Biz tartışmalar ve yazının okunması için teknik yardım ve Lianfeng Wu Michael Kacergis teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH / NIDDK (AAS için K08DK087941), bir NIH / NIDDK eğitim bursu (ECP 5T32DK007028), Yaşlanma Ödülü (AAS için) Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar ve Charles H bir kariyer geliştirme ödülü tarafından desteklenmiştir . Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü (AAS için).

1. Dikdörtgen Amp / Tet (A / T) LB Agar Plakalar ve NGM IPTG RNAi Plakalarının Hazırlanması A / T plakalar 4 ° C&#39;de kullanmak için 1-4 hafta öncesinde hazırlanan ve karanlıkta saklanmalıdır <ol><li> Ortam sıcaklığında 1 litre için 1 L deiyonize su, 32 g LB ağar, 1.5 ml 2 M NaOH ve 2 g Bacto Agar ekleyin. Sıvı döngüsü 40 dakika otoklav. 60 ° C&#39;a soğutmadan sonra, 3 ml tetrasiklin ve 0.5 ml ampisilin ilave edin. Her plaka içine medya 45 ml dökün. </li></ol> Önceden en fazla 2 hafta RNAi plakaları 96-3 gün hazırlayın. <ol start="2"><li> 1 L deiyonize su, 3 g NaCl, 17 g agaroz, ve 2.5 g bactopeptone: 25 96-kuyu RNAi levhalar dökmek için, nematod büyüme ortamı (NGM) 1 L hazırlanır. 121 Otoklav sıvı döngüsü ° C bir karıştırma çubuğuna sahip 40 dakika için. 60 ° C&#39;ye kadar sıcak plaka sette karıştırarak, soğumaya bırakın </li><li> 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KH 2: zaman 60 ° C&#39;ye kadar soğutulur, aşağıdaki stok çözeltileri eklemek </sub&gt; PO 4 (pH 6.0), 1 ml 1 M CaCI2, 1 ml 200 mg / ml karbenisilin ve 5 ml 1 M IPTG (tarifleri için malzemeler tabloya bakınız). </li><li> Elektronik kanallı pipet kullanarak bir düz dipli 96-plaka her kuyuya RNAi medya 150 ul dağıtın. Hava kabarcıkları kaçının. Dağıtım sırasında 60 ° C su banyosuna batırılır steril bir paslanmaz çelik kap içinde medya tutun. </li><li> Agaroz katılaşır kadar RNAi plakalar düz tutun. Plakalar önceden 2 hafta kadar dökülmüş ve 4 ° C&#39;de saklanır </li></ol> 1. Gün 2. Dikdörtgen Amp / Tet (A / T) LB Agar Plakalar üzerine Dondurulmuş Kütüphane Tabaklar Damga <ol><li> Karanlık içinde tutulması, oda sıcaklığında, bir A / T plakaları ısıtın. </li><li> -80 Transfer 96-sıra RNAi kütüphane plakaları ° C buz kurutun. Bir Bunsen beki yakın alüminyum-mühürlü plaka açın. </li><li> % 10 çamaşır suyu (10 sn her) seri işaretçilerine daldırarak bir 96-pin çoğaltıcı sterilize,% 70 E H 2 O deiyonize veToh bir bir alev ile işaretçilerine geçirerek izledi. EtOH ve alev adımı yineleyin. </li><li> Her pin kontaklı her çukurun yüzeyine emin, dondurulmuş 96-RNAi gliserol stok çoklayıcıyı uygulayın. </li><li> Zarar agar yüzeyinden olmadan her iğne ile küçük bir daire çizerek, A / T plaka üzerine Damga. </li><li> -80 Yeniden mühür ve getiri kütüphane plakaları ° C. Inkübe 37 bakteri büyümesi için ° C&#39;da gece boyunca A / T plakaları damgalı. </li></ol> 2. Gün 3. Derin Kuyu Blokları Gecelik RNAi Bakteriyel Klonlar büyütün <ol><li> 37 ° C A / T plakaları çıkarın ve bakteriyel büyüme onaylayın. </li><li> 200 ug / ml karbenisilin ile LB 1.5 ml bir 96-kuyucuklu derin kuyu bloğun her kuyuya doldurun. </li><li> 96-pin çoğaltıcı (adım 2.3) sterilize edin. </li><li> Emin işaretçilerine Her bakteriyel RNAi klon temas yaparak, A / T plakasının üstüne çoklayıcıyı uygulayın. Derin kuyu bloğa çoğaltıcı ve batırmayın işaretçilerine kaldırın. Girdap, ve yavaş yavaş ce yapım, kaldırmakkomşu kuyuları kontamine etmemek rtain. </li><li> Nefes kolay film blok Seal. 37 gece inkübe ° C ajitasyon (MT Infors Microtiteron II tercih shaker, veya 25 mm-throw sallayarak inkübatör içinde 250 rpm 950 rpm). </li></ol> 3. Gün 4. 96-NGM RNAi Plakalar üzerine Tohum RNAi Bakteriyel Klonlar <ol><li> 4 ila 96 oyuklu plakalar RNAi kaldırma ° C ve oda sıcaklığına ısıtın. </li><li> Derin kuyu blokları çıkarın ve 4.000 x g&#39;de 10 dakika santrifüj. </li><li> Hızla medya drenaj lavabonun içine blokları ters ve aşırı ortam ortadan kaldırmak için kağıt havlu üzerine ters damga. </li><li> Bir laminer akış kaputu altında, steril film ile her iyi ve mühür ile 200 mg / ml karbenisilin ile LB 40 ul ekleyin. </li><li> 10 dk pelet tekrar süspansiyon, veya elle dikkatli pipetleme ile pelet tekrar süspansiyon oda sıcaklığında bakteriyel çalkalayıcı blokları dönün. </li><li> Laminer akış kaputu, gelen derin-steril filmi ve transfer bakteri kaldırmak96-RNAi plakalar üzerine de bloklar. Diğer tüm satırlar satır &#39;A&#39; ve &#39;H&#39; ve 35 ul yeniden süspanse bakterilerin 40 ul ekleyin. Daha fazla sıvı saçınızın aşırı ve agaroz çatlamasını önlemek için, 96-kuyu RNAi levha kenarına oyuklara ilave edilir. </li><li> Kuruluk için düzenli teftiş, 4-6 saat için kaputu kurumasını ortaya plakaları bırakın. Kuru bakteriler bulutlu değil, açık görünür. Kapak, plakalar ters ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li></ol> 5. Worms bir Senkron Nüfus hazırlayın Birçok gebe kurt ile doldurulmuş iki adet 10 cm tabak her 6 96 oyuklu plakalar RNAi için yumurta hazırlanması için kullanılır. Solucanlar en az iki nesil (7 gün) olmayan düşkünü olduğundan emin olun. <ol><li> Daha önce 20 açıklandığı gibi L1 senkron bir nüfusa hazırlayın. Ağartıcı çözelti, 20 ml için, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml H2O deiyonize su, ve 10 ml tampon M9 4 ml ağartıcı kullanır. </li><li> 15 ml steril 10 ml M9 içinde gece boyunca kurt senkronize20 polipropilen tüp dönme ° C </li></ol> 4. Gün 6. RNAi Plaka Worms ekle <ol><li> 1 dakika için 3000 xg&#39;de yumurta preparatlarıyla santrifüjleyin. L1 yavru pelet uzak durarak, süpernatant aspire. 0.0005% Triton X-100 ile 5 ml M9 tampon süspanse edin. Deterjan küçük bir miktarının eklenmesi pipet yapışmasını önler ve kurt yağ boyama üzerinde hiçbir etkisi yoktur. </li><li> Bir mikroskop altında solucanlar sayın. Gerekirse, mikrolitre başına 10-15 solucanlara konsantrasyonunu ayarlayın. </li><li> Laminer akış Hood, tohumlanması için her bir 96 kuyulu plaka için, bir sığ-kuyu tahlil bloğun bir sıra her oyuğuna yeniden süspanse solucanların 75 ul ilave edin. Bir kılavuz çok kanallı bir pipet kullanılarak, 96 gözlü levhalar RNAi her oyuğuna 5 ul içinde 50-75 solucanlar ekleyin. </li><li> Plakaları 30 ila 60 dakika kaputu kurumasını bekleyin. Kuru, mikroskop altında, solucanlar dayak değil, emekleme gibi görünmelidir. </li><li> RNAi plakalar üzerinde solucanlar büyütün20 ° C ~ 64 saat boyunca. </li></ol> 7. Gün 7. Fix ve Nil Kırmızı Worms Leke <ol><li> Inkübatör RNAi plakaları çıkarın. Bu koşullar yağ kütlesi etkileyecek gibi, mikroskop ve kayıt aç ya dayak (ıslak) daha fazla analiz çıkarmak kuyu altında inceleyin. </li><li> Bir elektronik tekrar pipet kullanarak, 150 ul PBS% 0.01 Triton ekleyin bir RNAi plakanın her X-100. 96-derin kuyu PCR plate karşılık gelen satır için solucanlar ile manuel çok kanallı pipet, mix ve transfer sıvı ile. Agar bozan kaçının. Kuyu başına PBS 300 ul solucanlar toplam tekrarlayın. </li><li> Dört tabak transfer edildiğinde, 1 dakika boyunca 500 rpm&#39;de plakaları santrifüj. </li><li> Kuyunun dibinde ~ 25 ul sıvı ve solucan pelet bırakarak, bir 96-pin vakum aspiratörü kullanarak süpernatant aspire. </li><li> Hayvanlar düzeltmek için her bir kuyunun izopropanol 40% 150 ul ekleyin. Solucan karıştırmak için yeterince yüksek bir hızda pipet olduğundan emin olun% 40 izopropanol ile pelet. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Santrifüj plakaları 1 dakika için 500 rpm&#39;de ortaya çıkardı. </li><li> Kuyunun dibinde sadece 25 ul% 40 izopropanol + solucan pelet bırakarak, bir 96-pin aspiratör veya elle kullanarak süpernatant aspire. </li><li> % 40 izopropanol 0.5 mg / aseton ml 1 ml başına 6 ul Nil kırmızı stok solüsyonu: Her iyi için, kullanımdan hemen önce hazırlanan Nil kırmızısı boyama çözeltisi 150 ul ekleyin. </li><li> Seal non-steril yapışkan film ile plaka ve en az 2 saat süreyle karanlıkta leke. </li></ol> 8. Yüksek throughput Mikroskop üzerine Yıkama ve Görüntü Worms <ol><li> 1 dakika boyunca 500 rpm&#39;de santrifüj ve Nil kırmızı boya tüm ama 25 ul aspire. </li><li> Ile% 0.01 triton en az 30 dakika boyunca karanlıkta ve her bir kuyu deposu için X-100. PBS içinde 150 ul ekle </li><li> 1 dakika boyunca 500 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> 2 x 7 ul pratik Her kuyunun dibinde bir 12 kanallı pipet, aspirat hayvanları kullanmaBir 96-Teflon baskılı cam slayt üzerine felç ve dağıtmak. Dikkatlice, solucanlar çıkarmadan, slayt her kuyudan PBS 9.5 ul çıkarın. Sizin cam slayt mikroskop monte doğrudan uymuyorsa, özel işlenmiş alüminyum slayt tutucu solucanlar monte etmek için kullanılmalıdır. </li><li> 96-slayt üzerine yavaşça alt kapağını slayt. Bu adım kabarcıkları önlemek veya diğer kuyulara solucanlar üzerinde çapraz için bazı pratik alabilir. Yapışkanlı tack ile Güvenli köşeleri. </li><li> Bir GFP / FITC filtresi ile parlak alan ve floresans Görüntü slayt otomatik mikroskop ayarlanır. Photobleaching kuyuları arasındaki suni farklılıklar doğuracağını gibi lipid sinyal ağartıcılar kolayca bu yüzden değil, elle, tüm kuyularda sistematik bir şekilde yansıması olmalıdır. Analizi ile ilgili daha fazla bilgi için Temsilcisi Sonuçlar ve Tartışma bakın. </li></ol> 9. Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE) ve Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC / MS) kullanarak Biyokimyasal Lipid Belirlenmesi <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Nil kırmızı flüoresans göre lipid doğrulanması için, gaz kromatografi analizi kütle spektrometresi (GC / MS) tarafından takip triaçilgliseroller (TAG) ve fosfolipid (PL) dan elde edilen yağ asidi metil esterleri (FAME) üzerinde gerçekleştirilebilir solucan granül. Organikler içeren Adımlar davlumbaz altında yapılmalıdır. Bakım onlar oksidasyona karşı çok hassas oldukları gibi lipidler genişletilmiş depolama veya İnkübasyon sırasında ışıktan korunmalıdır azot altında tutulmasını alınmalıdır. 2,500-5,000 senkron hayvanlardan Sonsuz granül, hayvanların 10 cm RNAi plakaları üzerinde büyütülmüş ve haricinde, yukarıda tam olarak hazırlanmış, girdi olarak kullanılır. <ol><li> 15 ml konik polipropilen tüp içine 10 ml M9 tamponu ile her 10 cm plaka 2,500-5,000 solucanlar yıkayın. Pelet bir dakika boyunca 500 xg&#39;de solucanlar, ve 10 ml M9 tamponu ile tekrar pelet yıkayın. 500 x g hızında Pelet hayvanlar. Azot fo altında -80 sıvı azot ve mağaza 250 ul toplam hacim, ve ya donma ° C çıkış aspirer daha sonra işleme veya doğrudan devam. </li><li> Solucan topak trigliserid kütle fosfolipid kütle 8,13,21 normalize edilmesi için ise 9,3 doğrudan adım alınabilir. Araştırmacı protein içeriği veya DNA içeriği normalleştirme arzu Ancak, solucan pelet 10 dak, 4 az 30 saniye, 30 saniye kapalı ° C bir banyo sonikatör en yüksek yoğunluğa sonike olmalıdır Protein veya DNA normalleştirme arzu edilirse, bir 5 ul alikot kaldırmak ve bir UV spektrofotometre kullanılarak kolon saflaştırmadan sonra, bir Bradford reaktif ya da benzer ya da toplam DNA içeriği kullanarak toplam protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Bir dişli borosilikat cam tüp içinde metanol: 1.5 ml 02:01 kloroform solucanlar ekleyin. Organik çözücülerin Tüm transfer cam pipet kullanılarak yapılması gerekir. </li><li> Bir wiretrol 50 ul pipet kullanarak, 50 ul 25 nM fosfolipid standart ve 50 ul 16.7 nM trigliserid standart ekleyin. Her iki standart 02:01 kloroform içinde çözülmüştür edilmelidir: metanol, sıkıca kapatılmışve oksidasyon önlemek için -80 ° C derin dondurucuda ışıktan azot altında saklanır. </li><li> Fenolik kap ve vorteks ile Cap. Her 15 dakikada bir vorteks, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de santrifüj. Borosilikat kültür tüpüne leşleri olmadan düşük organik faz aktarın. </li><li> 0.3 ml% 0.9 NaCl, 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de vorteks ve santrifüj ekleyin. </li><li> Sulu faz herhangi birinin üzerine aktarmak için değil emin olun, taze bir borosilikat kültürü tüp alt organik tabaka aktarın. </li><li> Azot altında kuru organik faz. Başlamak için katı faz ekstraksiyonu (SPE) 1 ml kloroform içinde kurutulmuş lipid tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, fosfolipid sınıfları, glikolipitler, spingolipitler, diasilgliseroller, triaçilgliserol, serbest yağ asitleri ve kolesterol esterleri gibi farklı lipit sınıfları, detaylı ayrılması ve analizi için, ince tabaka kromatografisi gibi C. Watt laboratuvarı tarafından öncülük elegans 22 SPE yerine kullanılabilir. Lipidler b de olabilirE HPLC ve GCMS analiz kesirler ile ayrılır. Liquid-chromatography/MS (LCMS) ile bütün-lipidome profillerinin gelişmiş yöntemler de 23-26 kullanılabilir. </li><li> SPE manifoldu üzerine silika SPE kolonundan birleştirin. 3 ml kloroform ile Pre-muvazene sütun. Yerçekimi ile akmasına çözücü izin verin. </li><li> Ilk fraksiyon (TAG fraksiyonu) bir parçası olarak bir dişli borosilikat tüp içinde akış yoluyla toplanması, SPE kolona lipit örneği yerleştirin. En nötral lipidler bu ilk 1 ml akan yoluyla gelecektir. Tam TAG fraksiyonu tüp akan toplama, TAG fraksiyonu Zehir 3 ml kloroform ekleyin. </li><li> Çıkarın ve ilk toplama tüpünün kap ve temiz bir toplama tüpüne ile değiştirin. Metanol 9:1, 5 ml aseton ile Glikosifingolipidler Zehir. Biz rutin bu fraksiyonun yağ asidi kompozisyonu analiz etmezler, ancak değerli bilgiler içerebilir ve kullanan daha fazla analiz için metil esterleri ve ücretsiz sphingoid üsleri hazırlanması için kaydedilebilirDaha önce 27 açıklandığı gibi TAG ve PL için bu farklı özel prosedürler. </li><li> Ikinci bir dişli borosilikat toplama tüpü ile glycosphingolipid toplama tüpü değiştirin. 3 ml metanol (PL fraksiyonu) ile fosfolipidlere Zehir. </li><li> Kesirler -80 ° C de azot altında sıkıca kapatılmış bu noktada saklanabilir. Azot altında lipidler saflaştırılmış Kuru. 33 bir kuru ısıtma bloğu, kurutma hızlandırmak için ° C Bunlar kurutulmuş halde oksidasyon için özellikle duyarlı olduğu gibi, kurutulmuş formda depolamak lipidler asla. </li><li> Vorteks ve inkübe tarafından metanol içinde 2 ml% 2 H 2 SO 4 süspanse kurutulmuş lipid fraksiyonları FAME oluşturmak için 55 ° C su banyosunda sıkıca gecede şapkalı. Bakım Bu büyük ölçüde lipit türevlendirme inhibe olacak gibi FAME reaksiyon kesinlikle hiçbir su almak için alınmalıdır. Biz bir gecede inkübasyon daha verimli türevlendirme bulduk ve Literatür az lipid oksidasyonu düşük sıcaklıklarda oluşur During FAME hazırlık 28. Bir alternatif ve daha hızlı bir metod metanol içinde 2 ml% 2.5 H 2 SO 4 ve 70 ya da 80 ° C &#39;21,22,29 azından bir saat için türevlendirmek için. </li><li> Ertesi sabah, banyo kaldırmak ve soğumasını bekleyin. Her bir TAG ve PL fraksiyonu daha sonra 1.5 ml H2O (reaksiyon gidermek için) ve 0.3 ml hekzan (FAME elde etmek için) ekleyin. Shake şiddetle ve 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Çok dikkatli bir standart pipet veya Pasteur pipeti kullanarak sadece üst hekzan katmanı kaldırın. Otosampler tüp içine dağıtın. Bu GC sütunu ve MSD yok edecek gibi herhangi asitlendirilmiş metanol dahil değildir emin olun. </li><li> GC / MS üzerine Cap ve yük örnekleri. Örnek bir PTFE-silikon-PTFE vidalı kapaklı şapkalı bir mikro-insert Agilent şişeye hekzan aktarılır. Bu Supelcowax-10 (24079), 30 metre, 250 mikron erimiş silis kolonu ile donatılmış Agilent GCMS modeli 6890/5973N aktarılır. Bir mikrolitre enjekte edilir intoa splitless girişinde 250 ° C ve 13.33 PSI Ultrasaf Helyum taşıyıcı gazı kullanılır ayarlayın. Protokol çalışma olarak dakika başına sabit bir 1 ml aşağıdaki gibidir: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Talimat </td><td> Hedef Sıcaklık </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 dakika tutun </td><td> 150 ° C </td></tr><tr><td> 2 </td><td> ° C başına min Rampa 10 </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 4 dakika tutun </td><td> 200 ° C </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Rampa 5 ° C başına min </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 3 dakika tutun </td><td> 240 ° C </td></tr><tr><td> 6 </td><td> ° C başına min Rampa 10 </td><td> 270 ° C </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 5 dakika tutun </td><td> 270 ° C </td></tr></tbody></table> 3 dk çözücü gecikme fil üzerinde aşınmasını azaltmak için MSD sırasında kullanılırAment. Bundan sonra, 50 ve 550 dalton arasında kütlelere 270 termal Yardımcı ° C ile 150 ° C ve 230 ° C&#39;de belirlenen ms kaynağında MS dörtlü set ile tespit edilir

<ol>
	<li>Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+ubiquitous+fat+storage+organelles+in+C.+elegans.">Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans.</a> BMC Cell. 11, 96 (2010).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.+Toxicological+Sciences:+An+Official.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official.</a> Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).</li><li>Ashrafi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+fat+regulatory+genes.">Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes.</a> Nature. 421, 268-272 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modularity+of+nuclear+hormone+receptors+in+a+Caenorhabditis+elegans+metabolic+gene+regulatory+network.">Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).</li><li>Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polygenic+control+of+Caenorhabditis+elegans+fat+storage.">Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage.</a> Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).</li><li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans.">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322, 957-960 (2008).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10, 430-435 (2009).</li><li>Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+bacterial+diet+on+fat+storage+in+C.+elegans.">The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans.</a> PLoS ONE. 4, e7545 (2009).</li><li>Yen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Rabbitts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glo-3,+a+novel+Caenorhabditis+elegans+gene,+is+required+for+lysosome-related+organelle+biogenesis.">glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis.</a> Genetics. 180, 857-871 (2008).</li><li>Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-2,+an+insulin+receptor-like+gene+that+regulates+longevity+and+diapause+in+Caenorhabditis+elegans.">daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 277, 942-946 (1997).</li><li>Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rictor/TORC2+regulates+fat+metabolism,+feeding,+growth,+and+life+span+in+Caenorhabditis+elegans.">Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans.</a> Genes Dev. 23, 496-511 (2009).</li><li>McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans:+a+model+for+exploring+the+genetics+of+fat+storage.">C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage.</a> Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).</li><li>Hellerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).</li><li>Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+for+fat+regulatory+genes+with+SRS+microscopy.">RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.</a> Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).</li><li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Nile+red,+a+fluorescent+hydrophobic+probe,+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections:+comparison+with+oil+red.">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red.</a> 33, 833-836 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Hope, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).</li><li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+isotope+labeling+strategy+reveals+the+influence+of+insulin+signaling+on+lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans.">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).</li><li>Wang, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiles+and+the+risk+of+developing+diabetes.">Metabolite profiles and the risk of developing diabetes.</a> Nature medicine. 17, 448-453 (2011).</li><li>Rhee, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+profiling+identifies+a+triacylglycerol+signature+of+insulin+resistance+and+improves+diabetes+prediction+in+humans.">Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).</li><li>Lewis, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+signatures+of+exercise+in+human+plasma.">Metabolic signatures of exercise in human plasma.</a> Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).</li><li>Rhee, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling+identifies+markers+of+uremia.">Metabolite profiling identifies markers of uremia.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).</li><li>Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+analysis+of+three+neutral+glycosphingolipids+from+a+mixed+population+of+Caenorhabditis+elegans+(Nematoda:Rhabditida).">Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida).</a> Glycobiology. 7, 265-275 (1997).</li><li>Christie, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Lipid Methodology - Two. , 69-111 (1993).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li><li>Wahlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nile+red+for+the+rapid+in+situ+quantitation+of+lipids+on+thin-layer+chromatograms.">Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms.</a> J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+C.+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Screening+and+Biosensing+with+Fluorescent+C.+elegans+Strains.">High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains.</a> J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).</li><li>Comizio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+lipid+and+triglyceride+response+to+energy+deficit:+relevance+to+body+composition+models.">Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models.</a> The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).</li><li>Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+wax+ters+and+other+lipids+by+the+marine+copepod,+Calanus+helgolandicus.">The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus.</a> J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+PPARalpha+in+maintaining+phospholipid+and+triacylglycerol+homeostasis+during+energy+deprivation.">Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation.</a> J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).</li><li>Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+lipid-globular+protein+mosaic+model+of+membrane+structure.">A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Turkish, A. R., Sturley, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neutral+lipid+biosynthesis:+an+evolutionary+perspective.">The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek çakışan çıkarları var.

Sunulan protokol C. lipid düzeylerinin hızlı, büyük ölçekli tarama sağlar Kolayca yüksek verimlilik ekranlara adapte edilebilir elegans. Birçok donma-çözülme döngüleri 8,10 izledi paraformaldehid uzun bir fiksasyon basamağı içeren önceden kullanılan yöntemler, aksine, bizim protokol izopropanol basit bir 3-min fiksasyon gerektirir. Biz bulduk C. boyanarak % 40 isopropanol elegans, bunlar ek donma-çözülme veya fiksasyon adımları kullanmadan, Nil kırmızı serbestçe geçirgen hale gelir. Nil kırmızı seçici olarak yeşil tayf 18,19,31 hidrofobik bölümlerinde fluoresces olarak da, hiçbir destaining gereklidir. Toplamda, hayvanların biraz üzerinde 2.5 saat lekeli ve hazır görüntü hayvan RNAi plakalar alınabilir. Bu yöntem, nispeten pahalı olmayan ve yüksek bir yeniden üretilebilirlik ile gerçekleştirilebilir. Yöntem C yeteneğine bağlı değildir alımı veya konsantre etmek elegansBu nedenle boya, ve hayati boyalar kullanılarak dayalı yöntemler besleme olarak aynı sınırlama yoktur. Tekrarlanabilirlik ve ölçüm hassasiyeti nedeniyle, yöntem RNAi ile gen inactivations çok sayıda taranması için uygundur. Lipid düzeylerinin kantitatif fiksatif Nil kırmızısı boyama dayalı isteniyorsa, biz biyolojik uygun kontrolleri ve uygulamalı istatistik testi ile çoğaltır 4-6 kullanılmasını öneririz. Küçük hayvanlar götüren birçok gen inactivations (gecikmiş veya tutuklanan oluşumuna yol RNAi klonları nedeniyle) ne olursa olsun yağ metabolizması için herhangi bir bağlantı, yağ düzenleyiciler için bir ekran çıkması olasıdır. Biz solucan alana floresans yoğunluğu normalize ederek farklı boyutlarda solucanlar hesapları kullanılan görüntü analiz programı, bireysel araştırmacılar da benzer bir gelişim aşamasının vahşi hayvanlara küçük hayvanların yağ boyama düzeylerinin karşılaştı düşünebilirsiniz. Inbelirgin düşük yağ kütlesi ile küçük ya da gelişimsel tutuklandı hayvanlar durumunda, biz tek bir modalite değişmiş lipid metabolizması göstermek için yeterli olduğunu göstermektedir. SPE-GCMS dahil birçok takip deneyler, bu genlerin lipit düzenleyici fonksiyonunu belirlemek için gerekli olabilir. Bilinen metabolik regülatör için fasn-1, SPE-GCMS analiz gelişimsel olarak uyumlu N2 L2 kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında, yetişkin kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında belirgin bir yararlı düşük yağlı fenotip onaylamak için gerekli idi. Nil kırmızı yağlı boyama aşamasında eşleştirilmiş L2 kontrol RNAi hayvanlara kıyasla yetişkin RNAi, kontrol grubuna göre daha düşük yağ seviyelerini ifade ederken, hiçbir belirgin fark görülmedi. Buna göre, fasn-1 RNAi sahne eşleştirilmiş L2 kontrol RNAi hayvanlardan biyokimyasal ayırt olduğu gibi fasn-1, yağ kütlesi gerçek bir regülatör olduğunu belirlemek için, ikinci bir yöntemin gerekli TAG / PL oranı yani biyokimyasal ölçümü yapıldı kullanın. 20 veya teflon yazdırılmış geleneksel büyüklükteki monte solucanlar görüntüleri yakalamak için kullanılabilir 8 ila 12 sıra mikroskop slaytlar . Tek sınırlama hızlı Nil kırmızı ağartıcılar ile boyanmış lipid damlacıklarının yeşil floresans olarak, sistematik, üniform pozlama şartlarına görüntüleri arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için kullanılmak üzere ihtiyaç vardır. Biz düzgün görüntü elde etme koşulları ile tam otomatik bir mikroskop bu etkiyi en iyi işe yaradığını bulabilirsiniz. Bu protokolün en büyük güçlerinden biri görüntüleri tahsil edildikten sonra yeniden analiz geleceği için kaydedilmiş olabilir olmasıdır. Aynı görüntüler yağ içeriğine ek olarak vücut büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Hesaplamalı programları daha gelişmiş hale geldikçe Ayrıca, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üreten, tek solucan analiz için umudu vartek bir kuyudan. Böylece high-throughput mikroskopi kullanır bizim yöntem floresan sinyalleri 32,33 ölçmek için bir Copas Biosort kullanmak yayınlanan ekran metodolojileri göre bazı üstünlüklere sahiptir. Bununla birlikte, yöntem kesinlikle ücretsiz. SPE ve GC / MS ile lipit içeriğinin hassas, biyokimyasal tayini C. büyük yağ depolarının Nil kırmızısı boyama doğruladı elegans. Sabitleştirici Nil kırmızısı boyama ve biyokimyasal lipit tayini ulaşılan mutlak miktarının genellikle mükemmel uyuşmuyor olsa da, her iki yöntem de niteliksel katılıyorum yüksek oranda tekrarlanabilir, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üretebilir. Buna ek olarak, bu yöntem Glikosifingolipidler, fosfolipidler, ya da çeşitli örneklerinde trigliserit mevcut ayrı sınıflar daha fazla analiz gerektiren bireysel araştırmacılar belirli ihtiyaçlarını karşılamak için tasarlanmış olabilir. Bu, diğer gruplar teknoloji diğer tha kullanılmış olduğunu belirtmek gerekirN SPE GC / MS 22. önce lipit sınıfları ayırmak için. İnce tabaka kromatografisi (TLC) ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) onlar (fosfatidilkolin, polar lipidler daha iyi ayrı ayrı nötral lipitler (örneğin TAG, diasilgliseroller, serbest yağ asitleri ve kolesterol esterleri) mümkün olabilir bunda SPE fazla avantajlara sahiptir fosfatidiletanolamin) ve glikol spingolipitler. Bu malzeme (2,500-5,000 solucanlar) başlayarak en az gerektirir çünkü SPE seçin, bu nötral lipid fraksiyonu 4 çoğunu oluşturan önemli uzun vadeli enerji depolar, TAG, vurgular, ve hızlıdır, hiçbir özel ekipman gerektiren veya plakalar. Bu standart karışımlar dayalı olduğu vurgulanmalıdır, SPE tamamen PL gelen TAG&#39;lar ayırır, ve (Şekil 5A bakın) son derece güvenilir ve tekrarlanabilir olduğunu. Yağ asidi metil esterleri miktarının ve analizi GC / MS gerektiriyorsa, bu cihaz yaygın olarak kullanılabilir ve eğer yerel olarak, örnekler olabilirYukarıdaki gibi oluşturulan ve bir ortak çalışan ya da ticari GC / MS ile analiz servis düzenlenmiştir gününe kadar -80 ° C de azot altında saklanır. GCMS Çıktı, her lipit türün içindeki her bir yağ asidi yüksek çözünürlüklü verileri içerir. Bu kıyasla örnekleri arasındaki detaylı farklılıkların belirlenmesi izin verir. Bir örnek olarak, bazı araştırmacı yağ asitlerinin düzeylerinin daf-2, LPD-3 ya da fasn-1 RNAi karşı vektör kontrol olarak diğerlerine göre daha belirgin olarak bol miktarda değiştirilmiş olup olmadığını belirleyebilir. Bu son derece güçlü bir araç nedenle lipid türlerinin herhangi bir deneysel manipülasyon ile bolca değişmiş olduğu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Bizim analizi için, biz en sık PL kitle TAG kitle normalleştirmek. Protein veya DNA ayrıca sonicated solucan pelet bir kısım arasından tespitini müteakip lipid kitle normalleştirmek için kullanılan olabilir, biz bu yöntemleri int tabi olduğunu bulmakTüm pipetleme aşamaları boyunca ve her çıkarma numune kurtarma roduced insan hatası. Biz yerine bizim normalizasyon faktörü olarak PL kitle kullanmayı seçti bu nedenle içindir. Unnatural standartları protokolünün başlama (TAG tritridecanoin, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) PL) tanıtıldı katı faz ekstraksiyon tüm adımlarda gerçekleştirilir ve FAME hazırlanması ve TAG ve PL fraksiyonlarının hem nicel ve temsili kurtarma garanti. Araştırmacılar TAG kitle normalleştirmek için protein veya DNA kullanırsanız aynı garanti yapılamaz. Biz PL örnekleri karşısında TAG düzeylerini karşılaştırmak için hangi en güçlü göstergesi olduğuna inanıyorum, daha önce PL sadece inceden TAG seviyeleri, örneğin uzun açlık büyük kitle vardiya etkileyen aynı uyaran tarafından değiştirilmiş veya egzersiz 34 arttığı gösterilmiştir gibi - 36. PL membran akışkanlığı ve hücresel inte sağlanması, yapısal bir rol oynadığı düşünülmektedirgrity ve oldukça enerji depolama 37-39 gibi daha sinyalizasyon rolleri. Bizim ellerde, TAG / PL oranı en yakından Nil kırmızı fiksatif tabanlı lipid boyama ile elde ne eşleşir, ve diğer gruplar 21 tarafından bulunan ifade eder. Alternatif bir strateji lipid TAG yüzdesi toplam lipid 9,22,29 karşı hesaplanır Watt laboratuarı tarafından kullanılır. TAG ve PL standart yerli olmayan tiplerin kullanılması hiçbir yerli yağ asitleri normalleşme hesaplamasına dahil edilecektir sağlar. Zincir uzunluğunun seçim sadece doğal yağ asitleri ve kütle spektrumları ile karışmaması için bu standartlar ihtiyaç dayanır. Biz, 13:00 ve 17:00 arasında yağ asitleri bu amaca hizmet için en iyi olduğunu bulduk. Bu bizim doğal olmayan yağ asidi standartları tüm zincir uzunluğu yağ asitleri veya fark ile zincir kurtarma temsili olmayabilir, kısa zincirli yağ asitleri farklı kimyasal özellikleri göz önüne alındığında, mümkünerent doygunluk indeksleri. Böylece SPE veya GCMS sırasında biz saflaştırma veya farklı zincir uzunluklarının lipidleri arasındaki algılama verimlilik farklılıkları görebilirsiniz mümkündür. Bu ve GCMS farklı yağ asitlerinin çeşitli iyon dayanarak, herhangi bir belirli yağ asidi bolluğu ile ilgili kesin bir ifade yapmak mümkün değildir. Bu nedenle, sadece herhangi bir yağ asidi tek bir deney bollukları ilk örnekler arasında karşılaştırma. Bir kesinlikle bir şekilde, bir yağlı asit miktarının belirlenmesi için isterse bu olabilir, böylece, yukarıda o ya da benzer bir yağ asidinin bir stabil bir şekilde izotopik olarak etiketlenmiş 13 C versiyon bilinen bir miktar ile çivili hazırlanmış bir örnek çalıştırmak için olacaktır elde edilebilir örneğin MSD ana iyonu, seri bağlı olarak ortaya çıkarmıştır. Biz sadece, maliyet en az lipid sınıflarının göreceli miktarları veya herhangi bir yağ asidi, bizim 13:00 TAG ve 17:00 PL standartları yeterince bu amaca hizmet, karşılaştırma dikkate alındığındaHer lipid sınıfı yeterli ve temsili kurtarma sağlamak. Bu noktaya kadar, çeşitli yöntemler ile elde edilen bazı sonuçların yorumlanması ve mevcut metodolojileri ne olması gerektiği konusunda fikir birliği eksikliği olmuştur. Genel olarak bu izolasyon içinde hiç bir yöntem ideal olarak C&#39;de yağ metabolizmasını incelemek için uygun olduğunu belirtmek gerekir elegans. Ancak, birden çok tarama ve doğrulama yöntemleri kullanarak, tek bir lipit düzenleyici genler üzerinde elde edilen veriler güven elde edebilirsiniz. Bizim protokol C. alanında gelecekte yapılacak çalışmalar için bir kriter olarak hizmet etmek için Böylece, biz niyetinde elegans yağ araştırma.

Insan ve nematod Caenorhabditis elegans arasındaki metabolik yolların Koruma obezite çalışma için güçlü bir model organizma yapar. Iken C. elegans memeliler gibi yağ depolama adanmış adipositler zorunda değilsiniz, onlar lipid damlacıkları 1 mağaza trigliserid yapmak ve yağ depolama ve enerji kullanımı 2,3 aynı regülatörleri birçok sahiptirler. C. yağ seviyeleri test için elegans, birkaç yöntem kolaylık ve başarı değişen seviyeleri ile öne sürülmüştür. Floresan, hayati boyalar 4-7 kez yaygın kullanımı son zamanlarda sorgulanmaya ve bu reaktifler C. ana yağ depo ayrı bir bölme boyama için ispat edildi elegans 1,8-11. Sudan siyah ve Oil-red-O gibi Sabitleme tabanlı olmayan floresan boyalar, solucan 12-14 lipid damlacıkları vurgulayarak başarılı, floresan gibi ölçümü için geniş bir dinamik aralık olarak yok ikenyüzde boyalar 8,13,15. Ayrıca, floresan ve floresan olmayan hem boyalar için fiksasyon güncel yöntem zaman alıcı ve çok donma-çözülme adımlar ve / veya toksik kimyasalların 1,9,10 ve kullanımını içerir. Belirli bir BODIPY-etiketli lipid analoğu kullanımı kısa süreli etiketlendirme 15 ile canlı solucan ile beslenen zaman lipid damlacıkları gelmek için rapor edilmiştir. Ancak bu boya alımı üzerine dayanır ve bu nedenle C. taraflıdır BODIPY yağ asidi analoglannın elegans kullanım ve metabolizması. Lipid-boyama boyalar An kurulan alternatif yağ depolar 10,16 görselleştirmek için lipid moleküllerin karakteristik titreşim özellikleri yararlanmak etiketi içermeyen, tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) veya uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopi, bir 17. Bununla birlikte, pahalı özel ekipman bu yöntem için gerekli olan, ve üretilen en azından düşüktür. Hızlı, ölçeklenebilir analy için bir ihtiyacını karşılamak içinC. nötral lipid depolarının sis elegans metabolik araştırmalar, biz, fiksatif tabanlı Nil kırmızı lipid boyanma derece tekrarlanabilir bir yöntemdir bir roman tanıtmak. Lipofilik boya Nil kırmızı spektral ve fizikokimyasal özellikleri sadece zaman lipit açısından zengin bir ortamda, ancak daha polar ortamlarda 18 yeşil emisyon spektrumundaki floresan sağlayan, onun eksitasyon-emisyon zirve sarı-altın-spektral kayması neden , 19. Böylece lipid damlacıkları floresan mikroskobu için ayarlanmış bir yeşil floresan protein (GFP) filtre kullanımı ile basit boyama sonra tespit edilebilir. Bu tekniğin kolaylığı ve uygun fiyatta ideal yüksek kapasiteli ekranlar için uygun kılmaktadır. Biz de trigliserid ve katı faz ekstraksiyonu ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak fosfolipidlerin biyokimyasal tayini için eşleştirilmiş, titiz yöntem gösterilmektedir. Biyokimyasal lipit ölçümü C. Nil kırmızı tabanlı mikroskobik tayini ile ilişkilidir elegans fat kütle ve mikroskopik lipid kararlılıkla yapılan bulguların teyidi olarak kullanılmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 96-pin çoğaltıcı </td><td> Nunc </td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> LB Agar </td><td> ABD Biyolojik </td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> Mekanik Pipet </td><td> BIOHIT M Hattı </td><td> M10, M100, M300 </td><td></td></tr><tr><td> Elektronik Pipet </td><td> BIOHIT E Hattı </td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P0662 </td><td> otoklavlanarak sterilize pH 6.0 </td></tr><tr><td> 1 M MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Aut ile sterilizeoclaving </td></tr><tr><td> 1 M CaCI2 </td><td> Sigma </td><td> C2661 </td><td> Otoklavlanarak sterilize </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mg / ml kolesterol </td><td> Sigma </td><td> C8667 </td><td> % 100 etanol </td></tr><tr><td> 200 mg / ml karbenisilin </td><td> ABD Biyolojik </td><td> C1100 </td><td> 0,2 μ Steril Filtre </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> ABD Biyolojik </td><td> I8500 </td><td> 0,2 μ Steril Filtre </td></tr><tr><td> 100 mg / ml ampisilin </td><td></td><td></td><td> 0,2 μ Steril Filtre </td></tr><tr><td> 5 mg / ml tetrasiklin </td><td></td><td></td><td> % 100 etanol </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> TC Tabaklar 96- </td><td> BD-FALCüzerinde </td><td> 353072 </td><td> 96-RNAi için </td></tr><tr><td> Dikdörtgen A / T Tabaklar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 242811 </td><td> RNAi damgalama için </td></tr><tr><td> LB Medya </td><td> ABD Biyolojik </td><td> L1530 </td><td> Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan </td></tr><tr><td> 96-Derin Kuyu Test Blokları </td><td> Corning </td><td> Costar 3960 </td><td> Dikdörtgen V-alt test bloğu </td></tr><tr><td> 96-Sığ Peki Testi Blok </td><td> Corning </td><td> Costar 3956 </td><td> Yuvarlak V-alt test bloğu </td></tr><tr><td> Steril Sızdırmazlık Film </td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td> Alüminyum Sızdırmazlık Film </td><td> Corning </td><td> Costar 6570 </td><td> 96 oyuklu plakalar için termo koruyucu bant </td></tr><tr><td> M9 Tampon </td><td> Bkz ve ark. 20 Hope </td&gt; <td></td><td> Aşağıda tarifi bakın </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td> Nil kırmızı </td><td> Invitrogen </td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td> İzopropanol </td><td> Balıkçı </td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pin aspiratörü </td><td> VP Bilimsel </td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Teflon Maskeli Mikroskop Slaytlar </td><td> Thermo Scientific </td><td> Görenek </td><td> Ayrıca Trevigen 96-Cometslide sipariş edebilir </td></tr><tr><td> 96-Altın-Seal Coverslides </td><td> Thermo Scientific </td><td> Görenek </td><td> Ayrıca 96-Cometslide ikinci kullanabilir miyim </td></tr><tr><td> Derin Kuyu PCR plate </td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td> Non-steril yapışkan filmi </td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td> High-Throughput Mikroskop </td><td> Leica </td><td> DM6000 tam öncesinde 96-evre ile otomatik </td><td> Chroma 49002 GFP filtre seti ve 2x amacı ile </td></tr><tr><td> Banyo sonikatör </td><td> Diagenode </td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma </td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Balıkçı </td><td> Optima F456-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipid Standart </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 830456P </td><td> 1,2-diheptadecanoyl-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) </td></tr><tr><td> Trigliserid Standart </td><td> NuChek Hazırlık </td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol 50 ul Pipet </td><td> Balıkçı </td><td> 21-176-3A </td><td> Drummond scientfic </td></tr><tr><td>Aseton </td><td> Sigma </td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td> Sülfürik Asit </td><td> Balıkçı </td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td> Hekzan </td><td> Balıkçı </td><td> Optima H306-1 </td><td></td></tr><tr><td> SPE Silika Sütun </td><td> Thermo Scientific </td><td> 60108-317 </td><td> Hypersep SI, 100 mg reçine yatağı </td></tr><tr><td> Katı Faz Kromatografisi Manifoldu </td><td> Sigma </td><td> 57265 </td><td> Supelco Visiprep 24-DL </td></tr><tr><td> Borosilikat pipetler </td><td> Balıkçı </td><td> 13-678-27F </td><td> 10 ml boyutu </td></tr><tr><td> Borosilikat Pasteur pipetler </td><td> Balıkçı </td><td> 13-678-8B </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat Kültür Tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td> Dişli Borosilikat Tüpler </td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> 8 ml kapasiteli </td></tr><tr><td> Kültür Tüpler için Fenolik Kapakları </td><td> Balıkçı </td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS Autosampler Flakon </td><td> Agilent </td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td> Otomatik Numune Şişeleri Kapaklar </td><td> Agilent </td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td> Agilent </td><td> 6890 GC / 5973 MSD </td><td> Bir Supelcowax-10 sütun ile outfitted </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nematod büyüme ortamı (NGM): 25 96 oyuklu plakalar RNAi için, NGM 1 L hazırlanması: <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Deiyonize su </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3 g </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> 17 g </td></tr><tr><td> Bacto pepton </td><td> 2.5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Otoklav sıvı döngüsü 121 ° C bir karıştırıcı ile 40 dakika. 60 60 ° C sıcaklıkta sıcak plaka sette karıştırarak ° C&#39;ye kadar soğumasını bekleyin Sonra aşağıdakileri ekleyin: </td></tr><tr><td> 1 M MgSO4 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> 5 mg / ml kolesterol </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 (pH 6.0) </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M CaCI2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> 200 mg / ml karbenisilin </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> 96 oyuklu plakalar içine RNAi dağıtın. 4 ° C Kullanım kadar 2 haftaya kadar saklayın. </td></tr></tbody></table> Dikdörtgen Ampisilin / Tetrasiklin LB Agar Tabaklar (A / T): 20 A / T plakaları, medyanın 1 L hazırlamak: <table border="1"><tbody><tr><td&gt; Reaktif </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Deiyonize su </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> LB agar (ABD Biyolojik) </td><td> 32 g </td></tr><tr><td> 2 M NaOH </td><td> 1.5 ml&#39;lik </td></tr><tr><td> Bacto agar </td><td> 2.5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Otoklav sıvı döngüsü 121 ° C bir karıştırıcı ile 40 dakika. 60 60 ° C sıcaklıkta sıcak plaka sette karıştırarak ° C&#39;ye kadar soğumasını bekleyin Sonra aşağıdakileri ekleyin: </td></tr><tr><td> Tetrasiklin </td><td> 3 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml ampisilin </td><td> 0.5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Her plaka içine 45 ml dağıtın. 4 at karanlıkta saklayın ° 4 haftaya kadar kullanımı kadar C,. </td></tr></tbody></table> LB bakteriyel büyüme ortamı: 4 L, 25 96-büyümeyi engeller ve resuspending için yeterli Karışım 62 g LB toz (US BiyolojikALS), 4 L damıtılmış su ve 4.8 ml 2 M NaOH çözeltisi ile. 1 L veya 0,5 L alikotları, sıvı döngüsü, 40 dakika otoklav. Oda sıcaklığında hava geçirmeyen şişelerde 1 yıla kadar saklanabilir. Bulutlu varsa atın. 100 mg / ml ampisilin 50 ml toplam hacmi ile 5 g ampisilin toz ve deiyonize su ile karıştırınız. Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de 1 ml alikotları ve dondurma dağıtmak, 0.2 μ sterilize filtreleyin. 5 mg / ml tetrasiklin 250 ml% 100 etanol ile 1.25 g tetrasiklin tozu ekleyin. Tamamen çözülmüş ve bir ışık geçirmez bir kap içinde -20 ° C&#39;de mağaza kadar iyice karıştırın. 200 mg / ml karbenisilin 50 ml toplam hacmi ile Karışımı 10 g toz karbenisilin ve deiyonize su. Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de 1 ml alikotları ve dondurma dağıtmak, 0.2 μ sterilize filtreleyin. 5 mg / ml &#39;Kolesterol 250 ml% 100 etanol ile 1.25 g kolesterol ekleyin. 6 aya kadar 4 ° C&#39;de iyi ve mağaza karıştırın. 1 M MgSO4 800 ml deiyonize su içinde 120,37 g MgSO4 eritilir. Oda sıcaklığında 1 L. Otoklav 40 dk sıvı döngüsü ve saklamak için son hacim getir. 1 M CaCI2 800 ml deiyonize su içinde 110.98 g CaCI2 eritilir. Oda sıcaklığında 1 L. Otoklav 40 dk sıvı döngüsü ve saklamak için son hacim getir. 1 M KH 2 PO 4, pH 6.0 &#39; 800 ml deiyonize su içinde 136,09 g KH 2 PO 4 çözülür. 6.0 pH ve oda sıcaklığında 1 litrelik otoklav 40 dakika sıvı döngüsü ve saklamak için son hacme getirmek. M9 Tamponu: 1 L-biz için rutintinely 8-10 L toplu hale 900 ml içinde 3 g KH 2 PO 4, 6 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 eritilir. 100-500 ml&#39;lik şişelerde 1 L. tablet için son hacim getirin ve oda sıcaklığında sıvı döngüsü ve mağaza 40 dakika otoklavda. 10 N NaOH 800 ml deiyonize su içinde 400 g NaOH eritilir, oda sıcaklığında, 50 ml tüp içinde 1 litre deposu bir son hacim için soğumaya ve getirmek için sağlar. 1 M IPTG Deiyonize su 23.81 g IPTG ekleyin ve 100 ml toplam hacmi getirmek. Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de 1 ml alikotları ve dondurma dağıtmak, 0.2 μ sterilize filtreleyin. Yumurta Hazırlama Bleach / NaOH Çözüm: Bir yumurta hazırlanması için yeterli 20 ml 4 ml ağartıcı, 1 ml 10 N NaOH, 5 mL H2O ve 10 mL50 ml polipropilen konik tüpe M9 tampon eklendi. Kullanımdan hemen önce yapın. Nil kırmızı stok solüsyonu 25 mg Nil kırmızı toz ile 50 ml% 100 aseton ekleyin. İyice karıştırın ve ışık geçirmez parafilmed kabında oda sıcaklığında saklayın. Bu şekilde ay boyunca saklanabilir. Nil kırmızısı boyama çözeltisi: 500 ml, boyama 30 için yeterli x 96-kuyucuğu 500 ml% 40 hacim / hacim izopropanol ile 3 ml Nil kırmızı stok solüsyonu eklenir. Folyo sarılı cam şişede oda sıcaklığında saklayınız. Kullanımdan hemen önce hazırlanır. Fosfolipid Standart Bir cam beher içinde, 7.6 mg fosfolipid standart, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glisero-3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol) tartılır. Metanol (50 ul başına 25 nanomoles): 20 ml 02:01 kloroform içinde çözülür. Kullanıma kadar alüminyum folyo ile kaplı tutun.Standart ayrıca 1 yıl için fenolik kapaklı hava geçirmez bir cam şişe içinde -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Trigliserid Standart Bir cam behere 6.8 mg trigliserid standart, tritridecanoin, tartılır. Metanol (50 ul başına 16.7 nanomoles): 30 ml 02:01 kloroform içinde çözülür. Kullanıma kadar alüminyum folyo ile kaplı tutun. Standart ayrıca 1 yıl için fenolik kapaklı hava geçirmez bir cam şişe içinde -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </td></tr></tbody></table>

biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans

Nematod C. elegans insan obezite ve ilişkili patolojiler ile ilgilidir olarak yağ metabolizmasını düzenleyen korunmuş genetik yolların çalışması için önemli bir model olarak ortaya çıkmıştır. C. görselleştirme için geliştirilen Birkaç önceki metodolojileri elegans trigliseritten zengin yağ depolar lipid damlacıkları dışındaki hücresel bölümlerin vurgulayarak, hatalı olduğu kanıtlanmıştır. Diğer yöntemler, özel ekipman gerektiren zaman alıcı, ya da tutarsız sonuçlar. Biz C. nötral lipid damlacıklarının doğru ve hızlı tespiti için hızlı, tekrarlanabilir, fiksatif tabanlı Nil kırmızısı boyama yöntemi tanıtmak elegans. % 40 izopropanol içinde bir kısa devre tespit adımı sonra hayvanlar boyama için kullanılır Nil kırmızı, tamamen geçirgen hayvanlar yapar. Bu lipofilik boya spektral özellikleri o güçlü ve seçici sarı-yeşil spektrum floresan izin yalnızca bir lipit açısından zengin bir ortamda, ancak daha fazlapolar ortamlar. Böylece, lipid damlacıkları izopropanol sadece kısa bir Nil kırmızısı boyama aşamasından sonra basit GFP görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir floresan mikroskop üzerinde görüntülenebilir. Hız, ekonomiklik ve bu protokolün tekrarlanabilirliği ideal yüksek kapasiteli ekranlar için uygun kılmaktadır. Biz de trigliserid ve gaz kromatografisi kütle spektrometresi kullanarak-fosfolipidlerin biyokimyasal tayini için eşleştirilmiş bir yöntem gösterilmektedir. Bu daha sıkı protokol Nil kırmızı mikroskobik lipit tayini elde sonuçlarının doğrulanması olarak kullanılmalıdır. Biz bu tekniklerin C. alanında yeni standartlar olacağı tahmin elegans metabolik araştırma.

Yağ boyama akışı yoluyla alınmıştır resimli bir plaka bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Yüksek yağ (Daf-2 insülin reseptör RNAi), düşük yağ (gut RNAi lipid depo granülleri için gerekli lpd-3 protein), küçük ve düşük yağlı (fasn-1 yağ asidi sentaz RNAi), ve boş vektör (için özel kontroller kontrol) hayvanların yağ seviyelerine göre floresan yoğunluğu varyasyonları, ve GC / MS analizi (Şekil 2) göre tespit edilen karşılık gelen lipid gösterirler. Gelişimsel tutuklandı giden gen inactivations, küçük hayvanlar genellikle bakılmaksızın yağ metabolizması için herhangi bir bağlantısı (Şekil 3), erişkin kontrol hayvanlara göre çok daha düşük yağ var görüneceğini unutmayın. Benzer bir gelişim aşamasında vahşi-tip kontrol hayvanların SPE-GCMS ile boyama analizi ve lipid biyokimyası dahil İkincil analiz, doğruluğunu sağlamak için yapılmalıdırKüçük ya da gelişimsel pozitif vurur tutuklandı. Fasn-1 RNAi (Şekil 2), L2 veya L3 larva aşamasında ya hayvanların yakalanması ve erişkin kontrol RNAi daha düşük yağlı boyama var, ama L2-L3 kademe kontrol RNAi hayvanlar (yağlı leke yüzde bolluk benzer olması durumunda 49.9 ± 4.5 fasn-1 RNAi ve 20.2 için% ± L2 kontrol RNAi için% 2.1 ve 64.7 ± L3 kontrol RNAi için 1.3): erişkin kontrol RNAi. Alternatif olarak, biyokimyasal analizler (: 22.5 ± fasn-1 RNAi ve 46.1 için 2.9 ± evre-eşleştirilmiş kontrol RNAi, P ≤ 0.05 için 3.4 TAG / PL) N2 kontrol hayvanları eşleşti L2 aşamasında daha düşük TAG / PL oranı belirtilir. Dolayısıyla bu durumda o fasn-1 yerine yağ kütlesinin sadece bir sahne özgü azaltma dışında lipid depo bir rolü olduğunu biyokimyasal analizi ile teyit edilebilir. Görüntülü solucan takip analizi kullanılarak örneğin Hücre Profiler gibi bir hesaplama platformu dayanırWormToolbox 30. Görüntülerin daha az sayıda için, bu gibi NIH serbestçe mevcut ImageJ, bir halka açık görüntü analizi platformu kullanılabilir. Bizim analizi için, benzersiz Matlab komut tespit etmek de, ve daha sonra boş bir kuyu veya kabarcıklar olan dışlamak ve solucanlara karşı küçük enkaz ayırt olanlar kullanılmıştır. Manuel kalite kontrol yukarıda belirtilen nedenlerle dışlama bayraklı görüntüler için gerekliydi. Biz genelinde ampirik solucan pikselin 90.persantil yoğunluğu bulunan bir kuyu, solucan gelişimin bütün safhalarında (Şekil 3) yoğunlukta boyanma metrik tutarlı sağlanan iyi genelinde solucan alanı, normalize. , Solucanın alan üzerinde toplam yağ kütlesi entegrasyonu tersine, büyük loş solucanlar ile eşdeğer küçük parlak solucanlar skor eğiliminde olacaktır. Bizim yöntem yoğunluğu yüzde alarak, solucanın alan üzerinde toplam floresan sinyal entegre olmadığından, per se solucan boyutu değişir hiçbir şey işe yaramazt önyargı şiddetini ölçtü. Bunun yerine, piksel yoğunluk dağılımı farklılıklar ölçülür. Ancak, buna rağmen, belirgin farklılıklar farklı gelişim aşamalarında hayvanların arasında piksel yoğunluğu dağılımı boyama görüldüğü, bu nedenle benzer bir gelişim aşamasında (Şekil 3) hayvanlara karşı herhangi bir gen için RNAi etkisini incelemek için önemlidir. Çoğaltır arasındaki ortalama değişkenlik yağ boyama yöntemi, yüksek tekrarlanabilirlik göstermektedir, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Yöntemin gücü aynı pozlama süreleri kullanarak, düzgün bir aydınlatma koşullarında, her plaka için kaliteli görüntüler elde oldukça bağımlı olduğunu unutmayın, ve minimal kabarcıklar, moloz veya diğer kuyulara solucan crossover ile. SPE TAG&#39;ler PL (Şekil 5A) ayrılmış olabilir için derecesini belirlemek için standart arıtılmış, ön karışım üzerinde yapıldı. Bu analizde, biz 100% s eldeTAG ve PL, bir Ayırma TAG örnek olarak 17:00 PL türetilen yağ asitleri ve PL örnek olarak TAG (Şekil 5A) dan elde edilen yağ asitleri 13:00 karşılık gelen bir tam olmadığı tam yokluğu olarak gösterilir. Böylece SPE lipit sınıfları ayıran az yüksek verimli olduğunu. Bu analiz farklı zincir uzunluğuna sahip tüm TAG&#39;lar SPE tarafından eşdeğer saflaştırılmış ve benzeri verimlilik ile GCMS tarafından tespit edilecek anlamına gelmez. Sadece bu toplam olarak TAG ve PL lipidler birbirinden tamamen ayrılmış sağlar. Katı faz ekstraksiyonu ve ün hazırlanması yoluyla alınan N2 vahşi tip hayvanlara bir numune GC-MS iz Şekil 5B &#39;de gösterilmiştir. TAG ve PL her ikisi için, tepe tutma süresi ve kütle spektrum üzerinde, üst ve kız iyonları, ve söz konusu iç standart alana göre normalize tanımlanan zirveleri altında toplam alanı üzerine göre tespit edilebilir. TAG normalize miktarı, alanı belirlemek içinTAG kromatogramın her zirveleri altında, 13:00 standart hariç, birlikte ilave edildi ve 13:00 ucu altındaki alana bölünür. Aynı şekilde, 17:00 standart dışında normalize PL toplam miktarı, her zirveleri altında kalan alan, belirlemek için, birbirine eklenir ve 17:00 ucu altındaki alan ile ayrıldı. TAG ve PL numuneler için normalize edilmiş değerler, daha sonra numune için nihai TAG / PL oranını hesaplamak için kullanılmıştır: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="Denklem 1" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> Bu, SPE-GCMS verileri PL oranı toplam TAG basit bir hesap göre her bir lipit fraksiyonu içinde mevcut yağ asitlerinin çok daha sofistike bir analiz izin verdiğini not edilmelidir. Örneğin, bir araştırmacı tek bir yağ asidi tekabül eden bir tek tepe noktasının, entegre olabilir ve (örneğin, c örnekleri arasında kendi normalize bolluk karşılaştırmakdaf-2 RNAi PL 17:00 standart pik alanına bölünmesiyle toplam PL kitle normalize 13:00 standart pik,) bölünmesiyle 18:00 tepe entegre alanına karşılık N2 vahşi-tip omparing: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="Denklem 1" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> Araştırmacı seçmek gerekir, bu da yağ asidi toplam miktarının yüzdesi olarak TAG veya PL fraksiyonları içinde herhangi bir yağ asidi yüzdesini belirlemek mümkün olacaktır (N2 solucan TAG fraksiyonu içinde bir örnek olarak 18:00 nicelendirildi ) <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="Denklem 1" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = &quot;Şekil 1&quot; fo: content-width = &quot;3.25in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg&quot; /&gt; Şekil 1. Genel deney için tipik iş akışı. Gün 1, dondurulmuş RNAi kütüphane plakaları Amp / Tet LB agar plaklarına damgalanmış ve 37 ° C&#39;de inkübe edilir Gün 2, Amp / Tet tabak derin kuyu bloklar RNAi klonlar tohum sıvı kültürleri için kullanılır. 3. gün, bakteriler santrifüj ile konsantre edildi ve 96 oyuklu plakalar RNAi aktarılır. 4. Gün, L1 yavru C. elegans sıvı içinde RNAi plakalara ilave edildi ve kurumaya bırakılır. 7. gün, hayvan 96-Teflon slaytlar üzerine monte edilmiş,% 40 izopropanol içinde Nil kırmızı ile boyanmış, sıvı toplandı ve bir yüksek verimli mikroskop ile görüntülenmiştir edilir. <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> Şekil 2. Büyük Sabitleme tabanlı Nil kırmızı lekeler <em&gt; C. elegans yağ depolar. Örnek parlak alan ve GFP floresan görüntü kontrolü (boş vektör), fasn-1 (küçük, az yağlı), lpd-3 (düşük yağ) N2 solucanlar beslenen gösterildiği veya daf-2 (yüksek yağ) vardır RNAi klonlar. Örnekler protokolü (Şekil 1 &#39;de şematik) başına edildiği şekilde işlenir. Hayvanlar, sabit Nil kırmızı lekeli ve karşılaştırılabilir lipid düzeylerinde görüntülü sonucunda biyokimyasal lipit ölçümü elde. Biyolojik en az 6 tekrarlı elde İzopropanol-Nil sabit kırmızı flüoresans seviyesi, ilk satırda verilmiştir. Çoğaltır 4 Biyolojik alınan genel fosfolipid düzeyleri (TAG / PL), normalize zaman genel nötral lipid depolarının yansıtıcı Kantitatif trigliserid düzeyleri, ikinci satırda gösterilir. Bu sabitleştirici Nil kırmızısı boyama ve biyokimyasal lipit tayini ulaşılan mutlak miktarının genellikle mükemmel uyuşmuyor dikkat etmek önemlidir. Bu durumda, nitel olsabenzer fasn-1 (RNAi) mikroskopi gösterdiğinden daha biyokimyasal yöntemlerle daha farklı trigliserid kütle vs kontrolü vardır, lpd-3 nispeten farklıdır ve daf-2 (RNAi) tüm farklar istatistiksel olarak anlamlı olmasına rağmen, daha az farklı ve ölçümleri yüksek tekrarlanabilir. Gösterilen veriler ortalama ± SEM (*, P ≤ 0.01; **, P eşit varyans varsayılarak eşleştirilmemiş, iki uçlu t-testi ile belirlenen denetim ≤ 0.0001 göreli). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3,. Yağ kitlesi farklı larva dönemlerinde fiksasyon Nil kırmızısı boyama tarafından belirlenir. Hayvanlar OP50 bakteri yetişen ve L1 toplanmıştır, L2, L3, L4 ve gebe yetişkin gelişim evreleri. Görüntüleri fiksasyon boyama sonrasında yakalanan ve 90 inci persentil o belirlemek için özelleştirilmiş bir Matlab komut dosyası kullanılarak analiz edilditespit solucan alana f piksel yoğunluğu. Hayvanların lipid hayvan L2 L4 aşama geliştirir olarak büyük ölçüde artar ve daha sonra hayvan yetişkin aşamasında germline proliferasyonu kalori doğru yönlendirmek için başlar gibi hafif bir azalma olduğuna dikkat edin. Gösterilen veriler ± ortalamadır 6-8 SEM çoğaltır (** P eşleştirilmemiş, iki uçlu t-testi ile tespit gravid yetişkin ≤ 0.0001 göreli). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> Şekil 4. Bağımsız biyolojik genelinde Yüksek tekrarlanabilirlik çoğaltır. Gösterildi biyolojik genelinde Nil kırmızı floresans yoğunlukları bir scatter plot olduğunu çoğaltır (n = 6-8). Her çoğaltmak için, tüm değerleri boş vektör kontrollerin ortalama yoğunluk normalize edilmiştir. Gösterilen veriler ortalama ± SEM (** P eşleştirilmemiş, iki uçlu t-testi ile belirlenen denetim ≤ 0,0001 göreli varsayarak ortalama vardıreşit varyans). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> Şekil 5,. GC-MS SPE kromatogramları standartları ve vahşi tip TAG ve PL bolluğu ayrılır. (A) GC-MS izleri TAG ve PL standartların SPE ayrılığı gösterilir. PL TAG birbirlerinden tamamen ayrılmış (tritridecanoin) (1,2-diheptadecanoyl-sn-glisero gösteren PL izleme 13:00 yağ asidi olmamasıdır ve TAG izleme 17:00 yağ asidi karşılık gelen olmadığına dikkat -3-fosfo-(1&#39;-rac-gliserol)). N2 vahşi tip beslenen hayvanların vektör kontrol RNAi (L4440 boş vektör RNAi ile HT115 bakteriler) bir örneklem TAG ve PL (B) bir temsilci tam spektrum. Örnek bir mikrolitre ile verilen protokole göre bir Agilent 6890/5973N GCMS içine enjekte edildi ve her bir pik rete ile tespit edilmiştirntion zaman ve kendi kütle spektrumları. Kısaltmalar: siklo, siklopropan yağ asidi; iso:. Iso-metil dallı zincirli yağ asidi; GLA, gamma linolenik asit; ALA, alfa linolenik asit; DGLA, dihomo gamma linolenik asit; EPA, eikosapentaenoik asit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans | Biology | Video

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler sunmak<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Lipid depolar. Floresan lipid damlacık görüntüleme için hızlı, basit, sabitleme-boyama prosedürü lipofilik boya Nil kırmızı spektral özelliklerini güçlendirir. Biz sonra trigliserid ve katı faz ekstraksiyonu ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak fosfolipidlerin biyokimyasal ölçüm sunuyoruz.

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

biochemical-high-throughput-microscopic-assessment-fat-mass

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Fundamentals

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Unit 1

Chemistry of Life

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

20.4K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler sunmak Caenorhabditis elegans Lipid depolar. Floresan lipid damlacık görüntüleme için hızlı, basit, sabitleme-boyama prosedürü lipofilik boya Nil kırmızı spektral özelliklerini güçlendirir. Biz sonra trigliserid ve katı faz ekstraksiyonu ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak fosfolipidlerin biyokimyasal ölçüm sunuyoruz.

Video: Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biyoloji

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...