Biz Dr teşekkür ederim. Hidrodinamik gen transferi tavsiye Alex Gelbard ve Willem Overwijk. Bu çalışma NIH (AI098099, SSW), Kanser Epigenetik için MD Anderson Merkezi, iltihaplanma ve Kanser için MD Anderson Merkezi (SSW), ve RE Bob Smith Eğitim Fonu (HSL) hibe tarafından desteklenmiştir.

Kurumsal onayı fareleri içeren burada anlatılan tüm deneysel manipülasyonlar için önceden alınmalıdır. Bu kemik iliği projenitör hücrelerin izolasyonu için C57BL6 farelerin kullanımını içerir, IFNAR - / - adoptif hematopoietik progenitörlerin transferi ve in vivo sitokin aşırı ekspresyonu için HGT kullanımı için alıcılar olarak farenin. Uygun konut ve hayvan bakımı da araştırmacı veya kurum tarafından sağlanmalıdır. Ayrıca, kurumsal onay hidrodinamik gen transferi (örneğin, yeniden birleştirici DNA onayı) kullanılan plasmidlerin için gerekli olabilir. Burada anlatılan çalışmalar, UT MD Anderson Kanser Merkezi&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1.. Hidrodinamik Gen Transferi (HGT) Bu adım, in vivo olarak 5 DC genişleme Flt3L dolaşan indükleme CDP en adoptif transfer 2 gün önce yapılmalıdır. Prepare en az 5 alıcı farenin / grup. <ol><li> Etkili Hgt elde edilmesi için, alıcının IFNAR kan damarları - / - fareler (CD45.2 +) 5-10 dakika için bir ısıtma lambası için fareler maruz bırakılarak genişlemiş olmalıdır. </li><li> Bir süzgeç cihaz fare yerleştirin ve% 70 etanol ile kuyruğunu dezenfekte. </li><li> Bir 27 G iğne kullanılarak kuyruk damarının içine steril PBS ve 2 ml plazmid kodlayan Flt3L 5 ug enjekte edilir. Gösterildiği gibi kontrol kohortunda için, kuyruk damarından boş vektör (pORF) 5 ug enjekte edilir. </li><li> Kuyruk ven enjeksiyon hiçbir zararlı etkisi vardır sağlamak için 15-30 dakika süreyle fareler izleyin. 2 gün boyunca konut tesis için fareler dönün. </li></ol> 2. Fare kemik iliğinden hematopoietik progenitörlerin izolasyonu Bu adım 2 gün HGT sonra yapılmalıdır. Alıcı IFNAR&#39;ın içine evlat edinen transferi için kemik iliği atalarıdır kaynağı olarak konjenik CD45.1 + fareler kullanın - /- Hayvanlar (CD45.2 +). Bu protokolde, konjenik suşları donör ve alıcı-türetilmiş DClerin ayırt etmek, hem de MHC uyumsuzluğu immün-aracılı tükenmesini önlemek için gereklidir. Yaklaşık 10-20 farenin transfer deneyleri için hematopoietik progenitör hücrelerin yeterli sayıda (10 5 hücre / alıcı fare) sağlamak için gerekli olacaktır. <ol><li> CO 2 boğulma ve servikal dislokasyon ile 10 konjenik CD45.1 + fareler Euthanize. </li><li> Bir diseksiyon tepsiye her karkas yerleştirin ve% 70 etanol ile karın ve bacaklar sterilize. </li><li> Orta karın bir kesi yapmak ve bacak uzunluğu aşağı deri kesme, her bacak karın deri kesti. </li><li> Yavaşça her bacak cilt kaldırmak ve kesilmiş ve keskin bir makas kullanarak kalça ekleminde karkas bacakları kaldırmak. </li><li> Dikkatlice keskin bir bıçak kullanarak her bacak femur ve tibia kasları çıkarın. </li><li> KaldırmakHer iki keskin bir neşter ile femur ve tibia ve uçları (% 10 ısı ile pasifleştirilmiş cenin sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin, 1 mM sodyum piruvat, 50 uM β-mersaptoetanol Kan numuneleri) komple RPMI içeren bir kültür kabı içinde yer kemikleri . </li><li> Bir 27 G iğne bağlı tam RPMI içinde 1 ml ihtiva eden bir şırınga hazırlayın. </li><li> Femur veya tibia bir ucunu 27 G iğne takın. Yavaşça kemik içine komple RPMI enjekte femur ve tibia gelen kemik iliği yıkayın. Kemik iliği hücreleri kemik kaldırılır ediliyor sağlamak, bu görsel bulutlu görünür sınırdışı medya tespit yapılabilir. </li><li> Iyice kemik iliği hücreleri çıkarmak için her femur ve tibia 3x yıkama tekrarlayın. </li><li> Nazikçe kültür çanak yukarı ve aşağı 3-5x hücreleri pipetleme tarafından tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın. </li><li> Yeni Kültür içine yayılır hücreleri yerleştirerek, 40 mikron hücre süzgecinden kemik iliği hücrelerini geçerek enkaz kaldırmake çanak. Steril bir şırınga pistonu sonu ile hafif basınç ile süzgeç görünen herhangi bir hücre kümeleri bozar. </li><li> Lyse, üretici talimatlarına göre ticari RBC liziz tamponu ile toplam kemik iliği hücre süspansiyonu içinde mevcut olan kırmızı kan hücrelerinin (RBC). 2 ml RBC liziz buffer/4-6 x 10 7 hücrelerinin (bir fare genellikle hücreleri) ve oda sıcaklığında 5 dakika bir kuluçka zaman kullanın. </li><li> (1x PBS + 2 mM EDTA +% 1 FBS), peletleme hücreler santrifüj ile ve yavaşça aspire yıkama 10 ml FACS tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona, yavaşça kültür ortamı aspire, 500 x g, 4 dakika için santrifüjleme ile tane haline hücreleri tarafından kemik iliği hücrelerinin yıkayın tampon eklendi. </li><li> Adım 2.13 &#39;de tarif edildiği gibi 2 yıkar, toplam, yıkama tekrarlayın. </li></ol> 3. Floresan-aktive edilmiş hücre CDP yalıtmak için (FACS) Bu adım, bir başlangıç ​​negatif seçim prosedürü için bir MidiMACS hücre ayırıcı ve MACS LD sütunları erişimi gerektirirfloresan konjuge antikor ile boyanarak renkli progenitör alt kümesini saflaştırmak için en az 3 lazer ile hem de bir FACS makinesi. <ol><li> Adım 2.14 ikinci yıkamadan sonra, kemik iliği hücreleri saymak. Adım 2.13 &#39;de tarif edildiği gibi santrifüjleme ile Pelet hücreleri ve FACS tampon maddesi 30 ul başına 4 x 10 7 hücre bir son konsantrasyon elde etmek için FACS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. </li><li> FACS için hücrelerin hazırlanması için, soy-negatif hücrelerin ilk manyetik boncuk kolon kromatografisini kullanarak kemik iliği karışımından soy pozitif hücrelerin çıkartılması için bir negatif seçim tekniği ile zenginleştirilmiştir. CD3, CD19, CD11c, CD11b ve Ter-119 Abs: negatif seçim prosedürü için, hematopoietik kökenli işaretlerini tanıyan aşağıdaki ticari sıçan anti-fare antikorları (Abs) her birinden 1 ug ekleyin. Abs FACS tamponu içinde 30 ul hücre süspansiyonu için 2 | il / Ab bir hacimde ilave edilmelidir. </li><li> 30 boyunca 4 ° C&#39;de bir hücre süspansiyonu inkübemin. Adım 2.13 &#39;de tarif edildiği gibi inkübe edildikten sonra, FACS tamponu ile iki kez 10 ml hücreleri yıkayın. </li><li> FACS tamponu 4 x 10 7 cells/40 ul bir son konsantrasyon elde etmek için hücrelere tekrar. Hücre süspansiyonu her bir 40 ul başına keçi anti-fare IgG mikroboncuk manyetik 20 ul ekle. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Adım 2.13 &#39;de tarif edildiği gibi FACS tampon maddesi 10 ml hücreleri yıkayın. </li><li> FACS tampon maddesi içinde 500 ul içinde 10 8, kemik iliği hücreleri kadar yeniden süspanse edin. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir hücre ayırma MidiMACS üzerine bir MACS kolonu LD yük ve 2 ml FACS tamponu ile sütun Ön yıkama. </li><li> FACS tampon maddesi içinde 2.5 ml 5 x 10 8 hücrelere kadar yükleme, kolona kemik iliği hücre süspansiyonu uygulanır. Bir toplama tüpü (15 ml konik tüp) sağlamak sütununun altına yerleştirilir. Sütunu FACS tampon / yıkama, 2 ml ile 3 kez yıkanır ve için zenginleştirilmiş olacak sütun geçmesine hücreleri toplamaksoy-negatif hücrelerdir. Kolondan akıtılan malzeme hücrelerinin (yıkama-through) sayılır. </li><li> FACS hematopoetik progenitör altkümelerin pozitif seçim gerçekleştirmek için, aşağıdaki floresan konjuge Abs ile leke hücreler: IL-7&#39;yi (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs artı CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 ve Ter119 (tüm PerCP Cy5.5 ile etiketlenmiş) karşı soy işaretleyici antikorların bir karışımı olabilir. 100 ul&#39;lik bir toplam hacimde her Ab&#39;nin 0.5-1 ul kullanın. 20-30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir hücre süspansiyonu inkübe edin. </li><li> FACS tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon ve adım 2,13 gösterildiği gibi x 10 7 hücre / ml &#39;, 2-3 arasında bir konsantrasyonda hücreler yıkayın. Hücre kümeleri kaldırmak için 35 mikron hücre süzgecinden kap tüp aracılığıyla hücrelerini filtre. Bu son adım FACS makineyi tıkanmasını önlemek için çok önemlidir. </li><li> FACS sahnede bir FACS tüp içinde hücre süspansiyonu yerleştirin ve CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sıralamak üzerineBelirtilen işaretleyici profilinin temeli. Tam RPMI içinde 5 ml ihtiva eden bir 15 ml tüp içinde saflaştırılmış hücreleri toplamak. </li><li> FACS çalışma sonunda kriteri hücrelerinin mutlak sayısı kaydedilir. Adoptif transfer deneyleri için steril PBS içinde tekrar süspansiyon ve adım 2,13 gösterildiği gibi santrifüj ile hücreler Pelet. </li></ol> 4. CDP evlatlık transferi Bu adım, tipik olarak, alıcı farenin yerleştirilmiştir hayvan tesisinde yapılır. FACS makinesinin bulunduğu yere bağlı olarak, önce adoptif transfer etmek için hayvan tesisine içine saflaştırılmış progenitör hücre popülasyonlarının taşınmasını içerebilir. Progenitör Hücre süspansiyonları steril tutulur ve buz üzerinde taşınmalıdır. <ol><li> 100 ul steril PBS toplam hacim içinde 10 5 saflaştırılmış CDP seyreltilerek enjeksiyon için hücre süspansiyonları hazırlayın. Bir 27 G iğne bağlanmış bir şırınga içinde hücre süspansiyonu yerleştirin. </li><li> Alıcı Açığa IFNAR - / - </sup&gt; kuyruk damarından enjeksiyon etkili elde etmek için 5-10 dakika için bir ısıtma lambası için farenin (CD45.2 +). </li><li> Bir süzgeç cihaz fare yerleştirin ve% 70 etanol ile kuyruğunu dezenfekte. </li><li> Bir 27 G iğne kullanılarak kuyruk damarının içine 100 ul PBS içinde 10 5 FACS-arıtıldı CDP enjekte edilir. </li><li> Kuyruk ven enjeksiyon hiçbir zararlı etkisi vardır sağlamak için 15-30 dakika süreyle fareler izleyin. Konut tesisine fareler dönün. </li></ol> 5. PDC PP ve Ölçme İzolasyonu Tutarları <ol><li> Evlatlık transferi sonrası 7-10 gün sonra, alıcı fareler euthanize. Yavaşça diseksiyon tarafından fareyi açın ve bağırsak maruz. </li><li> Tüm bağırsak çıkarın ve PBS-ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin. Ince forseps ve makas kullanılarak ince bağırsak duvarı boyunca tüm görünür pps toplayın. C57BL6 ve IFNAR&#39;ın - / - fareler genellikle bulundu izole lenfoid follikül farklı 5-10 PP / fare varince bağırsakta 18 boyunca. PPs yüzden dikkatli tüm PPs tespit ve disseke sağlamak, hatta tek bir fare içinde genellikle yapısal olarak farklı olduğunu unutmayın. </li><li> PBS içeren bir Petri kabındaki pps yerleştirin ve dışkı çıkarmak için forseps kullanabilir. PPS temizlemek için iki kez bu işlemi tekrarlayın. </li><li> 50 ml 10 mi 1 x Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içerisinde 1 mg / ml kollajenaz IV Digest PPs 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırılarak şişeye </li><li> Steril bir şırınga pistonu ile süzgeç ile 40 um hücre filtresi ve kuvvet hücrelerin üst bölmeye dijeste PP yerleştirin. Bir 15 ml konik bir tüp içinde PP hücre süspansiyonu toplayın. </li><li> % 37 Percoll çözeltisi (RPMI ortamı içinde% 37 Percoll) 6 ml ve 5 dakika tekrar süspansiyon için 500 x g&#39;de santrifüj ile gergin PP Pelet hücreleri. Yavaşça bir Percoll basamaklı bir derece oluşturulması için, hücre süspansiyonu, alt (RPMI ortamı içinde% 70 Percoll)% 70 Percoll çözeltisi 6 ml yerleştirin. </li><li> 20 dakika için a Santrifüj hücrelerisantrifüj kopmak ile 800 xg t. Mononükleer hücreler, 37/70% arayüzü göç edecektir. Santrifüj işleminden sonra, tek çekirdekli hücre popülasyonu arayüz bölgesinde dikkatli pipetleme toplanmalıdır. Pellet santrifüj ile hücreler toplandı ve tam RPMI / yıkama 50 ml iki kez yıkayın. Büyük hacimli bir Percoll tam olarak çıkarılmasının sağlanması için kullanılır. </li><li> CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE: adoptively transfer atalarıdır (CD45.1 +) veya alıcı farelere (CD45.2 +) türeyen kemirgen PDCS algılamak için aşağıdaki antikorlar ile toplanan PP hücreleri leke . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) ve PDCA-1 (FITC) Abs. Adım 3.9 ve 3.10 &#39;da belirtildiği gibi PP hücrelerin akış sitometrisi analizi yapın. Onların CD11c&#39;nin + CD11 tarafından PDCS tanımak - B220 + Siglec-H + PUKÖ-1 + fenotip. % PDC x için: Mutlak pDC sayısı aşağıdaki denklem ile tespit edilebilirtal PP hücre sayısı = PP PDCS. </li></ol>

<ol>
	<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+monocytes+migrate+to+inflamed+lymph+nodes+and+produce+large+amounts+of+type+I+interferon.">Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon.</a> Nat. Med. 5 (8), 919-923 .</li><li>Siegal, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+the+principal+type+1+interferon-producing+cells+in+human+blood.">The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood.</a> Science. 284 (5421), 1835-1837 .</li><li>Asselin-Paturel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology.">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .</li><li>Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Peyer's+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+(pDCs)+produce+low+levels+of+type+I+interferons:+possible+role+for+IL-10,+TGFbeta,+and+prostaglandin+E2+in+conditioning+a+unique+mucosal+pDC+phenotype.">Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype.</a> J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+role+for+IFN-alpha-STAT1+signals+in+regulating+murine+Peyer+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+and+conditioning+an+inflammatory+response.">Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response.</a> Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).</li><li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3.">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 .</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+dendritic+cell+development+and+homeostasis.">In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> 8 (11), 1217-1226 .</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+differentiation:+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells.">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121 (1), 11-19 .</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPbeta+is+required+for+'emergency'+granulopoiesis.">C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis.</a> Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+and+antitumor+effects+of+IL-23+as+a+cancer+vaccine+adjuvant.">Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant.</a> J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).</li><li>Cervantes-Barragan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+control+T-cell+response+to+chronic+viral+infection.">Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).</li><li>Goubier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+mediate+oral+tolerance.">Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance.</a> Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).</li><li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Sci. Transl. Med. 3 (73), .</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent,+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice.">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li><li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+IgA+synthesis:+regulation+of+front-line+body+defences.">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).</li><li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development.">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li><li>Blasius, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+antigen+2+is+a+specific+marker+of+type+I+IFN-producing+cells+in+the+naive+mouse,+but+a+promiscuous+cell+surface+antigen+following+IFN+stimulation.">Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation.</a> J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).</li><li>Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Th17+cells+in+the+gut+pathogenic+or+protective.">Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective.</a> Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

(- / - Fareler örneğin IFNAR) açıklanan adoptif transfer tekniği, PP pDC&#39;lerde eksikliği olan alıcı farelerde PP pDC nüfusa CDP katkısını değerlendirdik. Gelecekteki deneylerde, bu PP PDCS Flt3 + CLPS türeyen olsun, özellikle PP PDCS üreten diğer öncül altkümelerin potansiyelini değerlendirmek için önemli olacaktır. Bu soru PP PDCS PP tahakkuk 5 için IFNAR&#39;ın-STAT1 sinyallere benzersiz duyarlı neden belirsizliğini korumaktadır öneml...

Burada, biz ortak dendritik hücre atalarıdır (CDP) Peyer yama (PP) de plazmasitoid dendritik hücre (PDC) nüfus sebebiyet verme yeteneğine sahip olup olmadığını değerlendirmek için bir protokol göstermektedir. Bu yöntemi kullanarak genel amacı Peyer yama (PP PDC) içinde pDC&#39;lerde gelişimsel düzenleme değerlendirmektir. Bu önemli bir nedeni, PP PDC kemik iliği, kan ve dalak dahil olmak üzere diğer dokularda bulunan pDC&#39;lerde farklıdır ve bu nedenle PP PDC ve diğer pDC nüfus gelişimsel ve / veya işlevsel olarak ilgili olup olmadığı açık olmasıdır. Özellikle, PDCS yaygın ben Toll-benzeri reseptör 7 ve hızlı IFN salgı 1-3 9 (TLR7 / 9) uyarısına yanıt, hematopoetik sistem içinde (IFN) üreticileri interferon ana türü olduğu için bilinir. Bununla birlikte, PP PDC I TLR agonist uyarma 4,5 &#39;tepki olarak IFN tipi üretiminde eksikliği vardır. Ayrıca, PP PDC aynı zamanda kemik iliğinde ve dalak bulunan pDC&#39;lerde farklılıktüründen sinyallerini gerektiren I (IFN) reseptörü (IFNAR 1) interferon ya da IFN gelişim ve / veya birikim 5 için molekül STAT1 işaret etmektedir. Bu veriler farklı düzenleme mekanizmaları diğer organlarda pDC&#39;lerde karşı PP PDC (örneğin kemik iliği, dalak) kontrol 5 ihtimalini sürmüşlerdir. Bu yöntemin gelişmesine yol açmıştır gerekçe dendritik hücre (DC) biyoloji anlamada son gelişmeler üzerine dayanıyordu. En önemlisi, hepsi değilse de, alt-gruplar DC FMS benzeri tirozin kinaz 3 reseptörü (Flt3) 6-10 ifade hematopoietik öncü hücrelerden elde, ancak DC gelişme klasik miyeloid ve lemfoid yollar ile sınırlı değildir. Örneğin, Flt3 + ortak miyeloid atalarıdır (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) doğuran, hangih daha pDC&#39;lerde ve konvansiyonel DClerin (CDCS) 9,10 içine ayırt. Buna karşılık, Flt3 + ortak lenfoid progenitorlar (CLPS, lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) pDC&#39;lerde 11 içine öncelikle gelişir. Bu nedenle, önce yapılan çalışmalar, normal analiz kemik iliği, dalak ve / veya kan pDC alt-sınırlı olmasına rağmen PDC, Flt3L düzenlemesi altında, en az 2 ayrı hematopoietik projenitör popülasyonlarından ortaya göstermektedir. Böylece, PP PDCS üretir progenitör nüfus (ler) soruşturma gereklidir. PP pDC&#39;lerde kökenlerini anlamak diğer pDC nüfusa sahip yaygın gelişimsel yolları paylaşmak konusunda ışık tutacak, ya da PP kendi üretimi sırasında farklı mekanizmaları kullanacak. Burada tarif edilen benzersiz bir yaklaşımın avantajı, hematopoietik progenitörlerin adoptif nakli için alıcılar olarak PP pDC&#39;lerde ciddi bir eksiklik göstermektedir farelerin kullanılmasıdır. Gen sahip olan fareler,gen kodlama tlc silme IFNAR1 (IFNAR - / - fareler) veya STAT1 (STAT1 - / -) PP pDC&#39;lerde 5 çarpıcı bir tükenmesi saptandı. Bu nedenle, bu suşlar adoptif transfer çalışmalar, öldürücü ışıması gibi kuvvetli hücre ablasyon rejimlerin yokluğunda gerçekleştirilebilir sağlayan, PP PDC azalır bir ortam sağlar. Burada sunulan yöntemin bir ek kuvvet Flt3L yükseltilmiş dolaşan miktarlarda teşvik etmek için hidrodinamik gen transferi (hg) kullanılmasıdır. Bu, yeniden birleştirici proteinin püskürtülmesiyle, karşı in vivo Flt3L uyarılması için uygun maliyetli bir yaklaşım sağlar. Laboratuarımızda de dahil olmak üzere çok sayıda çalışma, deneysel koşullar 5,12,13 çeşitli miktarlarda sitokin indükleme Hgt kullanmışlardır. DClerin için emek ve hassas bağışıklık fonksiyonları bölümü immünoloji büyük ilgi olduğunu. Özellikle, PDC oral tolerans ve sistemik anti-viral önemli aracılarıdırtepkiler, ancak aynı zamanda otoimmün ve kanser 14-17 gelişmesi ve devam etmesi için katkı görünmektedir. Burada açıklanan protokol PP PDCS düzenleyen gelişim mekanizmaları daha tam olarak keşfedilmeyi olmasını sağlayacaktır. Ayrıca, bu yaklaşım çalışmalar PP pDC fonksiyonunu değerlendirmek için izin verebilir, ve santrallerin içindeki diğer bağışıklık nüfus düzenleme ve işlevini anlamak için uzatılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">664</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">B6.SJL</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">2014</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">11875-093</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352070</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile surgical tweezers</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile small pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile large pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352340</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352235</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RBC lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">R7757</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:260px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Percoll</td>
			<td style="width:201px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:177px;">17089102</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10XHBSS</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4641</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:201px;">Worthington</td>
			<td style="width:177px;">LS004188</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Goat ant-rat IgG microbeads</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-048-501</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LD column</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-042-901</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-D3</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">555273</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD19</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553783</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11b</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553308</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11c</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553799</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-Ter119</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553671</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD3 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0031</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD19 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0193</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11b (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-F4/80 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-4801</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Ter119 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-5921</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Sca-1 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-5981</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD115 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">17-1152</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-c-kit (APC.Cy7)&#160;</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">47-1171</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-1271</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Flt3 (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-1351</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.1 (APC.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">560579</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.2 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">Biolegend</td>
			<td style="width:177px;">109830</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-B220 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-0452</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Siglec-H (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-0333</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-PDCA-1 (FITC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">Nov-72</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">e.g. BD Fortessa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heat lamp</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">309602</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">27&#189; G needles (sterile)</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">305109</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the development of murine plasmacytoid dendritic cells in peyer's patches using adoptive transfer of hematopoietic progenitors

Bu protokol, bağırsak Peyer yama (PP) in plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) oluşturmak üzere saflaştırılmış hematopoietik progenitörlerin yeteneğini analiz etmek için bir yöntemi göstermektedir. Ortak dendritik hücre progenitörleri (CDP, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) FACS ile C57BL6 farelerin kemik iliğinden arıtıldı ve PP önemli bir nüfus pDC eksikliği alıcı farelere transfer edilmiştir, bu durumda, IFNAR / - - fareler transfer alıcı olarak kullanılmıştır. Bazı farelerde, dendritik hücre büyüme faktörü Flt3 ligandı (Flt3L) aşırı ifadesi Flt3L kodlayan plazmidin hidrodinamik gen transferi (hg) kullanılarak, CDP aktarımını EVLAT EDİNEN önce uygulanmıştır. Flt3L aşın transfer (ya da endojen) hematopoietik öncü kaynaklı DC popülasyonları genişler. Projenitör transfer edildikten sonra 7-10 gün sonra, adoptif transfer öncü hücrelerden meydana PDC üzerinde alıcı hücrelerden ayırt edilditransfer CDP + CD45.1 olmak ve alıcıların CD45.2 + olmaktan pDC&#39;lerde ile CD45 işaretleyici ifade, temeli. PP pDC nüfusa katkıda bulunmak ve Flt3L yanıt transfer CDP yeteneği alıcı farelerden PP tek hücre süspansiyonları akış sitometrisi ile değerlendirildi. Bu yöntem, diğer projenitör popülasyonları PDC PP üretme yeteneğine sahip olup olmadığını test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım HGT yoluyla dolaşımdaki sitokinler manipüle ederek varsayılan gelişim faktörü ve / veya uygun bir yere serici, nakavt veya aşın progenitör kümelerine aktararak, PP pDC gelişimini etkilediği tahmin edilmektedir faktörlerin rolünü incelemek için kullanılan olabilir . Bu yöntem aynı zamanda PP PDCS santrallerin diğer bağışıklık altkümelerin frekansını veya fonksiyonlarını nasıl etkilediğini analiz izin verebilir. - / - Fareler, oldukça tüketilmiş PP PDC yabani tip hayvanlara kıyasla, bu nedenle allowi göstermektedir, bu yöntemin benzersiz bir özelliği IFNAR kullanılmasıdıröldürücü radyasyondan sonra karıştırıcı etkilerin yokluğunda PP PDC ng yeniden oluşturma.

Sonuçlarımız Protokolleri 2 ve 3&#39;te detaylı olarak, fare kemik iliği hücrelerinden CDP izolasyonu (Şekil 1) için bir strateji yolluk gösterir. CDP toplam kemik iliği hücrelerinin yaklaşık% 0,1 ihtiva eder ve yaklaşık 4-6 x 10 4 CDP bir fareden izole edilebilir. Evlatlık transferi üzerine, CDP pDC&#39;lerde ve CDCS 10 içine ayırt. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upl...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors at JoVE.com

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

11.1K Görüntüleme.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır. 

Video: Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...