Bu çalışma Körlük ve Sağlık hibe EY10542 National Institutes Önleme Araştırma tarafından finanse edildi.

1. Retina Dilimleri hazırlanması <ol><li> Bölme (tasarım Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi) birleştirin. Yeri vakum gres iki boncuk, superfusate için bir kanal oluşturmak ve retina dilimleri gömmek için hangi kayıt odasına genelinde ayrı aralıklı ~ 8-10 mm,. Bir kabul töreni ve sınır yayılma olarak hareket için birkaç milimetre uzak dışarı yağ bu iki boncuk her ötesinde gres ikinci bir boncuk ekleyin. Referans elektrot ile sıvı teması sağlamak için odasının sonunda Kimwipe küçük üçgen bir parçası yerleştirin. </li><li> Vakum gres iki küçük boncuk içine cam mikroskop lamı karşı düz; nitroselüloz membran (0.8 mikron gözenekleri ~ 5 x 10 mm) bir parça basın. Bu yapışmasını retina engelleyebilir kaçının, nitroselüloz membran merkezinde hemen altında yağ koyarak. </li><li> Doku dilimleme makinesi hazırlamak için, 4 adet bir çift kenar jilet kırmak ve dilimleme koluna bir takın. Nitrocellul ince bir dilimose membran jilet kesme kenarı kayıt odasına karşı düz durduğundan ve bu nedenle nitroselüloz zarından temiz keser sağlamak için. </li><li> Diseksiyon istasyonunda buz üzerinde amfibi serum fizyolojik (Tablo 1) küçük bir beher tutun. </li><li> Dekapitasyon tarafından semender Euthanize. Omurilik yoluyla sagitally baş ve öz Hemisect. Pamuk parçası üzerinde kafa yerine yarım muşamba blok üstünde amfibi tuzlu su ile nemlendirilmiş. Başın diğer yarısı gün içinde daha sonra kullanım için nemli bir kağıt havlu ile sarılmış ve 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Göz tanıttılar. Küçük Vannas makas kullanarak, çevresindeki yörünge için göz bağlayan cilt kesti. Çevreleyen yörünge dokudan gözün ön serbest bıraktıktan sonra, yörüngesinden göz kurtararak, göz kasları ve optik sinir kesmek için göz altında makas ileri göz çekin ve kaydırın. </li><li> Pamuk bir yatakta enüklee göz yerleştirinmuşamba blok. Yarım kafa atın. Gözün arkasından aşırı yörünge yağ kesin. </li><li> Keskin bir cerrahi bıçak ile kornea merkezinde küçük bir kesi yapmak. Kesi içine mükemmel Vannas makas sürgülü ve ora serrata doğru radyal kesme dışarı uzatarak kornea çıkarın. Muşamba blok veya kesim arasındaki pamuk çevirerek ora serrata çevresel olarak kesin. </li><li> Göz çevresindeki tüm yol kestikten sonra, Göz yuvası yan dışına çekerek kornea ve lens çıkarın. Muşamba blok sert bir yüzeye çıkan Göz yuvası hareket amfibi serum fizyolojik ile nemlendirilmiş. Eğer sklera üzerinden tüm yol kestik sağlamak için iyi bir kesme hareketi kullanarak, keskin bir jilet ile üçte içine kesti. </li><li> Retina yüzeyi ile nitroselüloz membran üzerinde Göz yuvası yerine bir veya iki adet aşağı bakacak. Daldırın olmayan ilave tuz çözeltisi ile birlikte geri kalan parçaları ve ~ 4 ° C de buzdolabına koyun </li><li> Gently ince forseps ile nitroselüloz membran karşı Vizör adaptör parçası basın. Retina uymak için KimWipe ile kenarları soğuk amfibi tuzlu ve leke birkaç damla ile Batmak nitroselüloz membran ve Göz yuvası parçası. Soğuk amfibi serum fizyolojik ve sıyırın (nedeniyle ağartılmamış rodopsin varlığı pembe görünebilir olan) retina izole etmek için sklera / koroid / retina pigment epiteli birkaç damla ile bir kez daha, daldırın Göz yuvası ve nitroselüloz membran. Gerekirse retinaya boşaltmak için optik sinir kesilmiş. </li><li> Retina sıkıca yapışık değilse, nitroselüloz membran üzerine daha sıkıca retina çekmek için bir KimWipe ile tuzlu akıtmak. Tuzlu değiştirin. Gerekirse, tekrar edin. </li><li> Soğuk amfibi tuzlu su ile oda doldurun ve doku dilimleme makinesi aşamasına aktarın. Sürmeli mikrometre çevirerek bir uçtan diğer uca çalışan, ince şeritler halinde retina ve nitroselüloz membran dilim125 mikron artışlarla. Yavaşça ama sıkıca retina ve nitroselüloz zarından jilet basın. </li><li> Kayıt odasının ana kanala nitroselüloz membran şeritler hareket ettirerek retina dilimleri aktarın. Ücretsiz membran bir şerit kaldırın ve sonra dilim su altında tutmak için emin olmak, altındaki odasına taşırken bir yerde tutun. Retina katmanları görmek için onları 90 derece döner, vakum yağ şeritler nitroselüloz membran kenarları embed. </li><li> Cam yüzey karşı nitroselüloz membran düz basın. Her parça retina var olmasa bile, yüzey gerilimi kırmak yardımcı ve sıvı akışını geliştirmek için perfüzyon kanalın tüm uzunluğu boyunca düzenli aralıklarla (ayrı ~ 1 mm) nitroselüloz membran yerine şeritler. </li></ol> 2. Eşli tam hücreli Kayıtlar <ol><li> Dilim tüm aktarıldıktan sonra, sabit, dik aşamasına kayıt odasına taşıyınaşamasında mikroskop ve referans elektrot kurşun takın. Uzun çalışma mesafesi, su altında, 40-60X objektif kullanarak dilimleri odaklanın. Mikroskop titreşimleri engellemek için bir hava masaya yerleştirilir ve elektrik paraziti azaltmak için bir Faraday kafesi içine alınmalıdır. </li><li> % 100 O2 ile kabarmış amfibi tuzlu su çözeltisi ile 1 ml / dak &#39;lık bir hızla sürekli dilim Superfuse. Giriş ve çıkış dengeli olduğundan emin olarak, emme bağlayın. Çıkış emme iğnenin kesik sonuna döndürerek ya da yakın veya uzakta çıkış iğne odasının sonunda KimWipe hareket ile kontrol edilebilir. Hazırlık, oda sıcaklığında ya da muhafaza bir Peltier cihazı ile ya da sadece mikroskop aşamasında bir buz torbası ayarlayarak soğutulabilir. </li><li> Loş veya kızıl-ötesi ışık altında dilimleri inceleyin ve hücrelerin bir çift tanımlamak - tam hücreli kayıt için hedef için - bir fotoreseptör (çubuk veya koni) ve yakın yatay veya bipolar hücre. Çubuklar i olabilironların büyük hücre gövdeleri ve belirgin çubuk benzeri dış kesimleri (Şekil 2A) tarafından dentified. Koniler çubuklar daha küçüktür ve küçük konik dış segmentleri var. Bipolar hücre ve yatay hücre somas iç nükleer tabakada hücre gövdeleri en dış satır (; Şekil 2B ve 2C INL) bulunmaktadır. </li><li> Dilimleri hazırlamadan önce, borosilikat cam (1.2 mm dış çapı, bir cam elyaf ile 0.95 mm iç çapı) den mikropipetler üretimi için bir pipet çektirmenin kullanın. Her mikropipet ucu çapı ~ 1-2 mikron olmalıdır. </li><li> Metal olmayan bir doldurma iğnesi (örneğin, bir 1 cc şırınga ya da bir MICROFIL imal) kullanarak, hücre içi çözelti (Tablo 1) ile pipetler girip elektrot tutucu bağlanırlar. </li><li> Biraz mikroskop objektif yükseltmek. Amaç altında fotoreseptör pipet yerleştirin ve daha sonra ucu sadece dilimleri üzerinde pozisyonlanır, böylece daha düşük. T tekrarlayıno ikinci pipet. </li><li> Amplifikatör temel mevcut düzeyde ofset herhangi bir ayarlayın. 5-10 mV depolarizan darbe ile pipet direnci kontrol edin. Biz genellikle pipet kullanın MQ 10-15 arasında değişen, şaft ve amfibi pipet çözümleri düşük osmolaritesi uzun konik sonucu. Yüksek osmolaritesi memeli çözümleri ile, bu aynı pipet MQ ~ 8-12 direnci değerleri göstermelidir. Biz 3-4 MQ amfibi çözümlerinde direnci değerleri ile büyük ucu çapları kullanmış olsa da, daha düşük bir erişim direnç sağladığı avantajlar hücre zarları üzerine sızdırmazlık daha büyük bir zorluk ve kalsiyum akımları ve diğer ikincil haberci daha hızlı bir özet ile mahsup edilir duyarlı tepkilerine neden olur. </li><li> Hafif pozitif basınç, pozisyon post-sinaptik pipet uygularken temas yatay veya bipolar hücre vücut o kadar. Daha sonra presinaptik pipet yerleştirmek temas bir çubuk veya koni fotoreseptör ve hücre gövdesi o kadar. Kayıtlar Appepipet uçları yerine soma daha iç kesimi başvurduğunuzda ar özellikle koniler, daha istikrarlı olmak. </li><li> Direncini izlerken, post-sinaptik pipet üzerinde pozitif basınç bırakın. Bazı durumlarda, pozitif basınç serbest gigaohm bir sızdırmazlık oluşturmak için yeterlidir. Aksi takdirde, bir 1 ml şırınga ile veya ağız yoluyla negatif basınç uygulayın. Ucu direnci M&gt; 100 büyüdü sonra, -60 mV bir holding potansiyeli geçerlidir. Bir gigaohm mühür elde ettikten sonra, herhangi bir pipet kapasitans geçici dışarı boş ve -70 mV bir holding potansiyel uygulayarak, fotoreseptör pipet için sızdırmazlık işlemi tekrarlayın. </li><li> ACL ağzınıza veya sırayla her hücreye emme uygulamak için bir şırınga kullanarak düzeltme eki. Çubuklar, koni ve bipolar hücreleri hafif bir emme ile kopma tipik olacak. Yatay bir hücre ile tam hücre konfigürasyonu elde &quot;zap&quot; F ile birlikte güçlü bir pratik voltaj darbeleri ile kombinasyon halinde yüksek emiş gücü (örneğin, 3 cc şırınga yani) gerektirebiliryama kelepçe amplifikatör eature. Tam hücreli yapılandırma membran ve kuruluş ACL tam hücreli kapasite geçici bir görünümünü belli olacak. </li><li> Hafif flaş uygulayarak ve 20 mV artışlarla (Şekil 3 ve 4) -120 ile +40 mV gerilim bir dizi adım sunarak fizyolojik post-sinaptik hücrenin kimliklerini doğrular. </li><li> Hücrelerin çift synaptically bağlıysanız, fotoreseptör kısa bir (25-100 msn), 60 mV adım depolarizasyon teslim (-10 mV, L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum akımının tepe yakın) ve görünüm değerlendirmek ikinci dereceden nöron sonrası sinaptik akımları (Şekil 5). Güçlü bir depolarize adım konisi (Şekil 5) vezikül serbest bir patlama neden post-sinaptik yatay ya da kapalı bipolar hücre hızlı bir, geçici içe post-sinaptik akım uyandırmak gerekir. </li></ol>

<ol>
	<li>Ram&#242;n y Cajal, S., Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Structure of the Retina. , (1972).</li><li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+and+the+retina:+a+100-year+retrospective.">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li><li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina.">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li><li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina.">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina.">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li><li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses.">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li><li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+synaptic+ribbons:+how+they+are+built+and+what+they+do.">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li><li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1:+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li><li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse.">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li><li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).</li><li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation.">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina.">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina:+general+principles+and+species-specific+variations:+the+Friedenwald+lecture.">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li><li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina.">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li><li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors.">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li><li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells:+current+vs.+voltage.">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li><li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors.">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li><li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization.">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li><li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation.">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Retina dilim hazırlık devresi ve görsel bilgi işlem için retina tarafından istihdam mekanizmaları analiz için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Öncesi ve sonrası-sinaptik nöron aynı anda tüm hücre kayıtları elde etmek için yeteneği bu çaba içinde özellikle yardımcı olmuştur. Farklı retina katmanları maruz çünkü eşleştirilmiş tüm hücre kayıtları düz montaj retina hazırlıkları ile daha dilimleri elde etmek çok daha kolaydır. Ayrıca, çünkü onların büyük retina nöron, semender bir retina hazırlık olarak uzun bir geçmişi var ve bu nedenle özellikle well-karakterize model sistem sağlar. Uygulama ile, semender retinanın sağlıklı dilim düzenli olarak hazırlanabilir. Birkaç önemli adımlar başarı ve başarısızlık arasındaki fark yaratabilir. 1) bu temiz cam yüzey ve dilim karşı düz bırakır böylece jilet doku dilimleme makinesi monte emin olun rağmen doku ve underlyi hemng nitroselüloz zar. Eğer nitroselüloz zarından temiz bir kesim yaptıysanız, jilet cam slayt yüzeyi vurur gibi, bir soluk klik sesi duyacaksınız. 2), retina nitroselüloz zarına yapışmış olan emin olun. Aksi takdirde, retina işlemlerin herhangi bir adım sırasında membran uzak yüzebilirler. 3) Bu yüzeysel hücrelerin çok zarar verir gibi, havaya kesme dilim maruz bırakmayın. 4) retina katmanları mikroskop altında belirgin şekilde dilimleri ve nitroselüloz membran cam slayt karşı düz yalan emin olun. 5) kayıt odasına taşan önlemek için superfusate giriş ve çıkış oranları Dengesi. Bu ani doku hareketlere neden olabilir çözüm düzeylerinde ani değişiklikler, önler. 6), birbirine yakın hücreler, sağlıklı bir çift seçin. Düzgün sitoplazmalı hücrelerin grenli sitoplazmalı hücreler daha sağlıklıdır. Dilim derin hücreleri sağlam sinaptik con korumak için olasılığı daha yüksektirtaklar. 7) pipet hücrelere yolda bozuldu veya diğer doku ya da enkaz karşı fırçaladı değil emin olun. 8) bu enkaz ya da zor bir kalite tam hücreli kayıt elde etmek için yapabileceğiniz her ikisi de bir balon ile tıkalı olmadığından emin olmak için pipet direncini kontrol ediniz. Aksine nitroselüloz filtre kağıdı için retina bağlama daha, bazı araştırmacılar agar bir blok retina embed ve retina dilim kesmek için bir vibratome kullanın. Biz bu yaklaşımı hiç denemedim rağmen, Kim ve ark. 11. Her iki yaklaşımın avantajları tartışacağız. Kendi deneyim, agar dayalı bir yaklaşım iyi tarif retina katmanları düz dilim daha tutarlı bir verim sağlar, ancak filtre kağıdı dayalı bir yaklaşım sağlıklı fotoreseptör verir. Çubuk ve koni membran potansiyeli değişiklikleri ışık iletici sorumludur. Eşleştirilmiş kayıtları ile, çubuk veya koni membran potansiyeli MANIPUL olabilirhücre tipleri tanımlamak için yararlı ise, gerekli olmayabilir, doğrudan ve çok hafif yanıtları oluşturma yeteneğine ated. Bu nedenle sık sık beyaz ışık dilimleri hazırlamak. Şekil tepkiler gösterildiği Ancak, parlak aydınlatma altında hazırlanan bile, semender retinal nöronların büyük ışık yanıtları oluşturabilir. 3. Bu, geniş dış kademeli bir hacimde kromofor, görece geniş bir hazneye kısmen, aynı zamanda koni 12 boyunca 11 cis-retinal yeniden oluşturmak için Müller hücrelerinin yeteneği yansıtabilir. Tam koyu adapte ışık yanıtları elde etmek için, bir kızılötesi aydınlatma altında dilimleri hazırlayabilirsiniz. Kızılötesi ışık altında diseksiyonu için, diseksiyon mikroskop Okülerin için GenIII görüntü şiddetlendirici (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) takın ve kızılötesi LED el feneri ile doku aydınlatmak. Dilimleme ve mikroskop altında yürütülen olmayan diğer işlemler için, kafa monte ima istihdamge yoğunlaştırıcı. Yama pipetler yerleştirilmesi için, dik, sabit aşamalı mikroskop monte kızılötesi duyarlı CCD kamera (örneğin WATEC 502H, WATEC Inc, Middletown, NY) kullanarak dilimleri görselleştirmek. Bu önlemlere, tek bir foton hassasiyet 6, 13 sergileyen çubuk yanıtları alabilirsiniz. Retina dilim çalışan bir sınırlama büyük alanda retinal nöronların uzun hücresel süreçleri dilimleme işlemi sırasında dendritler birçok kaybedebilirsiniz olmasıdır. Retina müstahzarlar dilim bu nedenle sinaptik iletişim hücre gövdesine yakın işlemleri de kapsayan bir hücre fizyolojisi eğitim için daha yararlıdır. Amfibi ve memeli retina aynı hücre tiplerinin çok paylaşmak ve benzer fizyolojik mekanizmaları 14-16 kullanmaktadır. Semender retina memeli retina birçok açıdan için iyi bir model olsa da, önemli bir fark memelilerde özel bir çubuk yolun varlığı gibi görünüyor bu invoAII amacrine hücreleri 14 üzerine özel çubuk bipolar hücrelerin lves kişiler. Semender retinanın ek bir sınırlama bu tür için özel olarak geliştirilmiş genetik araçları küçük bir sayıdır. Bununla birlikte, diğer türlerde de hedef iyi konserve edilmiş bölgelerde semenderin başarılı bir şekilde kullanılabileceğini antikorlar ve shRNA reaktifler olarak bir çok küçük molekül inhibitörleri ve peptit reaktifler. Buna ek olarak, teknik içinde birkaç değişiklik ile, retina dilim bu araçlardan bazıları daha kolay kullanılabilir hangi diğer türlerden hazırlanabilir. Eşleştirilmiş tam hücreli kayıt için kendi programını ötesinde, semender retina dilim hazırlık da diğer yaklaşımlar çeşitli müsait. Yukarıda ele alındığı gibi, retina dilimleri çeşitli voltaj kıskaç protokolleri, 17 ile birlikte ışık yanıtları incelemek için kullanılabilir. Retina nöronlar da Ca 2 duyarlı floresan boyalar ile yüklenebilir +, Cl -, veya Na+ Yama pipet aracılığıyla veya banyo-uygulama 15,18-20 tarafından tanıtıldı. Sinaptik şerit 21 ile bağlanan bir floresan peptid yama pipet ile başlandığında floresein konjuge, akut ve selektif bir şerit 22 zarar verdiği için görüntüleme, şerit 10 ya da için kullanılabilir. Ayrıca çubuk, tek tek kalsiyum kanalları ve koni sinaptik terminallerindeki 23 hareketlerini izlemek için kuantum noktalar ile birlikte retina dilimleri kullandık. Bu nedenle, dikey retina dilim temel sinaptik mekanizmaları ve görsel sinyal yolunun ilk sinaps gerçekleştirilen özel işleme fonksiyonlarını incelemek için çok yönlü bir deney preparattır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

Retina nörobilim merkezi görevlerden biri retinal nöronların devresi ve nasıl bu bağlantıları beyne iletilen sinyalleri şekillendirme sorumludur anlamaktır. Fotonlar bu optik sinir yoluyla işlenmiş ve beyinde merkezi hedeflere iletilen diğer retinal nöronların, onu verici, bir elektrik sinyali içine enerji dönüştürmek çubuk ve koni fotoreseptör tarafından retinada tespit edilir. Retina 3,4 çıkışını hücreleri - retina devresi ve görsel işleme içine önemli erken anlayışlar retina ganglion hücrelerinin spike faaliyet elektrofizyolojik kayıtları, daha sonra, Cajal 1,2 histolojik çalışmalar geldi ve. Retinada görsel işlem ayrıntılı bir anlayış fotoreseptör retina ganglion hücre için yolunda her adımda sinyal bir anlayış gerektirir. Ancak, birçok retinal hücre tipleri burelektrofizyolojik kayıt için nispeten ulaşılmaz bu nedenle dokusunda derin ve ied. Bu sınırlama, retina katmanlarının her birinde ikamet eden hücreleri açıkça görülebilir ve elektrofizyolojik kayıt için erişilebilir olduğu dikey dilimleri, çalışma aşılabilir. Burada, larva kaplan semender (Ambystoma tigrinum) gelen retina dikey bölümleri yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hazırlık aslında keskin Mikroelektronlar 5,6 ile kayıtları için geliştirilmiştir iken aynı anda kaydederken, biz fotoreseptör en membran potansiyeli manipüle edildiği fotoreseptör ve ikinci dereceden yatay ve bipolar hücrelerden çift tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları için bir yöntem tarif sonrası Yatay ya da bipolar hücreleri sinaptik tepkilerine neden olur. Kaplan semender fotoreseptör bu t üstlenmek için ideal bir hazırlık yapma, memeli türlerin bu çok daha büyük olanonun teknik olarak zor deneysel bir yaklaşım. Iyi tonik nörotransmitter serbest 7 gibi yüksek bir oranda korumak için uygundur çubuk ve koni fotoreseptör, dahil olmak üzere nöronların bir sadece bir avuç, bulunan özel bir sinaptik yapısı - Bu deneyler sinaptik şerit sinyal özellikleri sondalama doğru bir göz ile açıklanmıştır - 8, ve ne kadar bu ilk retina sinaps eşsiz sinyal özelliklerine katkıda bulunur.

Semenderin retina dikey dilim nöronların ışık yanıtları Örnek izleri Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Koni, yatay hücre ve bipolar hücre OFF tüm ışık başlangıcı yanıt olarak bir dışa akımı görüntüler. Yatay ve bipolar hücre kayıtlarında ışığı yanıp izleyen belirgin içe mevcut onlar ışık ofset de depolarize olarak fotoreseptör gelen glutamat artan serbest neden olur. AÇIK bipolar hücre bir işaret-ters metabotropik glutamat reseptör sinyal akışında ve TRPM1 kanallarının 9 aktive edilmesinden kaynaklanan hafif başlangıç ​​içeri doğru bir akım verir. Yatay hücreleri ve çift kutuplu hücreler IV ilişkileri (Şekil 4) birbirinden ayırt edilebilir. Bipolar hücreleri yüksek giriş direnci varken; Yatay hücreler genellikle doğrusal ya da içsel IV rektifiye ve düşük giriş direnci (Şekil 4A MQ &lt;500) var(0.5-2 GΩ) ve dıştan-rektifiye - V (Şekil 4B) Şekil 5 bir koni-yatay hücre çifti (Şekil 5A) ve koni-OFF bipolar hücre çifti (Şekil 5B) kayıtları bir temsilci sonuçlarını gösterir.. Her birinde, -70 mV&#39;luk bir tutma potansiyelinden -10 mV koni depolarize yatay ya da bipolar hücre içinde koni ve hızlı EPSC içe doğru akım voltaj-bağımlı kalsiyum uyarılmış. Bu güçlü bir uyarıcı ~ 47 pA / şerit 10 bir EPSC ile sonuçlanan her sinaptik kurdele gelen ~ 20 veziküller kolayca-açıklanmaması havuzu, boş yeterlidir. Şekil 5A yatay hücre EPSC bu presinaptik koni 5 şerit rehber aldığını düşündüren, 232 pA oldu. Kapalı uçlu hücreye 178 pA EPSC (Şekil 5B) Benzer bir şekilde, bu tahmin presinaptik koni 4 şerit temas alınan olduğunu göstermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Amfibi tuzlu </td><td> Presinaptik pipet </td><td> Postsinaptik pipet </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3.5 mM </td><td> 3.5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1.8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0.5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutamat * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-glukonat ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Tetra-etilamonyum klorit </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0.5 mM </td><td> 0.5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolaritesi **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamat pipet çözeltisi içinde 40 mM CsOH ile 40 mM L-glutamik asidin nötrleştirilerek yapılır. ** Cs glukonat bir 1 M stok% 45-50 D-glukonik asit ile CsOH eden bir çözelti nötralize tarafından yapılır. *** PH pipet çözümleri için hücre dışı çözeltisi ve CsOH NaOH ile ayarlanır. **** Sadece aşağıdaki pipet çözümlerin ozmolarite tutulması dışı çözelti bu hücre şişmesi engeller ve kaydın ömrü artırır. Tablo1. Bu protokolde kullanılan standart hücre içi ve hücre dışı çözüm bileşenleri ve parametreleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Şekil 1. Kayıt odası tasarımı. (AC) Top, yan ve boyutlarını gösteren kayıt odasının kesit manzarası. Odası akrilik bir 2 mm kalınlığında parça işlenmiştir. (D) Montajlı odası. Superfusate Teflon boru 10 cm uzunluğunda (; tipi 24LW girişi tüp) yoluyla odasına girer. Superfusate odasının diğer tarafında eğimli bir 20 gauge, metal boruya hafif emme uygulanarak çıkarılır. Bu çıkış tüp bitişik bir Ag / AgCl pelet referans elektrot. Bu referans elektrodundan talebi headstage referans girişine bağlıdır. KimWipe küçük bir üçgençözeltisi ile temas içinde tutmak ve çıkış tüp içine çözelti akışını düzenlemek için referans elektrotu üzerine yerleştirilir. Odasının tabanına odasının girintili kenarlarını içine bir cam mikroskop lamı yerleştirilmesi ile oluşturulur. Slayt vakum gres bir boncuk ile yerinde tutulur. Retina dilimleri ile nitroselüloz membran şeritler akışına çözüm için bir kanal oluşturmak vakum yağ boncuk yerleştirilmiştir. Önce dilim yapmak için, nitroselüloz membran 5 x 10 mm parça vakum gres iki küçük boncuklar ile odasına yapıştırılmıştır. Göz yuvası bir parça bu nitroselüloz membran üzerinde vitre tarafı aşağı yerleştirilir ve retina yapışır kez uzak kaldırdı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Şekil 2. Ve boyanın dolu hücre çiftlerirtical dilim hazırlık. A) aynı anda tam hücreli kayıt sırasında yama pipet ile tanıtıldı floresan boyalar zıt dolu olduğu bir çubuk ve synaptically-birleştiğinde yatay hücre görüntüleri. Lucifer sarının (2 mg / ml) ve çubuğun pipet çözeltisi (sarı) ve sulfarhodamine A (1 mg / ml), yatay hücre pipet çözeltisi (mor) eklenmiştir dahil edilmiştir. Floresan görüntüleri soğutmalı CCD kamera (Orca ER) ile donatılmış ve sabit sahne mikroskobu (60X, 1.0 NA suya daldırma hedefi ile Nikon E600 FN) monte bir iplik disk konfokal mikroskop (Perkin Elmer Ultraview LCI) kullanılarak ele geçirildi. Bu görüntüler) bir koni Görüntü ve bipolar hücre OFF synaptically-birleştiğinde Adobe Photoshop. B kullanarak ilgili retina dilim parlak bir alan görüntülerde üst üste edildi. Bipolar hücre akson terminali iç nükleer tabaka ile sınırı yakınlarındaki iç pleksiform tabakasının en dış (S1) sublamina içinde ramifies. <strong&gt; C) bir koni ve synaptically-birleştiğinde yatay hücre görüntüleri. Koni terminalleri çubuğun akson terminali çok daha büyük olduğunu unutmayın. Yatay hücreler ON-ve INL OFF-tipi bipolar hücreleri kolayca kayıttan önce ayırt edilemez kendi hücre gövdeleri dikdörtgen şekli, hücre organları tarafından tespit edilebilir olsa da. Bununla birlikte, bir onl hücre gövdeleri ve iç ve dış bölümleri olmaması ile koni ayırt edilebilir iki kutuplu hücrelerini koni tahrik olmuş hedef olabilir. Ölçek çubuğu 20 mm. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Şekil 3,. Beyaz parlak bir ışık 500 msn flaş yanıt olarak dört farklı retina nöronlardan gerilim kelepçe nda izlenen akımları Işık uyarılmış. Konisi (A), yatay hücre <strong&gt; (B) ve bipolar hücre kapalı (C) tüm dışa akım ışık cevap verdi. (D) üzerinde bipolar hücre içe dönük bir akım ile aynı ışık uyarana yanıt verdi. Kapalı bipolar hücre (C) tarafından sergilenen temel gürültü fotoreseptör ışığında hiperpolarize zaman azalır karanlıkta sinaptik veziküllerin sürekli bir sürümü yansıtır. Bu dört hücre verdiği beyaz ışık altında hazırlanan dilimleri kullanarak ayrı kayıtları elde edilmiştir. Bu örneklerde kullanılan beyaz ışık uyaran yoğunluğu 1 x 10 5 fotonlar / sn / 2 um ile 580 nm foton huzmesine eşdeğer yatay ve bipolar hücre yanıtları üretti. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Şekil 4. H akım-gerilim (IV) ilişkileriorizontal ve kapalı bipolar hücreleri. (A) Üst panel, -120 bir yatay hücreye 20 mV artışlarla (alt panel) uygulanan +40 mV 150 msn gerilim bir dizi adım tarafından uyarılmış membran akımları. Yatay hücreleri tipik olarak düşük bir giriş direnci ve doğrusal ya da içeri doğru rektifiye IV ilişkilere sahiptir. Voltaj adımları bir dizi yanıt olarak bir bipolar hücre dışı bölgesinin (B) IV ilişkisi. Bipolar hücre voltaj kapılı potasyum akımlarının aktivasyonuna bağlı olarak daha yüksek bir giriş direnci ve bir dışa doğru düzeltici IV sahiptir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Şekil 5,. Eşleştirilmiş veri kayıt örnekleri. Koni voltaj bağımlı kalsiyum akımı (A) Kayıt (Koni I Ca </s-70 mV (Koni V m) bir tutma potansiyeli -10 mV&#39;a bir 100 ms adımına cevap olarak UB&gt;). Kaçak ve kapasite geçici bir P / 8 kaçak çıkarma protokolü kullanılarak çıkartılmıştır. Hızlı bir uyarıcı (EPSC; HC PSC) mevcut sinaptik-sonrası, bu iki hücre sinaptik birleştirilmiştir gösteren yatay bir hücre aynı anda kaydedildi (B) EPSC başka bir aynı uyarıya cevap olarak kapalı bir bipolar hücre kaydedildi. koni.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation at JoVE.com

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması tarif<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) Ve fotoreseptör ve ikinci derece yatay ve bipolar hücrelerden çift tam hücreli gerilim kelepçe ölçümler ile retinada sinaptik işleme incelemek için bu dilim nasıl kullandıklarını açıklar.

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Görüntüleme.  University of Nebraska Medical Center. Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması tarif Ambystoma tigrinum) Ve fotoreseptör ve ikinci derece yatay ve bipolar hücrelerden çift tam hücreli gerilim kelepçe ölçümler ile retinada sinaptik işleme incelemek için bu dilim nasıl kullandıklarını açıklar.

Video: Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...