Doku ve organellerin morfolojisindeki değişiklikleri ölçebilme yeteneği gen işlevinin anlaşılması nda ve genetik mutasyonların etkisinde önemlidir. Protokollerimiz, nematod, C.elegans'ta sinapsların, kasların ve mitokondrinin morfolojisinin subjektif olmayan bir şekilde değerlendirilmesi için serbestçe kullanılabilen yazılımların nasıl kullanılabileceğini açıklanmaktadır. Daha önceki birçok çalışma morfolojik değişiklikleri karşılaştırmak için nitel yöntemlere dayanıyordu.
Ancak, bunlar ince phenotik farklılıkları yakalayamadıkları, değişiklikleri tekrar ve hafife alabilecekleri ve öznel olarak değerlendirildikleri için sorunlu olabilir. Kantitatif yöntemlerimiz morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için daha sağlam ve daha az önyargılı araçlar sağlar. Bu yöntemler, gen fonksiyonunu ve hastalıkla ilişkili mutasyonların sonuçlarını tanımlamak için diğer hücresel yapılardaki veya model organizmalardaki morfolojik değişimleri incelemek için kolayca kullanılabilir.
Görüntüleme için slaytlar hazırlayarak başlayın. Bir mikroskop slayt üzerine erimiş agarose bir damla yerleştirin ve hemen yavaşça agarose düzleştirmek, başka bir mikroskop slayt ile damlacık aşağı basın. Agarose'u bir dakika kurumaya bırakın sonra iki kaydırağı dikkatlice ayırın ve katılaşmış pedi slaytlardan birine bırakın.
Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve agarose pedin ortasına beş ila 10 mililitrelik bir anestezi damlası ekleyin. Çözelti kurumadan önce stok plakasından anestezik damlacıklara 10 ila 15 hayvanı hızlı bir şekilde aktarmak için ısı yalıtımlı bir kazma kullanın. Sonra agarose ped hemen üzerinde konumlandırma ve yavaşça aşağı bırakarak bir coverslip uygulayın.
488 ve 552 nanometre optik pompalı yarı iletken diyot lazer ile birleştiğinde ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir çizgi tarama konfokal mikroskop ile sinaptik bölgeleri görüntüleyin. Solucanları buladıktan sonra 40X büyütmeye geçin ve daldırma ortamı uygulayın. 552 nanometre lazer, tagRFP florofor için % 1 güç ve 488 nanometre, GFP florofor için % 2 güç ile florofororları heyecanlandırarak sinaptik bölgeyi görselleştirin.
Hibrit fotodedektör kullanarak görüntüleri yakalayın ve floroforların aşırı maruz kalmasını önlemek için kazanımları ayarlayın. Hedefe bağlı olarak en uygun Z adımı boyutunu kullanarak tüm sinapskapsayacak şekilde Z-yığın görüntüleri toplayın. Sinaptik bölgeyi analiz etmek için görüntüleri CellProfiler 3.1.5 yazılımına yükleyerek başlayın.
NameAndType modüllerini ayarlayın ve UIS-115 transgeninden ifade edilen diffüz tagRFP'yi kullanarak sinaptik bölgeyi el tanımıyla belirleyin. El tanımlı sinapsın boyutunu ve floresanını, pipeline'a MeasureObjectSizeShape ve MeasureObjectIntensity modüllerini ekleyerek ölçün. Daha sonra CalculateMath modüllerini ekleyerek ve JSIS37'den elde edilen entegre yoğunluk birimlerini UIS-115'ten elde edilenlerle bölerek göreli entegre floresan yoğunluğunu hesaplayın.
Bittiğinde tüm ölçümler ve hesaplamalar ihracat. Kas hücre alanını ölçmek için Fiji yazılımında görüntüyü açın ve tek bir eğik kas hücresi etrafında dikkatle izlemek için çokgen seçimini kullanın. İzlemeyi geliştirmek için çapa noktasını sürükleyerek sonundaki çokgenin çizgisini ayarlayın.
Yazılımın üst kısmındaki Analiz sekmesine gidin ve seçili alanı hesaplamak için Ölçü'ye tıklayın. Dejenere veya eksik bölge olan kas hücreleri için çokgen seçim aracıyla eksik alanı takip edin ve tekrar Ölçüle'yi tıklatın. Birden çok boşluk varsa, her birini ayrı ayrı izle.
Boşluk alanının tüm hücrenin alanına oranını hesaplayın. Yüksek bir oran kas dejenerasyonu daha yüksek ölçüde gösterir. Eksik bölge yoksa, oran sıfır olarak hesaplanır.
Elastik'i açın ve Yeni Proje Oluştur altında Piksel Sınıflandırması'nı seçin. Sonra yeniden adlandırın ve projeyi kaydedin. Giriş veri sekmesine gidin ve Yeni Ekle'yi tıklatın ve sonra ayrı görüntüler ekleyin.'e gidin.
Açılır pencereyi TIF dosyalarıyla klasöre yönlendirin ve istediğiniz görüntüyü seçin. Özellik Seçimi sekmesinde, yeşil işaretli kutulartarafından belirtilen tüm piksel özelliklerini seçmek için Özellikleri Seç'e tıklayın. Bu adımdaki piksel seçimi, bir sonraki adımda farklı piksel sınıflarını ayırt etmek için kullanılır.
Bireysel GFP ifade miyozin filamentler ve istenmeyen arka plan ayırt etmek için bir Eğitim paneli kullanın. Sınıflayıcı eğitimine başlamak için Etiket Ekle'ye tıklayın ve filamentler arasındaki istenmeyen arka planlar ve boşluklar karalayın. İkinci bir etiket ekleyin, Filament'e yeniden adlandırın ve bir dizi filamentin üzerine karalayın.
Sınıflandırmanın doğru yapıldığından emin olmak için Canlı Güncelleştirme'yi tıklatın. Gerekirse, eğitimi ince ayaryapmak için daha fazla karalama ekleyin. Eğitim sınıflandırıcısı yapıldıktan sonra, Tahmin Dışa Aktar paneline gidin ve kaynak olarak olasılıkları olan Dışa Aktar Görüntü Ayarlarını Seçin'i tıklatın.
X ve y alt bölgelerinin işaretli olduğundan ve c'nin işaretsiz olduğundan emin olun. C için başlangıç ve durdurma değerleri olarak sıfır ve bir'i seçin ve Veri Türünü imzasız 8 bit'e dönüştürün. Yeniden normalleştir'i işaretleyin ve çıktı dosyası videosunu png olarak değiştirin ve dosyayı ve dizini istediğiniz gibi yeniden adlandırın.
Dışa Aktarma ayarları penceresini kapatın ve yeni bölümlenmiş görüntüyü dışa aktarın. Sonra Fiji yazılımıpng dosyasını açın. Varsayılan ayarları kullanarak görüntünün eşiğini ayarlayın ve ayrı bir sonuç tablosu oluşturacak olan iskeletleştirme eklentisini uygulayın.
Bu protokol sinaps gelişiminde alfa-tubulin asetiltransferaz MEC-17 işlevini keşfetmek için kullanılmıştır. Posterior/lateral mikrotübül veya PLM sinapslarının görüntülerinin nicel analizi, MEC-17'nin aşırı ekspresyonunun normal nöron fonksiyonunu bozduğunu göstermektedir. MEC-17'yi aşırı ifade eden yabani tip kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında presinaptik bölgeler ve sinaptik bütünlüğü önemli ölçüde azaltmıştır.
Bu teknikler ayrıca CMT2 ilişkili genlerde mutasyon taşıyan Charcot-Marie-Tooth tip 2 veya CMT2'nin C.elegans modellerini analiz etmek için de kullanılmıştır. Vücut duvarı kas morfolojisinin görsel değerlendirmesi, test hayvanlarındaki defektlerde yabani tip kontrolüne göre 2,5 ila 3,5 kat artış saptandı. Fzo-1 ve UNC-116 mutasyonları olan hayvanlar kas striations kaybı deneyimli, hücresel enkaz birikimi, ve kas lif dejenerasyonu.
Dyn-1 mutasyonu olan hayvanlar kas morfolojisinde önemli ölçüde daha az kusur yaşarken. Fzo-1 ve unc-116 mutantları, toplam tek hücreli alana boşluk oranında beş ila altı kat artış ve vahşi tip hayvanlara göre önemli ölçüde daha kısa bir ortalama lif uzunluğu gösterdi. Örnekler arasında karşılaştırmalar yapılabilmesi için en uygun şartları belirlemek ve bu şartların sürekli olarak kullanılımından emin olmak üçe
Bu teknikler, araştırmacıların farklı genetik geçmişler arasındaki morfolojik değişiklikleri nicel yaklaşımlarla karşılaştırmalarına olanak sağlayacaktır. Bu öznellik azaltır ve bu nedenle oluşturulan verilerin temsil edilebilirliğini artırmak için yardımcı olur.
