Biz hücre analizi ve kesitler hazırlamak için Helen Johnson (Wadsworth Merkezi Hayvan Histopatoloji Çekirdek) yardım için Renjie Song (Wadsworth Merkezi Akış Sitometri Çekirdek) teşekkür ederim. Biz konfokal mikroskopi ve görüntü toplama konusunda yardım almak için Dr Richard A. Cole (Wadsworth Merkezi Işık Mikroskobu Çekirdek) teşekkür ederim. Biz animasyonlar ile yardım için Andy Bentley (Wadsworth Center Fotoğraf ve İllüstrasyon) kabul etmek istiyorum. MDJ Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. SA Wadsworth Merkezi-Sağlık Araştırma A.Ş. intramural doktora sonrası dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma NIH hibe HD061916 ve GM082978 tarafından kısmen desteklenmiştir.

Hayvanlar geleneksel, spesifik patojen free koşullarda muhafaza edildi ve Wadsworth Merkezi&#39;nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) kurallarına tam uyumlu olarak tedavi edildi. 1. Oral Gavaj <ol><li> 22 G x1.5-kullanarak ilgi antijen veya mikroplarla seçim (İsteğe bağlı) Gavaj fare zorlanma. Künt uç besleme iğne (Popper Bilimsel, New Hyde Park, NY). Teslimat hacimleri fare başına 400 ul geçmemelidir. </li></ol> 2. Akış sitometrisi için PP Hücre İzolasyonu <ol><li> Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) kurallarına göre, CO 2 boğulma tarafından fareler Euthanize. </li><li> % 70 etanol veya cerrahi öncesi betadin ile karın temizleyin. Göğüs kafesinin tabanı 1,5 cm&#39;lik orta hat başında birlikte cerrahi sınıf makas kullanarak tek bir (1 cm) kesi yapılır standart laparotomi gerçekleştirin. Başına Açığapreperitoneal kavite ve körbağırsak tanımlar. Ileal-çekal kavşakta terminali küçük bağırsak Kırpmalı ve yavaşça bütünüyle bağırsak çıkarın. Bu periton boşluğuna kaldırılır ediliyor gibi bağırsak dokusundan hyperextend vermemeye özen. </li><li> Nemli kağıt havlu veya Kimwipes bir yatak üzerinde ince bağırsak yatırın. Doku kaybını önlemek için tuzlu su ile hafifçe ince bağırsak ıslatın. Görsel olarak bağırsak (Şekil 1) &#39;in anti-mesenterik tarafında bulunan bireysel PPs tanımlar. Genellikle, tek bir fare eşit ileum (distal) için duodenum (proksimal) dan dağıtılır 5 ila 10 görünür PPs vardır. Ortalama olarak, dört fare 23 PPs verecektir. </li><li> Kavisli cerrahi makas, yavaşça tüketim bireysel PPs ve soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) koyun kullanma. Not, makas sadece PP yukarıda eğri tarafı yukarı yerleştirilir ve daha sonra yavaşça dokuya uygulanmalıdır. Tüketim sadece PP (değil surrounding doku) ve soğuk HBSS transfer. Not: İleri Bölüm 2&#39;de bu noktadan tüm inkübasyonlar ve santrifüj adımları ° C hücre canlılığı korumak için 4 yapılmalıdır. </li><li> 37 az 15-20 dakika için 5 ml Dalak Ayrılma Orta ve inkübe içine PPs aktarın ° C kuvvetlice 250 rpm&#39;de sallayarak ise. Daha uzun inkübasyon süresi olumsuz hücre canlılığı etkileyecektir. </li><li> Steril (otoklav) 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden tek bir hücre süspansiyonu, yer PPs oluşturmak ve zorla bir 1 cc şırınga bir pistonun tabanı kullanılarak örgü içine doku öğütmek için. Alternatif olarak, iki buzlu steril cam mikroskop slaytlar (zarf içinde otoklava) ve hafifçe ileri geri hareket ile dokulara öğütmek arasında sandviç PPs. Bir 5 ml Falcon tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak için bir aktarma steril pipet kullanın. </li><li> Hücre süspansiyonu ile 1 mm arasında bir nihai konsantrasyon için EDTA ekleyin. Bir rocker üzerinde inkübeOda sıcaklığında 5 dakika. </li><li> İkinci bir 70 mikron hücre süzgecinden Durusu hücre süspansiyonu kalan hücresel toplamları veya doku enkaz kaldırmak için. 15 ya da 50 ml konik tüp hücreleri toplayın. </li><li> Nazik santrifüj Konu hücreleri (500 x g&#39;de 5 dakika). Fosfat salin (PBS)% 1 dana fetus serumu (FCS) içeren tamponlu bir akış tampon içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant Durusu hücreler. </li><li> Hücre sayısı ve canlılığı belirlemek için, tripan mavisi içinde 1:10 hücrelerin sulandırmak ve görsel bir ışık mikroskobu ve bir hemasitometre kullanarak hücrelerin kontrol edin. Alternatif olarak, bir Kontes hücre sayacı (Invitrogen) veya benzer bir cihaz otomatik hücre numaralarını ve canlılığı numaralandırmak için de kullanılabilir. 20-25 PPs ile başlayarak, bu protokol&gt; 2.5 x 10 6 total hücre boyun eğmek zorundadır. Bu ~ 0.8-1.2 fare başına x 10 6 hücre eşittir. </li></ol> Akış sitometrisi için Hücrelerinin Antikor Etiketleme &lt;ol start = &quot;11&quot;&gt; <li> Bir 96-kuyu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyularına hücreleri (çukur başına 10 5) dağıtın. </li><li> Nazik santrifüj (1.000 x g&#39;de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası. </li><li> Fc blok tampon içinde tekrar süspansiyon ve hücreler 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Piyasada bulunan Fc blok tampon bir dizi (örneğin Sıçan anti-fare CD16/CD32, BD Biosciences) olmakla birlikte, biz sadece murin karşı monoklonal IgG 1 salgılar bir sıçan B hücresi hibridoma (ATCC 2.4.G2) harcanan orta kullanmak Bu adım için Fcγ reseptörleri. </li><li> Yukarıdaki gibi nazik santrifüjleme (1.000 x g&#39;de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası. </li><li> İstediğiniz dilusyondaki hücre süspansiyonları doğrudan fluorofor konjuge antikorlar ekleyin ve sürekli sallanan ile 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Konu nazik santrifüj plaka (1.000 x g&#39;de 5 dakika) ve süzünyavaşça tersine plakası tarafından süpernatant. </li><li> Akış tampon 100 ul hücreleri yıkayın. </li><li> Yavaşça tersine plakası ile 5 dakika ve süzün süpernatant 1.000 xg&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Yeniden süspanse hücre akış tamponu 300 ul ve PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM pH 6 MgCl2) 100 ul oluşan 400 ul tespit tampon,. </li><li> Konu bir FACSCalibur hücreleri ya da denk kullanılarak akış sitometrisi. Hücre Görev Pro yazılımı sürüm 5.2 kullanarak sonuçları analiz edin. </li></ol> 3. PP Cryosections hazırlanması <ol><li> Doku toplanması öncesinde, 7x7x5 mm plastik taban kalıpları Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) bileşiği ekleyin. Ayrıca bir Dewar veya buz kovasının içinde sıvı azot (&gt; 750 ml) bir havuz hazırlamak. </li><li> Fare Euthanize ve yukarıda tarif edildiği gibi, bir laparotamy gerçekleştirir. Islak kağıt havlu üzerine bağırsak ve yer çıkarın. </li><li> Karşıcyrosectioning için PPs yalıtmak, PBS içeren bir Petri kabı tek PP ve transfer doku içeren ince bağırsak 0,5 cm transvers segmentler kesti. Yavaşça istenmeyen fekal enkaz kaldırmak için PBS ile bu segmentlerin lümen durulayın. </li><li> Dikey Ekim içeren taban kalıpları içine bağırsak dokusundan segmentleri yerleştirin. Sıvı azot içinde kalıp daldırın ve doku (1-2 dk) tamamen dondurmak için izin verir. Doku tamamen donduğunda OCT rengi berrak beyaza dönüşecektir. . Daha kademeli bir soğutma (örneğin OCT çatlama azaltmak için) için, sıvı azot buharı ile soğutulur izopentan bir banyo daldırın kalıp Not: sıvı nitrojen ile çalışırken uygun güvenlik gözlükleri takın. </li><li> Forseps kullanarak sıvı azot dondurulmuş taban kalıpları çıkartın ve kalıp OCT blok kenarları yumuşatmak için izin yeterince uzun oda sıcaklığında (~ 10-15 sn) az ısınmasını bekleyin. O andan itibaren OCT donmuş blok kaldırmak içinkalıp, kalıp ters çevirin ve alüminyum folyo temiz bir 4 x 4 cm parça üzerine blok çıkarmak için tekrar üzerine hafifçe bastırın. Hemen sıvı azot veya kuru buz üzerinde depolanan bir etiketli numune torbaya folyo ve yerde doku sarın. Alternatif olarak, bir dondurucu (&lt;-20 ° C) içinde doku aktarın. Bir hafta içinde doku kullanın, aksi blokları yaş kırılgan olacak. </li></ol> Cryosectioning <ol start="6"><li> Cryosection bir Leica CM3050S cryomicrotome ya da eşdeğerini kullanarak doku. Kriyostat üzerindeki odasının sıcaklığı -21 ayarlanmış olmalıdır ° C </li><li> Kalınlığı 12-14 mikron olan bölümler için çalışıyoruz. </li><li> Fisher SuperFrost Plus (veya eşdeğer) cam mikroskop Slaytlarınıza bölümleri toplayın ve standart bir düşük güç ışık mikroskobu kullanılarak görsel inceleyin. Birden çok bölümlü bir slayt üzerinde toplanan ediliyor, onlar aşağı boyama uygulamaları için bir araya kümelenmiş emin olun. </li><li> Mağaza to bir slayt kutusunda oda sıcaklığında slaytlar ve ideal bir kaç gün içinde bunları kullanmak. </li></ol> Cryosections Antikor Etiketleme ve Konfokal Mikroskop Analizi <ol start="10"><li> 2 dakika süreyle doku boyama kavanoz ya da raflar aseton içinde daldırın slaytlar (ya da metanol). Uzun süreli inkübasyon slayt ayırmak dokularda neden olabilir. </li><li> Yeni boyama kavanoza slaytlar aktarın ve 3 dk her PBS-T (% 0.05 Tween-20 ile 1X PBS) ile 3 kere yıkayın. </li><li> Bir ImmEdge hidrofobik kalemle bölümleri çevreler. Bu reaktifler ve antikor inkubasyon sırasında bu alanı sınırlı kalır sağlayacaktır. </li><li> Işıktan korumalı bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dk için, blok tamponunda slaytlar (PBS içinde% 2 keçi serumu) inkübe edin. </li><li> 37, 10 dakika için Fc blok tamponu (yukarı bakınız) ile inkübe slaytlar ° C. </li><li> PBS-T ve Kimwipes veya diğer emici dokusu kullanılarak bölümler çevresinde kuru alanda Dip slaytlar.Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin. </li><li> Kaplama 37 doku 30 dakika için birincil antikor çözeltisi ile inkübe ° nemlendirilmiş bir oda içinde C ile bölümleri. Primer antikor tipik olarak 20 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona blok tamponu içinde seyreltilir. En çok üç antikorlar bu aşamada direkt olarak kombine edilebilir, çünkü doğrudan doğruya-etiketli primer antikorların kullanılması arzu edilir. Doğrudan etiketli antikorlar ek antikor inkübasyon aşaması için ihtiyacı ortadan kaldırır. </li><li> Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar. </li><li> Eğer bir nem odasında 37 ° C &#39;de 30 dakika süre ile ilgili ikincil antikor ile gerektiğinde inkübe kayar. </li><li> Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid içinde 4 dk için slaytlar inkübe edin. </li><li> 1 dakika boyunca PBS ile slaytlar durulayın. </li><li> Kuru Kimwipes kullanarak bölümleri çevresindeki alanı veya diğer absorbeent doku. Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin. Bir pipet veya damlalık kullanarak, yavaşça bölümüne doğrudan Altın montaj orta Prolong bir damla yerleştirin. Kabarcıkları önlemek için dikkat çekici montaj ortam üzerine bir cam lamel uygulayın. Herhangi bir aşırı montaj orta absorbe kurutma kağıdı kullanın. </li><li> Ticari oje ve kurumaya bırakın ile mikroskop slaytlar Seal lamelleri. </li><li> Leica TCS SP5 veya eşdeğeri konfokal mikroskop ile slaytlar görüntüle. </li></ol>

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda, immün akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri sağlamıştır. Her iki yöntem bir akış sitometresinin ve kriyostat olarak sağlanır, yüksek oranda tekrarlanabilir ve kolayca erişilebilir. Ilk kez araştırmacılar için bu dalak göre, santrallerin toplam hücre verimleri nispeten yetersiz olduğuna işaret edilmelidir. Bununla birlikte, protokol biz genellikle tek bir fare 0,8-1,2 x 10 6 toplam PP hüc...

Peyer plaklarında (PPs) insan ve farelerde (Şekil 1) ince barsak boyunca mevcut organize lenfoid folikül makroskopik büyüklükler ve mukozal immün yanıtları diyet antijenler, komensal bakteriler, mikrobiyal patojenler ve oral aşılar karşı başlatılan hangi birincil siteler teşkil 1-4. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi diğer periferal lenfoid dokuların aksine, PPs afferent lenfatikler yoksundur. PPs böyle, adaptif immün yanıtları intestinal lümen elde antijenlere yanıt olarak tahrik gibi. Luminal antijenlerinin örnekleme M hücreleri olarak bilinen enterocytes ve antijen-örnekleme hücrelerinin her iki oluşan folikül ilişkili epitel (FAE) ile gerçekleştirilmektedir. FAE altında, alt-epitelyal kubbe (SED) bölgesinde, makrofaj, B hücreleri ve CD4 + T hücreleri 5-9 ile iç içe dendritik hücreler (DC) bir ağ yatıyor. Her PP lenfoid follicl özündeE foliküler dendritik hücreler (FDCs) ve T hücreden zengin interfolliküler zonları ile çevrili bir B hücre zengini Orta germinal merkez vardır. IgA + B hücre plasmablasts ve CD4 + efektör ve bellek hücrelerinin gelişiminde PPs sonuçları Antijen örnekleme o tohumu çevreleyen lamina propria ve mukoza işgalciler geniş bir bağışıklık sağlar. PPs antijen örnekleme, işleme ve sunum ile ilişkili kompleks immünolojik olaylar Diseksiyon PP hücreleri bağırsak mukozasında toplam lenfoid hücrelerin ancak çok küçük bir kısmını teşkil ettiği göz önüne alındığında, zor bir iştir. Bu ortamda hücrelerin in vitro olarak karakterize yardımcı olmak için, akış sitometrisi ve işlevsel analizi, hem de immün flüoresan mikroskopi ve immünohistoloji için cryosections PP hazırlanması için bir protokol için toplam fare PP hücrelerinin hazırlanması için bir protokol sağlar. Mous izolasyonu, karakterizasyonu ve immun Bizim protokolE PP hücreleri bu teknikler 5,6,9-11 cite daha 25 yıl öncesine tarihlenen çok sayıda başvuru olduğu gerçeğini kanıtladığı, başlı başına roman değildir. Aksine, protokol, ilk kez için PPs toplama araştırmacılar için düzenlenmiş bir (görme ve) bir yöntem sağlar. Bizim tarif teknikler kolayca hakim ve kolayca&gt;% 90 hücre canlılığı ile hücrelerin büyük sayıda elde edilir. Cryosectioning protokolü ideal immünofloresan boyama ve konfokal görüntüleme için uygun son derece tekrarlanabilir seri kesitler verir. Ayrıca, protokol diğer iki yeni vallahi makaleler tamamlar. İlk, Fukuda ve arkadaşları tarafından, PP M hücreleri 12 ile patojen bakterilerin alımını değerlendirmek için bağlanan ileal loop testlerinin kullanımı anlatılmaktadır. Diğer, Geem ve arkadaşları tarafından, DC&#39;ler ve fare intestinal mukozadan makrofaj izolasyonu ve karakterizasyonu açıklar, ancak açıkça onların analiz 13 PPs dışlar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Madde </td><td> Şirket </td><td> Kedi. # </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ekim Bileşik </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Taban Kalıpları </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Kalem </td><td> Vektör Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Artı Slaytlar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Kenar Rite Blade </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fare CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fare CD19-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol kırmızısı olmaksızın Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mikron hücre süzgecinden </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352.350 </td><td></td></tr><tr><td> Dalak Ayrışma Orta </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Blok </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes hücre hattı elde 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Kavisli Makas </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Kriyostat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kontes Hücre Sayacı </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoksilen </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> Starplex Bilimsel </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Peyer plaklarında (PPs) gut-ilişkili lenfoid dokuların ayrılmaz bileşenleri (GALT) ve intestinal immünosürveylansında ve homeostasis merkezi bir rol oynamaktadır. Bağırsak lümeninde Partikül antijen ve mikrop sürekli folikül ilişkili epitel (FAE) PP M hücreleri tarafından örneklenmiş ve altta yatan bir dendritik hücreler ağı (DC&#39;ler), makrofajlar ve lenfositler taşınmaktadır. Bu yazıda, murin PPs (i) tek hücre süspansiyonları içine uzaklaşılmış ve akım sitometri tabi ve (ii) cryosectioning ve immün için hazırlanan hangi protokolleri tanımlar. Flow sitometri için santrallerin mekanik ayrılmış ve daha sonra epitel hücreleri ve büyük enkaz ücretsiz tek hücre süspansiyonları üretmek için 70 mikron membran ile filtre vardır. 20-25 PPs (dört fareler) ile başlayarak, bu hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir&gt; 2,5 nüfusu verir x 10&gt; 90% hücre canlılığı ile 6 hücre. Cryosectioning, taze içinly izole PPs bir cryomicrotome kullanarak o Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta, sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve kesitli batırılır. Doku kesitleri (5-12 mikron), aseton veya metanol ile tespit edilmiş, hava ile kurutulmuş, ve daha sonra immün tabi tutulmuştur.

Toplam PP hücreleri monodisperse süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, iyi ve kötü hücre hazırlıkları arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. % 80&#39;in üzerinde canlılığı ile iyi cep hazırlıkları, hücreler büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre granülarite (Şekil 2A) bir göstergesi gösterir. Bu deneyde, biz de kasıtlı (yerine PHEM PBS artı% 1 FCS ile hücreler ku...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K Görüntüleme.  New York State Department of Health. Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Video: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...