile getiren bir hipokampal nöron, seçici dendrit bir bölge boyunca photobleached. Sol üst paneli photobleaching için seçilmiştir İB&#39;leri vurgular ederken şematik, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. Büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanan yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel photobleaching öncesinde dendrit gösterir. Kırmızı ok alt paneller yüksek büyütme gösterilen ölçülen yatırım getirisini gösterir. B) Deney süresi boyunca ölçülen yatırım getirisi ile floresans şiddeti, ROI gri düzeyi (normalize değil) olarak çizilmiştir gösterir. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış inci gösterirdendritik mile SEP-GluA2 yerleştirilmesi nedeniyle kurtarma dönemde gözlenen floresans e artış. Müteakip düşük pH ve pH 7.4 + NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Şekil 3. Cyclohexamide tedaviyi takiben dendritik şaft üzerinde Geri Dönüşüm ve SEP-GluK2 lateral difüzyon vs Geri Dönüşüm A) hipokampal nöron paralel FRAP ve ayrı dendritik İB&#39;leri birlikte gerçekleştirilen &#39;FRAP-FLIP&#39; kurtarma protokolleri ile seçici photobleached SEP-GluK2, ifade. Bu nöron protein sentezi (200 mg / ml az 2 saat) engellemek için cyclohexamide ile ön tabi oldu. Şematik sol paneli photobleaching için seçilmiştir İB&#39;leri vurgulayarak, görüntülenmiştir edilmiştir dendrit bölgesini göstermektedir. The büyük beyaz kutulu alan çift başlı mavi oklar ile vurgulanır alt dendrit sadece bir yan kutulu bölgeler, ağartma tekrarlanan ardından, bir kez beyazlatılmış edildi. Bu panel öncesinde photobleaching için dendritler gösterir. Kırmızı oklar &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü karşı geleneksel FRAP içinde floresans toparlanma gösteren B yüksek büyütme gösterilen ROI) vurgulayın. Iyileşme geç evre (üçüncü panelleri) floresans şiddet seviyelerinde Karşılaştırmalar yalnız geri dönüşüm karşı yanal difüzyon ve geri dönüşüm katkısını göstermektedir. C) Deney süresi boyunca ölçülen İB&#39;leri içinde floresans yoğunluğu, şiddeti normalize olarak çizilmiştir gösterir değerleri. Siyah ok ilk photobleach ve yeşil ok timepoint vurgulamak tekrarlayan photobleaching başlangıcını belirtir. Mesafe kadar taşınmış rec FRAP / FLIP dendrit tespit reseptör geri dönüşüm nedeniyle geçici iyileşme gösterir iken mesafe kadar taşınmışdiff &#39;FRAP sadece&#39; yatırım getirisi ile dendritik mile SEP-GluK2 lateral difüzyon katkısını ölçer. Geçici bir artışa cyclohexamide tedavisi bir sonucu olarak kullanılabilir reseptörlerinin çalıştırma aşağıya karşılık gelen sinyal kademeli azalma, takip eder. Sonraki düşük pH ve pH 7.4 + NH4CI yıkar kurtarılan floresans ifade reseptörleri yüzey ile ilgilidir onaylayın.

<ol>
	<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It's+green+outside:+tracking+cell+surface+proteins+with+pH-sensitive+GFP.">It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP.</a> Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).</li><li>Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+recovery+and+anisotropy+decay+of+green+fluorescent+protein+GFP-S65T+in+solution+and+cells:+cytoplasmic+viscosity+probed+by+green+fluorescent+protein+translational+and+rotational+diffusion.">Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion.</a> Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li><li>Ashby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).</li><li>Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-activity-modifying+proteins+are+required+for+forward+trafficking+of+the+calcium-sensing+receptor+to+the+plasma+membrane.">Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).</li><li>Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+drives+constitutive+exchange+of+AMPA+receptors+at+dendritic+spines+and+is+regulated+by+spine+morphology.">Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology.</a> J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).</li><li>Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+kainate+receptor+surface+expression+in+hippocampal+neurons.">Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons.</a> J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+membrane+drift+recruits+AMPA+receptors+to+dendritic+spines.">Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines.</a> J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz plazma membran proteini ticareti bileşenleri görselleştirmek için yenilikçi bir strateji tanımlamak. SEP-etiketli protein ile teknikleri photobleaching of Kombinatoryal yaklaşım plazma zarı ekleme olaylar değerlendirilmelidir seçici sağlar. Sürekli iyileşme sırasında bölgelere komşu olan membran proteinleri photobleaching olarak, &#39;FRAP-FLIP&#39; yöntemi floresans kurtarma veziküler ticareti katkısını değerlendirir. Bu yeni yaklaşım belirlenecek kararlı durumda iyileşme gözlenir alt-bölme sayısı ve kurtarma (mesafe kadar taşınmış) genliği sağlayan proteinin membran ekleme doğrudan kayıt sağlar. Ayrıca, FLIP olan ve olmayan FRAP karşılaştırılması hesaplanacak yanal difüzyon kurtarma oranını atfedilebilir sağlar. Dahası, aynı deney, taarruzcu photobleached bölgeleri bitişik olmayan photobleached dendrit bölgeleri olabilirniteliksel kurtarma sırasında değerlendirilir; bu bölgelerde gözlenen floresans kaybı dendrit bu non-photobleached segmente photobleached reseptörlerinin yanal difüzyon nedeniyle olacak. Bu seçici photobleaching protokolü gibi (örneğin, dendritler ya omurga) veya paralel FRAP yaparak yanal difüzyon vs yerleştirilmesi katkı değerlendirilmesi ve &#39;FRAP tanımlandığı subareas plazma membranında excocytosis karakterize olarak hücresel ticareti işlemlerin çeşitli araştırmak için yararlanılabilir bitişik dendritler boyunca-FLIP &#39;protokolleri (Şekil 3). Özel yönergeler sunulmuştur ise Açıkçası, her laboratuar spesifik örnekler ve ekipmanları göre görüntüleme parametrelerini optimize gerekir. Önemlisi, ROI tüm yüzey reseptörleri, photobleached z ekseni odak düzlemli bağımsız, fakat önemli fototoksik hasar veya spesifik olmayan photobleaching olmadan gerekir. BizeHücre soma bu protokol çalışırken ers nispeten düşük pH içi genellikle bölümlerinde bu bölgelerde yüksek eşiğe sonuçları yüksek yüzdesi olarak, dikkatli olmalıdırlar. Ayrıca, önceden üzerinde seçici bir photobleaching deney başlamadan, şekillerde değişir bu teknikte uygulanabilir nasıl göstermiştir iken, yeni bir Eylül-etiketli yapı, bu reseptörler etiketlenmiş bir başlangıç ​​karakterizasyonu birinci Ashby ve arkadaşları tarafından açıklanan şekilde, biçimde ifa edildiği hususu tavsiye 2. Genel olarak, bu yöntem yakın gerçek zamanlı olarak değerlendirilmek üzere plazma membranında ekleme olaylar sağlayan, standart FRAP protokol güçlü ve çok yönlü bir uyarlamasıdır.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktifin&gt; Adı</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar (isteğe bağlı)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm cam lamelleri</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-Lizin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<tdKat lamelleri için borat tampon&gt; 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Orta</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2 nöronal kaplama konusunda% ve orta beslenme</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penisilin Streptomisin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1 nöronal kaplama konusunda% ve besleme orta</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutamine</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<tdOrta kaplama / beslenmesinde&gt; 2mm / 0.8mm</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; At Serum</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<tdNöronal kaplama medya&gt;% 10 sadece</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 klonlama vektörü</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Sindbis virüs üretimi için</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META konfokal sistemi</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Görüntü J Yazılım</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Açık erişim yazılımı. Burada açıklanan tüm eklentileri temin edilebilir<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"Bu reseptörler ve iyon kanalları gibi&gt; Zar proteinleri son derece kutuplaşmış ve morfolojik karmaşık nöron, aktif kaçakçılığı uğrarlar. Bu yönettiği kaçakçılığı, teslim korumak veya sinaptik proteinlerin kaldırmak için temel önem taşımaktadır.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Süper ekliptik pHluorin (SEP) oranda plazma membran proteinlerinin canlı hücre görüntüleme beri kullanılmaktadır EGFP bir pH-duyarlı türevidir<sup&gt; 1-2</sup&gt;. Düşük pH&#39;da SEP&#39;in protonasyon foton emilimini azaltır ve floresans emisyon ortadan kaldırır. Çoğu hücre içi kaçakçılığı olayları Eylül floresans tutulduğu olduğunu düşük pH, SEP-etiketli proteinlerin floresans sinyali ile bölümlerinde meydana geldiğinde SEP nötr pH ekstrasellüler ortama maruz plazma membranından ağırlıklı olarak. Yüksek yoğunluklu Eylül az aydınlatılmış zaman, her floresan boya gibi (photobleached) geri dönüşümsüz fotoyaşlanma olduğunu<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Önemlisi, düşük pH foton emilimi doyurur, çünkü sadece yüzey intrasellüler SEP, yüksek yoğunluklu aydınlatma etkilenmez ise Eylül photobleached edilebilir ifade<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"SEP-etiketli proteinlerin&gt; FRAP (photobleaching sonra floresans kurtarma) plazma membran proteini dinamikleri değerlendirmek için kullanışlı ve güçlü bir tekniktir. Floresan etiketli proteinlerin ilgi bir bölgede photobleached zaman (ROI) floresans kurtarma ağartılmış bölgeye ağartılmamış SEP-etiketli proteinlerin hareketi nedeniyle oluşur. Bu, her iki tarafından sağlanan non-photobleached reseptörlerinin ekzositoz gelen yanal difüzyon ve / veya yoluyla meydana gelebilir<em&gt; De novo</em&gt; Sentezi veya geri dönüşüm (bkz. Şekil. 1). Hareketsiz ve hareketli protein fraksiyonu tespit edilebilir ve difüze fraksiyonun hareketlilik ve kinetik Böyle agonist uygulama ya da bu tür NMDA ya KCl uygulama olarak nöronal aktivasyon uyaran olarak bazal koşullar altında ve uyarılmış sorgulanabilir<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz seçici ekzositoz atfedilebilecek floresans kurtarma görselleştirmek için tasarlanmıştır photobleaching teknikleri anlatıyoruz. Kısaca, bir yatırım getirisi komşu bölgeleri ağartma tekrarlayan tarafından, kısa bir kurtarma sonra, takip, standart FRAP protokolleri ile bir kez photobleached edilir. Bizim laboratuarımızda geliştirilen bu &#39;FRAP-FLIP&#39; protokolü, dendritik dikenler de AMPA reseptör ticareti karakterize için kullanılmıştır<sup&gt; 10</sup&gt; Ve intraselüler ticareti ve ekzositoz değerlendirmek için ticareti çalışmaları, geniş bir aralık için de geçerlidir.</p

Watch this Scientific Journal Video about Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching at JoVE.co

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

82.9K Görüntüleme.  University of Bristol. Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Video: Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Nörobilim

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Kültür sempatik nöronlar bulunan dendritik Büyüme indükleyen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Süreksiz Sukroz Degrade&#39;yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...