Bu eser NIH grant tarafından mümkün yapıldı: R01GM109028 (S.P.C.)

1. Nil kırmızı (NR) lipitler boyama
<ol><li>5 mg/mL NR hisse senedi çözüm hazırlanması<ol>
<li>500 mL şişe NR tozu 100 mg 200 mL % 100 aseton ekleyin.</li>
		<li>Işık için herhangi bir maruz önlemek için alüminyum folyo ile şişe kapağı.</li>
		<li>Önce kullanma, belgili tanımlık eriyik için 2 h karanlıkta karıştırın.</li>
		<li>Uzun süreli kullanım için NR hisse senedi çözüm olmadan herhangi bir ışık pozlama sıkıca kapalı bir şişede saklayın. Ölçek NR hisse senedi araştırma gereksinimlerinize uygun bir çözüm. Aynı hisse senedi çözüm NR boyama deneyler tutarlı boyama ve sonuçları görüntüleme elde etmek için kullanıldığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR çalışma çözüm hazırlanması<ol>
<li>% 40 isopropanol (v/v) her 1 mL için 6 µL NR hisse senedi çözüm ekleyin.</li>
		<li>NR çalışma çözüm 600 µL her örnek için hazırlayın. Not: taze NR boyama önce çözüm değil çalışma yapmak. NR hisse senedi çözüm ihtiyaçlarınıza bağlı olarak, kullanım 15 mL veya 50 mL konik tüp mezun oldu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR lipid boyama için hazırlanması solucanlar<ol>
<li>Solucanlar için erken L4 sahneye geç günlük OP50 E. coliile seribaşı nematodunun büyüme orta (NGM) 20 ° C'de büyümek.</li>
		<li>1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz + % 0,01 Triton X-100 (PBST) çözüm ile plaka kapalı solucanlar yıkama ve 1.5 mL microfuge tüpte solucan süspansiyon koymak.</li>
		<li>Santrifüj 560 x g 1 dk. de süpernatant ve tekrar bu adım E. coli kadar temizlenir süspansiyon solucanlarını.</li>
		<li>% 40 isopropanol 100 µL solucan Pelet ekleyin ve 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi 560 x g 1 dk. için de kurt ve solucan Pelet aksatmadan süpernatant kaldırın. Not: Eğer solucanlar plakaları kapalı yıkamayı PBST kullanımı daha yüksek hacimli büyük tabak kullanarak veya plaka başına daha fazla solucanlar boyama. Solucanlar örnek fiksasyon önce 15 dk içinde PBST daha yıkama yok. Süpernatant bakteri temizlenmez ise ek yıkama yapar. Bir nutator veya rocker kullanarak % 40 isopropanol kuluçka yerine getirir. Her zaman tam örnek ajitasyon oluştuğunu emin olmak için tüpler monitör.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid NR ile boyama<ol>
<li>Karanlıkta, her örnek için 600 µL NR çalışma çözüm ekleyin. Tüpler üç kez ters çevir ve tam solucanlar NR çözüm içinde karıştırın.</li>
		<li>Örnek 2 h için oda sıcaklığında karanlıkta döndürün.</li>
		<li>Kuluçka, solucanlar, 560 x g 1 dk. için santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>PBST 600 µL ekleyin ve aşırı NR leke kaldırmak 30 dk için karanlıkta örnekleri kuluçkaya.</li>
		<li>560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm yaklaşık 50 µL süpernatant, kaldırın. Not: NR kuluçka ajitasyon gerektirmez. Kurtlardan yerleşme bu adımı sırasında yaygındır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytların hazırlanması için mikroskop düşsel<ol>
<li>Solucan Pelet kalan süpernatant resuspend.</li>
		<li>Solucan süspansiyonun 5 µL mikroskop slayt üzerinde yerleştirin ve bir coverslip dikkatli herhangi bir hava kabarcıkları yakalama önlemek için koymak.</li>
		<li>Coverslip tırnak cilası ile solucanlar Imaging önce kapatın.</li>
		<li>Sadece birkaç slayt teker teker hazırlayın. Bu NR görüntüleme örnekler üzerindeki sabit kalır garanti eder. NR lekeli görüntü kalitesini 6 h. ayrık lipid damlacıkları gözlemlemek zor ve arka plan Floresans artar, hangi NR sinyal algılama ile müdahale sonra azalır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR lekeli Worms görüntüleme<ol>
<li>Görüş alanı başına birkaç hayvan yakalamak için 5 X büyütme, solucanlar görüntü.</li>
		<li>Bireysel Worms daha iyi miktar için 10 X büyütme geçin.</li>
		<li>NR lekeli solucanlar görüntü ve miktar için en uygun koşulları belirlemek için farklı pozlama kez denemek için FITC/GFP kanal kullanın.</li>
		<li>Dosyaları sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için TIF biçiminde kaydedin. Not: Tipik pozlama bir en uygun pozlama süresi sahip 100-1000 Bayan arasında değişen zaman, tüm örnekleri için görüntüleme tutarlılığı korumak için kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR boyama görüntü miktar<ol>
<li>Filmler ImageJ için yükleyin. Eğer belgili tanımlık imge eğe değil tanınan Eklentiler aşağı açılır menüsünden biyo-biçimleri işlevini kullanın.</li>
		<li>Yığın fonksiyonu altında görüntü aşağı açılır menüde resim yığını birkaç Filmler karşılaştırıldığında görüntü yığını oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>Aynı aşağı açılır menüde parlaklık/kontrast görüntü yığını olarak ayarlayın ve Uygula tıklayarak tüm görüntüleri değişiklikleri yaymak.</li>
		<li>Her görüntülü solucan betimlemek ve floresan yoğunluğu NR tarafından yayılan ölçmek için Analysis açılan menü altında ölçü işlevini kullanın için Çokgen seçim aracını kullanır.</li>
		<li>Her resim için beş arka plan yerlerde ölçmek ve ortalama arka plan floresan yoğunluğu hesaplayın.</li>
		<li>Arka plan floresan yoğunluğu formül N kullanarak her görüntülü solucan üzerinden çıkarma = G - (A B x), N net Floresan, brüt floresan için G, toplam solucan alan için A ve B için ortalama arka plan Floresans nerede anlamına gelir.</li>
		<li>Floresan yoğunluğu solucan boyutuna göre normalize etmek her solucan'ın net Floresans Rumeli tarafından bölün. Sonuçlar floresan yoğunluğu, rasgele birimleri (yapıyordum), piksel başına olarak rapor edilir. Not: resimleri JPEG formatında dışa aktarma kaçının. Sıkıştırma dosyaları depolamak için daha kolay yönetilebilir yapar iken, veri bütünlüğü bu biçim tarafından güvenilir değil. Tüm görüntüleri değiştirilmiş ve aynı şekilde analiz emin olun. Düzgün farklı büyüklüklerde boyutta değerlendirmek için bir ölçek çubuğu eklemeyi unutmayın. ImageJ kullanarak floresan yoğunluğu farklılıkları daha iyi görselleştirmek için 8-bit RGB görüntü türünden geçiş ve yangın görüntü arama tabloları (LUT) menüsünden seçin. Bu artan hangi renk parlaklığı artmış floresan yoğunluğu ile ilişkili olan bir ısı haritası görüntü oluşturur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yağ kırmızı O (ORO) lipidler boyama
<ol><li>ORO hisse senedi çözüm hazırlanması<ol>
<li>250 mL şişe ORO toz 500 mg 100 mL % 100 isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Bir kez hazırlanan, hiçbir ışık pozlama ile sıkı kapalı çözüm saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ORO çalışma çözüm hazırlanması<ol>
<li>Su (3:2) için % 60 isopropanol ORO hisse senedi çözümde sulandırmak.</li>
		<li>Kullanmadan önce çalışan ORO çözüm 0.2 µm selüloz asetat steril enjektör filtre ile filtre. Not: En iyi çözüm kalite için çalışan ORO çözüm önceki gün hazırlamak ve gecede karışımı sağlar. Ancak, çözüm gerekli aynı gün ise seyreltik ve ORO çözüm üzerinde bir rocker kullanmadan önce en az 2 h için karıştırın. Sallanan önce parafin kaseti ORO çözüm kaçağı önlemek için konik tüp sarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar ORO lipid boyama için hazırlanması<ol>
<li>20 ° C'de solucanlar nematodunun büyüme orta (NGM) günlük geç OP50 E. coli için istenilen hayat sahne ile seribaşı büyümek.</li>
		<li>1 mL PBST çözeltisi plakasına eklemek ve tüm solucanlar tabağını olana girdap. Plaka eğim ve PBST 1 mL ile yıkayın. Solucan süspansiyon 1.5 mL microfuge tüp aktarın.</li>
		<li>Santrifüj 560 x g 1 dk. de süpernatant Pelet ve çamaşır adım PBST 1 mL ile üç kez tekrar rahatsız etmeden solucanlarını. Tüm süpernatant ama 100 µL kaldırın.</li>
		<li>% 40 isopropanol 600 µL solucan Pelet ekleyin ve 3 dakika oda sıcaklığında salla.</li>
		<li>G 30 s ve Kaldır tüm süpernatant ama 100 µL x 560, solucanlar solucan Pelet aksatmadan santrifüj kapasitesi. Not: Eğer yüksek üretilen iş Boyama yaparken solucanlar plakaları kapalı yıkamak için PBST daha yüksek miktarda kullanın. Solucanlar örnek fiksasyon önce 15 dk içinde PBST daha yıkama yok. Süpernatant bakteri temizlenmez ek yıkama yapın. Kuluçka nutator veya rocker kullanarak % 40 isopropanol içinde yerine getirir. Her zaman tam örnek ajitasyon oluştuğunu emin olmak için tüpler monitör.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipid ORO ile boyama<ol>
<li>600 µL ORO çalışma çözüm her örnek için ekleyin. Tüp üç kez ters çevir ve de ORO de solucan karıştırın.</li>
		<li>Örnekleri için oda sıcaklığında 2 h 30 RPM döndürme.</li>
		<li>560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm süpernatant ama 100 µL ortadan kaldırmak.</li>
		<li>Örnekleri PBST 600 µL içinde resuspend ve tüpler aşırı ORO leke kaldırmak 30 dk 30 RPM döndürün.</li>
		<li>560 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi ve tüm 50 µL süpernatant, ortadan kaldırmak.</li>
		<li>Hayvan germline ve bağırsak hücreleri konumunu daha iyi ayırt etmek için leke çekirdeği 1 µL ekleyerek (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) her 1 mL ORO çalışma çözeltisi için. Slayt görüntüleme için montaj öncesinde DAPI ekleyerek 2 h için ORO boyama dışarı taşımak. Bağırsak çekirdek boyutu daha büyük ve erbezi gelişmekte olan germ hücreleri tarafından ayırt edilir. Not: boyama ORO sonra solucan microfuge tüp taraf için uygun ve göze çarpan bir Pelet oluşturmak başarısız. Bu durumda, solucanlar tekrar santrifüj kapasitesi ve solucanlar yerçekimi tarafından en az 10 dakikadır yerleşmek izin vermeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging solucan için slaytların hazırlanması<ol>
<li>Solucanlar kalan süpernatant içinde resuspend ve çözüm karıştırın.</li>
		<li>Solucan süspansiyonun 5 µL mikroskop slayt üzerinde koymak ve bir coverslip dikkatle, havasız formu kabarcıklar sağlanması yer.</li>
		<li>Coverslip tırnak cilası ve görüntü solucanlar ile kapatın. Not: sabitleme ve boyama sonra solucanlar çok sert ve pipet zor olabilir. Bu sorunu çözecek, onların ipuçları keserek wide-geçişli Pipetler olun.</li>
		<li>Hemen boyama sonra görüntüleme değil Eğer bir mikro-santrifüj raf için en fazla 24 Saat 4 ° C'de slaytları saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ORO lekeli Worms görüntüleme<ol>
<li>Bir renk özellikli kamera görüntü ORO lekeli solucanlar için kullanın.</li>
		<li>5 X büyütme bir görüş alanı içinde çeşitli solucanları görüntü için kullanın.</li>
		<li>Bireysel solucanlar daha iyi incelenmesi için 10 X büyütme geçin.</li>
		<li>Sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için TIF biçimdeki görüntüleri dışa aktarın. Not: boyama ORO + DAPI, renk özellikli kamera Floresans yakalayabilir bir geçiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Worms ORO lekeli görüntü analizi<ol>
<li>Micrograph(s) ImageJ için yükleyin. Eğer belgili tanımlık imge eğe değil tanınan Eklentiler aşağı açılır menüsünden biyo-biçimleri işlevini kullanın.</li>
		<li>Yığın fonksiyonu altında görüntü aşağı açılır menüde resim yığını birkaç Filmler karşılaştırıldığında görüntü yığını oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>Parlaklık/Kontrast lipid damlacıkları görünürlüğünü artırmak için aynı açılan menü altında ayarlayın.</li>
		<li>Görüntüleri lipid birikimi hayvanın vücut boyunca veya belirli dokulara göre kategorize.</li>
		<li>Lipid yerelleştirme daha iyi değerlendirilmesi ve belirsiz görüntü eserler ImageJ kullanarak tanımlanması için görüntü aşağı açılır menüsünden renk işlevi seçin ve yığın RGB sinyalleri her RGB bileşeninin göstermek için tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis.">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li><li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li><li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation.">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism.">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li><li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+lipidome:+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li><li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810 (2010).</li><li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).</li><li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+(CARS)+and+Stimulated+Raman+Scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li><li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans.">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Obezite ve metabolik hastalık oranları artış C. elegans hücre ve dokuların yağ birikimi düzenleyen mekanizmalar çalışmaya uygun bir model haline getirir. Son kanıtlar lipid düzeyleri değişiklikleri8, hormon reseptörleri2, üreme çıktı5aktivasyonu sinyal insülin arasında değişen hücresel süreçleri ile ilişkili gösteriyor. Etiket içermeyen mikroskobu ve Nil kırmızı ve petrol Kromatografi yöntemleri ile karşıl...

Lipidler yaşam için gerekli. Membranlar ayrılmaz bileşeni vardır, ikincil haberci hareket ve güç çeviriciler sinyal ve enerji depolama alanında çok önemli işlevlere sahiptir. Lipid metabolizma dysregulated olduğunda, obezite ve tip II diyabet, halk sağlığı sorunları9tuşuna basarak gibi hastalıklara yol açar. Caenorhabditis elegans (C. elegans) hangi nispeten kısa bir yaşam döngüsü, şeffaf bir beden, bilinen hücre soy ve tam sıralı genom olduğundan lipid metabolizma çalışmaya bir mükemmel model organizmadır. Öncelikle bir hermafrodit, C. elegans araştırmacılar isogenic hayvanlar çok sayıda kısa süreler metabolik genler ve yollar4geniş bir dizi çalışmaya carryout yüksek üretilen iş ileri genetik filtrelerine yükseltmek için izin verir. Bu yaklaşım koruma genlerdeki 273 C. elegans lipid metabolizma insanlar, fare, sıçan ve drosophila arasında yüksek derecede ortaya koymuştur. Ayrıca, metabolik sendrom11' e ilgisi olmayan hastalıklar ile ilişkili olan insan orthologues C. elegans 300'den fazla lipid genlerinde var. Geleneksel olarak, lipid depolama incelenmesi C. elegans içinde çoğunlukla lipid birikimi hakkında sağlam bilgi boya etiketli deneyleri üzerinde güvendi. Daha az ortak bir nerede lipidler yerelleştirilmesine ve lipid bereket ölçülen farklılıkları dokular arasında açıklamasıdır. Ancak, son iş lipid dağıtım olarak lipid birikimi6önemli olabilir ortaya koymuştur.
Son zamanlarda, çalışmaları gibi yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (HPLC-MS), Gaz Kromatografi-Kütle spektrometresi (GC-MS) yöntemlerle entegre başlamıştır ve tutarlı anti-Raman saçılması (CARS) mikroskopi adresine stokes eksiklikleri doğrudan lipid özleri, belirli lipid fraksiyonları ve lipid mevduat, sırasıyla10,11içeriğini analiz tarafından leke tabanlı yaklaşımlar. Ayrıca, arabalar mikroskobu Nil kırmızı yalnızca hedef kapalı otomatik floresan organelleri10/ boyama için hayati bir leke yol açar gibi bir sabitleştirici boya kullanımı için kullanıldığında yağ birikimi için bir proxy olarak hizmet verebilir ortaya koymuştur. Ancak, gerekli teknik uzmanlık ve maliyetleri bu Kromatografi ile ilişkili ve mikroskopi yöntemleri bunların kullanımı için birçok araştırma soruları savunulamaz yapabilirsiniz. Bu makalede, biz rahat ve güvenilir bir yöntem bağlamak ve Nil kırmızı kullanarak C. elegans yataklarında tarafsız lipid leke ve lipid bereket bütün hayvanlar ve belirli dokuları ayırt etmek için kırmızı O petrol tartışıyorlar.
Nil, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, kolayca çeşitli organik çözücüler çözülür, ama çoğunlukla suda çözünmeyen bir benzophenoxazone boya kırmızıdır. Trigliserit gibi nötr lipitler leke için mükemmel lysochrome boya kullanılan ya da kolesterol esterleri güçlü bir renk kullandığından de lipidler solubilizes, dokuları çevreleyen ile ihmal edilebilir etkileşim ve çözücü içinde daha az çözünür lipidler. 450-500 ve 520 nm, sırasıyla1uyarma ve emisyon maxima vardır. C. elegans kırmızı lekeli Nil için yeşil Floresans görüntülenirken, ayrık lipid organları bağırsak ve diğer dokuların içinde her iki kümeleri gözlenen olabilir veya eşit dağınık, hayvanın genotip veya deneysel tedavi bağlı olarak 7.
Yağ kırmızı O bir lysochrome, trigliserid ve lipoproteinler leke için kullanılan yağda çözünen boya olduğunu. Azo boya denir, çünkü onun kimyasal yapısı üç aromatik yüzük için bağlı iki azo grubu içerir. Hangi yağlar içinde yüksek oranda çözünür işler iyonize zordur. Leke rengi kırmızı ve onun ışık emilimi en fazla 518 nm 3. C. elegans yağ kırmızı O göstermek farklı dokuların6arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır hayvanın şeffaf vücut karşı öne kırmızı lipid damlacıkları ile lekeli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis elegans hangi lipid metabolizması ve enerji homeostazı çalışmaya bir olağanüstü model organizmadır. Birçok onun lipit genlerin insanlarda korunmuş ve metabolik sendrom veya diğer hastalıklar ile ilişkili. Bu organizma lipid birikimi incelenmesi sabitleştirici boyalar veya etiket içermeyen yöntemleri tarafından yürütülen olabilir. Sabitleştirici lekeleri gibi Nil kırmızı ve kırmızı O petrol ucuz, güvenilir yolu kantitatif lipid düzeyleri ölçmek için ve niteliksel lipid dağıtım dokular arasında sırasıyla gözlemlemek için vardır. Ayrıca, bu lekelerin çeşitli lipid metabolizma genler ve yolları yüksek üretilen iş tarama için izin verir. Ayrıca, hidrofobik doğaları lipid çözünürlük kolaylaştırır, dokuları çevreleyen ile etkileşim azaltır ve ayrılma çözücü içine önler. Bu yöntemler genel lipid içeriğin incelenmesi etkili olmasına rağmen onlar kimyasal bileşimi ve lipid mevduat çeşitliliği hakkında ayrıntılı bilgi vermeyin. Bu amaçlar, GC-MS ve araçların mikroskobu gibi yöntemler etiket içermeyen daha iyi için uygundur, maliyetlerini rağmen.

BZip, cytoprotective transkripsiyon faktörü homoloji memeli NRF2 ile paylaşan ve yağ asidi oksidasyon arabuluculuk göstermiştir SESN-1 dir. Onların yiyecek glikoz konsantrasyonu bağlı olarak yapısal aktif skn-1 gen kurtlarla ne zaman Nil kırmızı7ile lekeli farklı lipid düzeyleri göster. Şekil 1A -c aktif skn-1 hayvanlar lipid düzeyleri artan yol koşullarına maruz gösterir. NR Flor...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining at JoVE.com

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Nil sabit Caenorhabditis elegans boyama kırmızı tarafsız lipid mevduat, nicel ölçüm için bir yöntem ise petrol kırmızı O boyama doku arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K Görüntüleme.  University of Southern California. Nil sabit Caenorhabditis elegans boyama kırmızı tarafsız lipid mevduat, nicel ölçüm için bir yöntem ise petrol kırmızı O boyama doku arasında lipid dağıtım nitel değerlendirilmesi kolaylaştırır.

Video: Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Biyoloji

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

Karotis Cisimlerinde Leptin Sinyalizasyonunu Ve Solunum Kontrolüüzerindeki Etkilerini İncelemek İçin Deneysel Yaklaşım

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...