Bu çalışma NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133 hibe kısmen desteklenmiştir. Darwin&#39;in asın Biz onun teknik yardım için teşekkür ederim.

Hayvan Kullanım Bildirimi: Hayvanlar, Minnesota Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanan protokolleri kullanarak, Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu açıklanan kurallarına uygun olarak bakıldı . 1) Hazırlık çözümler <ol><li> Elektrofizyolojik kayıt yapmadan önce, hücre içi, ekstrasellüler ve enzim çözümleri hazırlıklı olması gerekiyor. </li><li> Ekstrasellüler çözüm: 1 litre ve 1.9 g sodyum bikarbonat (23 mM) ile H 2 O toz Ames &#39;orta karışımı bir şişe (8.8g) (Sigma). Bütün noktalarında ekstrasellüler çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 gaz karışımı ile doymuş yağlardır. 200 ml, retina depolama için bir behere aktarın. Yerçekimi perfüzyon için perfüzyon sistem konteyner retina monte sonra kalan çözüm yerleştirin. </li><li> Hücre içi çözüm: Hücre içi bir çözüm daha önce yapılan ve daha sonra aliquoted 500-1000 mcL alikotları ve -20 ° C&#39;de saklanan olmalıdır Hücre içi bir çözüm biz Burada gösterilen akım pensi kayıtları (mM) için gerekli olan deney bağlı olarak değişir: 125 K-glukonat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 Hepes, 2 Na 2-ATP, 0.5 mM NaGTP KOH 5 ile 7.2 pH. 10 mcM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) gibi bir floresan tracer deney ve neurobiotin (% 0.3) sırasında dendritler görselleştirmek eklenebilir kayıt aşağıdaki hücre anatomisi analizi için dahil edilebilir. Kaydetmek için hazır olduğunuzda, hücre içi çözüm Çözülme. </li><li> Enzim çözüm: 10000 Birimleri kollajenaz (Worthington Kimyasallar) ekstrasellüler çözüm 4.150 ml içine 83 mg Hyaluronidase (Worthington Kimyasallar) ile birleştirin. -20 ° C&#39;de 50 mcL alikotları saklayın Alikot birkaç hafta için kullanılabilir. Retina tedavi etmek için hazır olduğunuzda, kabarmış ekstrasellüler çözüm 500 mcL kısım seyreltilmiş. </li><li> Fosfat Çözümü (PBS) Tamponlu: 800 mL H 2 O 8 g NaCl, KCl, 0.2 g Na 2 HPO 4, 1.4 g ve 0.24 g KH 2 PO 4 ekleyin. NaOH ile pH 7.4 &#39;e getirin. 1 L. ses seviyesini ayarlayın </li><li> 0.2 M Fosfat Tampon: 800 ml H 2 O, Na 2 HPO 4 21.8 g ve 6.4 g NaH 2 PO 4 ekleyin. 1 L. hacim getir </li><li> % 4 Paraformaldehit Çözüm: Isı 60 ila 50 ml H 2 O ° C 4g paraformaldehid ekleyin ve birkaç dakika daha çırpın. 1M NaOH birkaç damla (yaklaşık 5 damla), çözüm açıktır kadar karıştırmaya devam edin. Behere 50 ml 0.2 M fosfat tamponu ekleyin. PH şeritleri (~ 7.4) ile pH kontrol edin. Filtre ve serin. </li><li> Engelleme solüsyonu (% 10 keçi serumu,% 0.5 &#39;TritonX100): keçi serum ve 10 mcL Triton X-100 0.2 ml 1.8 ml PBS ekleyin. TritonX-100 doku permeabilise hizmet vermektedir. </li><li> Streptavidin solüsyonu (% 5 keçi serumu,% 0.5 &#39;TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): 1.9 ml PBS keçi serum 0.1 ml, 10 mcL Triton X-100 ve 4 Streptavidin 594 mcL ekleyin. </li></ol> 2) İzolasyon fare retinanın Gerekli Diseksiyon araçları: 1 # 2 Forseps, 2 # 5 Forseps, oftalmolojik makas <ol><li> Bu durumda, onaylanmış protokollere göre fare Euthanize CO 2 boğulma ve aydınlatmak göz küresi, göz arkasında bir kesik # 2 forseps yavaşça ekleme ve göz küresi dışarı kaldırma . </li><li> Göz küresi ekstrasellüler çözümü ile 35 mm Petri kabı içine yerleştirin. Optik sinir ve oftalmolojik makas kullanarak herhangi bir bağlı ekstraoküler kasların veya bağ dokusu kesin. Oftalmolojik bir makas ile kesip kornea ve lens # 5 forseps kullanarak çekin. # 5 forseps bir çift kullanarak sklerasına Gözyaşı ve, retina ve sklera optik disk buluşmak optik sinir koparmak için forseps kullanabilir. Göz yuvası uzak retinanın hafifçe kabuğu. İpucu: süresini en aza indirmek için bir sonraki adıma geçmeden önce, hem de retina her adım yapın. </li><li> Forseps retinaya bağlı vitreus kaldırmak için kullanın. Bu forseps ile retina üzerinde şeffaf vitreus &quot;kapma&quot; yapılabilir. Vitreus, eğer başarıyla kaldırıldı, forseps açık bir, jelatinimsi bir madde olarak görünür olmalıdır. İpucu: vitreus yarım aşağıdaki kaldırma retina Dilimleme kullanılabilir doku miktarı en üst düzeye çıkarmak ve daha kolay odasının montajı yapacak. </li><li> Sindirilmiş olmak için hazır olana kadar minimum ortam ışığı ile karanlık bir ortamda oda sıcaklığında oksijenli ekstrasellüler çözüm retina tutun. Retinanın ~ 6 saat boyunca bu şekilde saklanabilir. </li></ol> 3) retinanın enzim karışımı ile kayıt odasında Tedavi ve montaj <ol><li> 35 mm Petri kabındaki 500 mcL ekstrasellüler çözüm, yerinde çözüm kollajenaz / hiyalüronidaz bir kısım seyreltilir ve retina transferi. </li><li> Retina içeren tutunyavaşça sallanarak 15 dakika için% 95 O2 /% 5 CO 2 ortamında ing Petri kabı, kapalı ve karanlık. Bu adım, kalan vitreus sindirerek yardımcıları ve ganglion hücre tabakası kolay erişim sağlar. İpucu: daha az vitreus veya olumsuz etkileri gözlenmiştir genç hayvanlardan elde edilen retina, süresi ~ 5 dakika kısaltılabilir. </li><li> Enzim içeren orta retina çıkarın ve ekstrasellüler çözümü iyice yıkayın. </li><li> Retinanın fotoreseptör tabakası ile aşağı bakacak şekilde kamara 6 kayıt içine aktarın. Bir pipet veya doku ya da sıvı kalan uzak Wick ve retina ganglion hücre tabakası ile özellikle temastan kaçınarak sadece kenarları, dokunmaya doku düzleştirmek için retinanın kenarlarında dışarı rulo. Doku çapa ve ekstrasellüler çözüm odasının hemen doldurmak için retina üzerinde naylon örgü ile platin yüzük yerleştirin. </li><li> Mikroskop sahneye Mount kayıt odası, yerçekimi perfüzyon ve vakum emiş tüpü takmak ve topraklama kablosu takın. </li></ol> 4) EGFP ifade ganglion hücrelerinin Yerelleştirme ve hafif stimülasyon <ol><li> 1 ml / dakika ya da daha hızlı bir fiyatla ekstrasellüler çözümü ile yerçekimi retina serpmek. İpucu: perfüzyon hızı çok yavaş ise, doku yeterince oksijenli ve sinaptik sinyal bozulabilir olmayacaktır. </li><li> Hücre içi solüsyonu ile doldurun ve bir kayıt pipet pipet tutucu takın. İpucu: 3 5MΩ aralığında dirençleri ile Pipetler iyi sonuçlar verebilir. </li><li> Kayıt pipet yerelleştirilmesine düşük büyütme (10X amacı, NA 0.3) kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik altında retina gözünüzde canlandırın. Kızılötesi ışık, görünür ışığın retinada maruziyeti en aza indirmek ve ışık adaptasyon en aza indirmek için kullanılır. Yüksek büyütme (40X amacı, NA 0.8) taşı ve doku yukarıda sadece görünümü içine elektrod getirmek. </li><li> Yüksek büyütme (40X objektif), Epifloresans (EGFP için 480 nm) ile retina aydınlatmak ve bant (Şekil 1A) kullanarak bilgisayar monitörü floresan bir ganglion hücre ve işareti seçin. </li><li> DIC ve kızılötesi aydınlatma altında, kayıt elektrodu hedeflenen ganglion hücresi (Şekil 1A) yakın pozisyon. Temizlik alanında hemen kayıt elektrot, polietilen boru ile pipet sahibine bağlı bir 12cc plastik enjektör ile hafif pozitif basınç uygulayarak hücre kapsayan. Amplifikatör, herhangi bir gerilim uzaklıklar sıfır. Yeri elektrot seçilen ganglion hücre üzerine gamze hücre yüzeyinde görünene kadar. </li><li> Gerilim kelepçe modunda amplifikatör, bir test darbe uygulamak ve pipet akımını geçirerek izlemek. Elektrot ve hücre arasındaki mühür oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Negatif basınç, hücre, hücre zarı ve pipet arasındaki GΩ elektrik mühür akım göstergesidir tutarak kadar mühür ve bekleyin başladığında bırakın. Kapasitif transientler görünür ve daha sonra basınç herhangi bir uygulama bırakana kadar nazik bakliyat negatif basınç uygulayın. İpucu: erişim (seri) direnci yüksek ise (&gt; 30MΩ), bu genellikle, negatif basınç ek, çok nazik, bakliyat tarafından ıslah edilebilir. </li><li> Bir istikrarlı bir mühür, bir darbe negatif basınç uygulamak ulaşıldı. Tüm hücre modu elde edildikten sonra, hücre karanlık 5 dakika boyunca uyum sağlar. Kayıt, tam alan, beyaz ışık stimülasyonu (Şekil 1B) akım pensi modu, tepki. </li><li> Kayıt sonrasında Alexafluor-594 dendritler yayılmış olacaktır. 594 nm Epifloresans altında tracer görüntülenebilmekte ve ganglion hücre olup olmadığını On-Epifloresans ve DIC kızılötesi optik 5 arasında geçiş Off-ya da Bi-tabakalı belirlemek için kullanılır. </li><li> Pipet ve retina immünohistokimya için işlenmiş olacak neurobiotin dahil ise, o zaman pipetle yavaşça zarının en az kesilme sağlamak için retrakte olmalıdır. </li></ol> 5) Analiz kaydedilen ganglion hücrelerinin anatomisi Neurobiotin ile doldurma kayıt sonrasında ganglion hücrelerinin daha ayrıntılı morfolojik analiz sağlar. İpucu: kaydedilmiş bir ganglion hücre ve detaylı morfolojisi arasındaki özel ilişki isteniyorsa, bu hazırlık için sadece RGC bir kayıt ve doldurmak için en iyisi olabilir. <ol><li> Neurobiotin hücre içi bir çözüm dahil edildi, sonra paraformaldehid çözüm retina yerleştirmek ve 4 gece düzeltmek ° C </li><li> PBS içinde, en az 6 değişiklikler en az 2 saat durulayın. Engelleme çözümü içeren bir tabak retina aktarın. Shaker, 2 saat boyunca oda sıcaklığında çözümü engelleme bekletin. </li><li> Streptavidin çözümü ile engelleme çözüm değiştirin. 2 gün, 4 ° C çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. PBS içinde retina, 6 çalkalama, her biri 20 dakika durulayın. </li><li> Bir bardak slayt Vectashield retina monte edin.Retina ganglion hücrelerinin yerleştirilmesi gerekir. Konfokal mikroskobu (Şekil 1C) gerçekleştirin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Retinanın sağlıklı ve diseksiyon başarılı olursa, bireysel ganglion hücrelerinin yüksek büyütme (Şekil 1A) DIC altında görünür olmalıdır. Sağlıksız retina büyük, toz çekirdekleri ve atılmalıdır. Belirli bir ganglion hücre sinaptik yanıt sağlam ise, o hücrenin bir içsel ışığa ganglion hücresi (Şekil 1B), sürekli bir depolarizasyon durumunda, ışık başlangıcında yanıt vermek ya da aksiyon potansiyelleri ile ofset ve olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Yerelleştirme, kayıt, ve bir floresan etiketli retina ganglion hücre boyama (A) GFP pozitif RGC 40X büyütme (sol panel) ve DIC aydınlatma (sağ panel) altında epifluorescent aydınlatma altında görüntülendi. (B) floresan etiketli RGC tüm hücre akım kelepçe modunda kaydedilen M2 özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücre Synaptic ışık yanıt. (C) tüm hücre kayıt için hedeflenen Epifloresans altında tespit edilmiştir M1 özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücre, neurobiotin dolu ve ardından immünohistokimya için işlenmiş.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

Bu teknik, izole bir retina herhangi bir retina ganglion hücre kayıtları geçerlidir. Yukarıda kullanılan fare doğrultusunda rağmen özünde ışığa, melanopsin ifade RGCs EGFP 2, 5 ile etiketlenir, bu protokol floresan ile işaretlenmiş diğer RGC hatları kolayca devredilemez veya yanı sıra rastgele seçilen RGCs kayıt jeneralize olabilir. Bu teknik, her RGC ve ilgili giriş nöronların dendritik mili tamamen değişmeden kalır, çünkü özellikle değerlidir. Kayıtları, akım veya gerilim...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

Işık retina 1 çubuk ve koni fotoreseptörlerin uyarır, omurgalı vizyonu ilk adımları yer almaktadır. Bu bilgiler daha sonra ON ve OFF yollar olarak bilinen ayrılmış;. Bipolar hücreler, ışık şiddeti artar (BCS Açık) veya azalır (BCS Kapalı) yanıt olarak depolarize fotoreseptörlerin sinyal ışık bilgi (BCS). Işık bilgi bu ayrımı Kapalı BCS doğrudan eksitatör giriş alırsınız iç pleksiform katman (IPL), ya da Kapalı sublamina tabakalandırılması dendritler retina ganglion hücrelerinin (RGCs) seviyesinde tutulur, ya da içinde tabakalandırılması BCS Açık doğrudan eksitatör giriş alırsınız IPL Açık sublamina. Aydınlatma (Açık ve Kapalı yollar) olarak artar veya azalır ile ilgili bilgiler bu ayrımı paralel olarak korunmuş ve beyne sinyal. RGCs retinanın çıkış hücreleri, ve böylece ışık bilgileri beynin görme çekirdekleri sinyal nasıl anlamak için çalışma önemli bir hücre. Son on yılda fare genetik gelişmeler, özel RGC nüfus elektrofizyolojik kayıt için hedef RGC alt tipleri 2 3 4 ve özel kimlik izin vermek için floresan protein etiketli floresan muhabiri fare hatları çeşitli sonuçlandı . Burada, sağlam bir, izole retinal hazırlanmasında floresan etiketli ganglion hücrelerinin ışık yanıtları kaydetmek için bir yöntem mevcut. Bu izole retinal dendritik mili sağlam ve tüm RGC dendritik mili boyunca girişler korunur RGCs kayıtları için hazırlık sağlar. Bu yöntem, ganglion hücre alt tiplerinin çeşitli çapında geçerli ve tek hücreli fizyolojik teknikler geniş bir yelpazede uygun.

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Görüntüleme.  University of Minnesota. Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Video: An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Nörobilim

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Retina Ganglion Hücre Survival Eğitim Bir Optik Sinir Crush Yaralanma murin Modeli

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Retinal Ganglion Hücrelerini İncelemek için Fare Retina İzolasyonu ve Metanol Tedavisi

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Yazar Spotlight: Retinal Ganglion Hücrelerinin İncelenmesi için Metanol Bazlı Tam Montajlı Hazırlık  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...