Bu çalışma Sağlık (AR-49419, DD), Müsküler Distrofi Derneği (DD) ve NIH eğitim bursu T90DK70105 (CH) Ulusal Enstitüleri ile hibe tarafından desteklenmiştir.

1. EDL kas Ex vivo kasılma ve Pasif Özelliklerinin Değerlendirilmesi EDL kasının kasılma ve pasif özellikleri in vitro kas testi sisteminde Aurora Bilimsel kullanarak ex vivo olarak ölçülür. Malzeme ve ekipman için Tablo 1&#39;e bakınız. 1.1 Ekipmanın hazırlanması <ol><li> Su ceketi doku banyosuna oxytube sabitleyerek doku-organ banyosuna birleştirin. Kas montaj aparatı monte banyo takın. Oxytube için gaz hattı bağlayın. Su ceketi doku banyosuna su sirkülasyon hatları sabitleyin ve banyo drenaj içine iğne vana yerleştirin. </li><li> Dolaşan su-banyosu ile kapatın ve 30 ° C&#39;de 7 sıcaklığını ayarlamak. 95% 5 PSI (inç kare başına pound) O 2 -5% CO 2 oxytube akmasına izin verin. Ringer tamponu ile banyo doldurun. En azından için tampon dengelemekOxytube valfi ile sürekli bir gaz akışı ile 10 dk. </li><li> (Uyarıcı, dual-mode kolu sistemi ve sinyal arayüzü) aletleri açın. Üreticinin talimatlarına göre dinamik kas kontrolü (DMC) yazılımı yükleyin. </li></ol> 1.2 EDL kasının diseksiyonu Bütün hayvan çalışmaları Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmalıdır. <ol><li> 2.5 ul / anestezik kokteyl (malzeme bölümüne bakınız) g vücut ağırlığı intraperitoneal enjeksiyonu ile fare uyuştur. Cerrahi prosedür boyunca, sedasyon derinliği ayak tutam yaparak kontrol edildi. Anestezi altında hayvan tutmak için gerektiğinde ilk anestetik dozunun% 10 oranında bir ek yönetilmektedir. Arka bacak Tıraş. Bir ısıtma yastığı üzerinde fare koyarak diseksiyon prosedür ° C önce 37 vücut sıcaklığı koruyun. Vücut sıcaklığı sürekli olarak, rektal temperat ölçülmesi ile izlenirtermal prob kullanılarak ure. </li><li> Diseksiyon kurulu (Şekil 1) üzerinde fare sırtüstü konumlandırın. Bacak cilt soyun arka bacak kasları ortaya çıkarmak. Iki terzi pimleri, grasilis kas ayak diğeri kullanarak Sylgard blok bacak sabitleyin. 37 iç vücut ısısını korumak için fare vücut üstünde bir ısı lambası yerleştirin ° C. Sürekli Ringer tamponu ile açıkta kalan tüm kasları superfuse. Bir vakum hattı sayesinde aşırı tampon boşaltın. </li><li> Distal TA tendon ve ayak doğru cilt diseksiyon bir stereomikroskop altında ekstansör ligaman Açığa. Yavaşça TA kası örten fasya çıkarın. Distal TA tendonun serbest ekstansör bağ kesin. </li><li> Distal TA tendonu kesin ve TA kas kalkmasına kullanabilirsiniz. Dikkatlice proksimal eki de TA kas kaldırın. TA kas damar rüptürü nedeniyle kanama absorbe EDL kasının yanında Ringer tampon batırılmış pamuk ince bir parça yerleştirin. Aşırı tampon ve kan temizlemek için vakum hattı kullanın. </li><li> Distal EDL kasının kas tendon bileşkesine (MTJ) (Şekil 2) bir ekmek ipek sütür kullanarak bir döngü düğüm tarafından izlenen bir çift kare knot kravat. Proksimal EDL kasının açığa biseps femoris kasının distal kısmına bir kesi olun. Proksimal EDL tendon MTJ de knot aynı seti (Şekil 2) tekrarlayın. Aynı sütür hattı kullanarak bir çift kare düğüm ile proksimal veya distal knot birine kol kanca takın. Kalan sütür hattı kesti. </li><li> Proksimal sütür düğümü üstün proksimal EDS tendonu kesin. Kanca ile EDL kasının yukarı kaldırın ve kas altında damar kesti. Arka bacak arasından EDL kasının çıkarmak için distal sütür düğümü aşağı distal EDS tendonu kesin. Ringer tampon batırılmış bir parça pamuk ile maruz arka bacak örtün. </li><li> Kol için kanca takın. Dikey olarak kas hizalamaiki elektrot arasında. Sabit yazılan distal sütür hattı sabitleyin. Daldırın Ringer tampon kas dokusu banyo yukarı kaldırın. Iki ince / kaba çeviri aşama kullanılarak 1.0 g istirahat gerilim ayarlayın ve kas en azından 10 dakika için denge sağlaması için izin verir. </li></ol> 1.3 EDL kasının kasılma ve pasif özellikleri Ölçüm Aşağıdaki ölçümler her biri için yazılım DMC içinde parametrelerini ayarlamak için Tablo 2 kullanın. Dinamik kas analizi (DMA) yazılımını kullanarak verileri analiz edin. 1.3.1 EDL kasının kasılma özelliklerinin ölçülmesi <ol><li> Kas 8 stabilize etmek dışında 60 sn ile 150 Hz&#39;de EDL kasının üç kez teşvik. </li><li> Optimal uzunluğu (Lo) belirlemek için farklı dinlenme gerilimleri EDL kasının teşvik. Optimum uzunluğu kas maksimum kasılan gerginliği geliştirir hangi uzunluğudur. Ile kas izin2 dakika dinlenin. </li><li> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın. Tek seğirme stimülasyon az kas kuvveti ölçün. Mutlak seğirme kuvveti (Pt), pik gerilimi (TPT) ve Pt yarısından gevşeme zamanı (½ RT) için zaman belirleyin. Kas 2 dk dinlendirilir. </li><li> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın. Farklı stimülasyon frekansları (50, 80, 100, 120, 150 ve 200 Hz) üretilen tetanik kas kuvveti ölçün. Kas kuvveti maksimal ulaştığında mutlak maksimal tetanik kas kuvveti (Po) belirleyin. TPT ve ½ Po 9 RT ölçün. </li><li> Kas 5 dk dinlendirilir. Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın. Çevrimleri arasında 2 dk dinlenme ile eksantrik kasılmalar 10 döngüleri uygulayın. Eksentrik her döngüden sonra Po göreli gücü kaybını hesaplayınız. </li><li> Cihazdan EDL kasının ayırın ve dikiş yerinde tendonlar kesilir. Kas ıslak ağırlık belirleyin ve kas kesit alanı (CSA) hesaplamak6,10. </li></ol> 1.3.2 EDL kasının pasif özelliklerinin ölçülmesi <ol><li> Kontralateral EDL kasının inceleyin ve Bölüm 1.2 &#39;de açıklandığı gibi cihazla birleştiriniz, 2 ila 7 adım. </li><li> Kas 10% Lo bir artış ile% 160 Lo gergin bir altı adım germe protokolü Konu EDL kasının. Gerilme-deformasyon profili 6. Çözümle. </li><li> 10% Lo germe ve kas tutarak sonra aşağıdaki süreler de stres gevşeme oranı (SRR) ölçerek EDL kasının viskoz özelliği Değerlendirin: zirveden 0.1s sonrası pik (puan), 0.1 0.2s için 0,2 ila 0,5 s pp dan 0.5 &#39;dan 1S ppm&#39;e ve 1 ila 1.5s pp için pp, </li><li> Fare anestezi altında iken Çalışmanın sonunda, servikal dislokasyon ve / veya dekapitasyon ile fare ötenazi. Cihazdan EDL kasının ayırın ve dikiş yerinde tendonlar kesilir. Kas ıslak ağırlık belirleyin ve kas çapraz se hesaplamakctional alanı (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Yerinde TA Kası Kontraktil Özelliklerinin Değerlendirilmesi TA kasının kasılma özelliklerinin yerinde kas testi sisteminde Aurora Bilimsel kullanılarak ölçülür. Malzeme ve ekipman için Tablo 1&#39;e bakınız. 2.1 Ekipmanın hazırlanması <ol><li> 37 termo-kontrollü hayvan sahne kadar ısıtın ° C dolaşan su banyosu kullanılarak. </li><li> (Uyarıcı, dual-mode kolu sistemi ve sinyal arayüzü) aletleri açın. Üreticinin talimatlarına göre DMC yazılımı yükleyin. </li></ol> Yerinde kuvvet ölçümü için TA kas 2.2 hazırlanması <ol><li> Fare anestetize, arka bacak ve tıraş Bölüm 1.2 &#39;de 3 ila adım 1 de tarif edildiği gibi TA kas maruz. </li><li> Patella ligament USI etrafında bir çift kare düğüm Kravatng bir ekmek ipek sütür. Distal TA kas MTJ (Şekil 2) bir döngü düğüm tarafından izlenen bir çift kare düğüm Kravat, aynı sütür hattı kullanılarak distal TA tendon düğüm bir ~ 10 mm döngü bırakarak başka bir çift kare düğüm. Döngü tarafındaki ikinci çift kare düğüm yerleştirin. </li><li> Arka bacak arasından işaretçilerine çıkarın ve hayvan eğilimli konumlandırmak. Biseps femoris kas Açığa. Siyatik sinir ortaya orta hatta bir kesi olun. Siyatik sinirin proksimal ucunun etrafında bir çift kare düğüm Kravat. Sütür hatlarının bir tarafı Trim ve düğüm üstün sinirlerini kesti. Yavaşça, dikiş hattı kullanarak diz doğru siyatik sinir çekin ve özgür çevreleyen bağ dokusu ~ uzunluğu 5 mm temizleyin. Bu işlem sırasında sinir germek ve sürekli zil tamponu ile sinir superfuse etmeyin. </li><li> Olarak 3&#39;e kadar olan adımları 1 &#39;de tarif kontralateral TA kas hazırlayın. Ri bir parça ile maruz arka bacak biri Kapaknger tampon pamuk ıslatılır. Sürekli önceden ısıtılmış (37 ° C) Ringer tampon ile arka bacaklarda hem superfuse. Bir vakum hattı sayesinde aşırı tampon çıkarın. </li><li> Hayvan platformda eğilimli hayvan yerleştirin. Hayvan platforma diz kelepçe tutucu takın ve patella ligament dikiş hatları kullanarak çift kare knot ile metal pin her iki diz sabitleyin. Terzi işaretçilerine kullanarak Sylgard blokta iki ayak Pin. Termo-kontrollü sahneye hayvan platformu sabitleyin. 37 ° C &#39;de hayvansal iç vücut ısısını korumak için ısı lambası konumu </li><li> Hayvan platforma elektrot tutucu sabitleyin ve sütür hattı kullanarak elektrot üzerinde siyatik sinir yatıyordu. Uzaklıkta arka bacak kaslarından elektrodu tutun. MTJ dikiş yerinde örtünmeyen arka ekstremite distal TA tendonu kesin. Kol kanca distal TA tendon dikiş döngü takın. Sıcak bir Ringer tampon batırılmış pamuk ile maruz arka bacak kası örtün. </li></ol><ol><li> DMC yazılım parametrelerini ayarlamak için Tablo 2 kullanın. TA kas kasılma özelliklerini belirlemek için Bölüm 1.3.1 &#39;de tarif edilen aynı protokol takip edin. DMA yazılımını kullanarak verileri analiz edin. </li><li> Kasılma özelliği ölçüm yapıldıktan sonra, tesviye kol kanca distal TA tendon dikiş döngü ayırın. TA kas çıkarın. Kas ıslak ağırlık belirleyin ve CSA 10 hesaplayabilirsiniz. </li><li> 1-3 Yukarıda açıklanan aşamalara göre kontralateral TA kas kasılma özelliklerini ölçün. Çalışmanın sonunda, kurumsal kurallarına göre fare Euthanize. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, kontraktil ve pasif özellikleri EDL kasının ve TA kas kasılma özelliklerini ölçmek için fizyolojik testler gösterdik. Kas fizyolojisi çalışmalarında önemli bir endişe hedef kas oksijenasyonu olduğunu. Ringer tampon oksijen difüzyon in vitro assay bir de kas merkezine ulaşmak olmayabilir, çünkü büyük kaslar (örneğin TA kas gibi), in situ yaklaşım tercih edilmektedir. Yerinde bir yaklaşım olarak normal kan temini ve hipoksi ile ilişkili rahatsız etmez yapay etkilerinden kaçınılır. EDS, kas fizyolojisi içine alan en yaygın olarak kullanılan kas biridir. Tüm kas yeterli oksijen dolayı kas boyutunun küçük in vitro sistemde de elde edilebilir. Bundan başka, in vitro sistem içinde kapalı bir iyon konsantrasyonu (Ca2 +, Na + ve K +) işlemek için çevre ve kimyasal içerirOptimal kas gücü üretimi için gerekli olan kalori (ATP ve glikoz). Bu kuvvet üretimi bu değişkenlerin etkisini incelemek için büyük bir fırsat sunuyor. Ekstremite kas kasılma ve pasif özellikleri doğru ölçülmesi iskelet kası fonksiyonu çalışma için çok önemlidir. Bu özelliklerin Karakteristik değişiklikler genellikle çeşitli kas hastalıklarından diğerlerinden ayıran olarak kabul edilmektedir. Bu parametrelerde değişiklikler de deneysel bir tedavinin etkili olup olmadığını belirlemek için önemli göstergelerdir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme </td><td> Üretici </td><td></td><td> Özellikler ve yorumlar </td></tr><tr><td> Doku-organ banyosu </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Su-ceket doku banyosu (Cat # 158351-LL), Oksijen dağıtıcı boru (Cat # 160192), Luer kapak (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Su banyosu Sirkülasyon </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gaz karışımı </td><td> Airgas Ulusal, Charlotte, NC, ABD </td><td></td><td> % 95 O 2 ve% 5 CO 2 </td></tr><tr><td> In vitro kas fonksiyonu testi tertibatta </td><td> Aurora Bilimsel, Aurora, ON, Kanada </td><td></td><td> Sistemi uyarıcısı (Model # 701A), çift modlu bir kaldıraç sistemi (Model # 300C veya 305C), bir sinyal arayüz (Model # 604B) ve bir test ap oluşurparatus (Model # 800A) dikey doku organ banyosuna monte etmek </td></tr><tr><td> In vitro kas fonksiyonu testi yazılımında </td><td></td><td></td><td> Dinamik kas kontrolü (DMC) yazılım ve dinamik kas kontrolü veri analizi (DMA) yazılımı </td></tr><tr><td> % 0.9 NaCl içinde karıştırılır Fare anestezi kokteyl </td><td> Kurumsal düzenlemeler bakın </td><td></td><td> Ketamin (25 mg / ml) ve ksilazin (2.5 mg / ml) ve Acepromazine (0.5 mg / ml). Cerrahi prosedür boyunca, başlangıç ​​dozunun% 10 ek anestezi altında hayvan tutmak için gerekli olabilir. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dünya Precision Instrument </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> Bir ısmarlama pleksiglas diseksiyon kurulu </td><td> Tasarlanmış evde </td><td></td><td> Şekil 1 &#39;e bakınız </td></tr><tr><td> Isıtma lambası </td><td> Tensör Aydınlatma Firma,Boston, MA, ABD </td><td></td><td> Diseksiyon sırasında fare sıcak tutmak için 15 Watt lamba </td></tr><tr><td> Ringer Tampon </td><td> Kimyasallar Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD satın alınan </td><td></td><td> MM Kompozisyon: 1.2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), 4.83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 CaCl2 (Cat # C79) ve 10 glikoz (Cat # D16). Bireysel kimyasallar çözülür ve yukarıda listelenen sipariş karıştırabilirsiniz. 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> Stereo diseksiyon mikroskobu </td><td> Nikon, Melville, NY, ABD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları </td><td> Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Kaba forseps, kaba makas, ince forseps (Düz ve 45 ° açı) </td></tr><tr><td> # 4-0 Örgülü ipek sütür </td><td> SofSilk USSC Sularda, Norwalk, CT, ABD </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Bir ısmarlama paslanmaz çelik kanca </td><td> Küçük Parçalar, Inc </td><td></td><td> 2&#39;&#39; kuvvet dönüştürücü 305C veya 2.5 için uzun S / S 304V (0.18&#39;&#39; çap)&#39;&#39; dönüştürücü 300C için uzun S / S 304V (0.012&#39;&#39; çap) (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> Yerinde kas fonksiyonunu test sisteminde </td><td> Aurora Bilimsel, Aurora, ON, Kanada </td><td></td><td> Sistemi (809B, in situ fare aygıtı içinde) bir uyarıcı (Model # 701B), çift modlu bir kaldıraç sistemi (Model # 305C), bir sinyal arayüz (Model # 604A) ve bir termo kontrollü ayaklıklar aparatı (Model # 809A oluşur ) </td></tr><tr><td> In vitro kas fonksiyonu testi yazılımında </td><td> Aurora Bilimsel, Aurora, ON, Kanada </td><td></td><td> Dinamik kas kontrolü (DMC) yazılım ve dinamik kas kontrolü veri analizi (DMA) yazılımı </td></tr><tr><td> Bir ısmarlama TA tahlil hayvan platformu </td><td> Tasarlanmış evde </td><td></td><td> Şekil 2 &#39;ye bakınız </td></tr><tr><td> Bir ısmarlama paslanmaz çelik kanca </td><td> Küçük Parçalar, Inc </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0.5&#39;&#39; Uzun S / S 304V (0.18&#39;&#39; çap) </td></tr><tr><td> Ismarlama 25G platin elektrot </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> İki 24G elektrik tellerine Lehim iki 0.016&#39;&#39; kalınlığında platin telleri </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Malzemeler ve ekipmanlar.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Vücut hareketleri özellikle iskelet kası mekanik fonksiyon tarafından sağlanmaktadır. İskelet kası intramüsküler bağ dokular tarafından kılıfa myofibers sayısız demetleri oluşur. Her bir myofiber myofiber uzunluğu boyunca uzunlamasına çalışır çok miyofibril içerir. Miyofibril kas kasılma cihaz olup, sarkomerlerin olarak bilinen tekrar eden birimler kontraktil oluşmaktadır. Bir sarkomer ünitesi Z diskleri ve titin protein tarafından aralıklı aktin ve miyozin filamentleri içerir. İskelet kası mekanik fonksiyon kas kasılma ve pasif özellikleri ile tanımlanır. Kasılma özelliği kas kasılması, kas gevşeme bölgesinin kuvvet kuşak ve bir zaman süresi esnasında oluşan kuvvet miktarını karakterize etmek için kullanılır. Kas kasılması (örneğin aktin ve miyozin filamentler, kalsiyum homeostazı, ATP / ADP oranı, vb arasındaki etkileşim gibi) etkileyen her türlü faktörü kontraktil prope etkilerrties. Pasif özelliklere daralma yokluğunda kas elastik ve yapışkan özellikleri (sertlik ve viskozite) bakın. Bu özellikler, 1-2 (özellikle kolajen) hücre dışı ve hücre içi yapısal bileşenleri (örneğin, titin gibi) ve bağ dokusu ile tespit edilir. Kasılma ve pasif özellikleri kas fonksiyonu birbirinden ayrılamayan iki yönü vardır. Örneğin, dirsek fleksiyon üst kolun arka bölme içinde üst kol ve kas pasif kolunun ön bölme içinde kaslarının kasılmasına ile gerçekleştirilir. Gerçekten kas fonksiyonu anlamak için, hem de kasılma ve pasif özellikleri incelenmelidir. Kas kasılma ve / veya pasif mekanik özellikler genellikle kas hastalıklarında da başkaları vardır. Buna iyi bir örnek Duchenne müsküler distrofi (DMD), distrofin eksikliği 3 ile oluşan hastalık israf ciddi bir kastır. Distrofin bir sitoskeletal prote olduğunuBu kas kasılması 4 sırasında kas hücresi zarı (sarcolemma) dengeler. Distrofinin yokluğunda, sarcolemma kuvvet aktarımı sırasında oluşturulan makaslama kuvveti ile zarar görmüş. Yırtılma Bu membran kas hücre ölümü ve kontraktil makine kaybına yol açan bir zincir reaksiyon başlatır. Bunun bir sonucu olarak, kas kuvveti azalır ve ölü myofibers fibrotik doku 5 ile değiştirilir. Bu daha sonra değişiklik kas sertliği 6 artırır. Bu değişikliklerin ortaya konması hastalığın ilerlemesini değerlendirmek ve yeni gen / hücre / farmakolojik müdahalelerin tedavi etkinliğini belirlemek için önemli bir kılavuz sağlar. Burada, ekstansör digitorum longus (EDL) kas ve tibialis anterior (TA) kas kasılma özelliklerinin hem kasılma ve pasif mekanik özelliklerini değerlendirmek için iki yöntem sunar.

Aşağıdaki sonuçlar önceki raporlarımızda 6,9 bir temsilidir. Veriler ortalama ortalama ± standart hata olarak sunulmuştur. Tablo 3. Normal BL10 ve yaşı 4 ila 6 ayda distrofin eksikliği (mdx) farelerde EDL kasının morfometrik özelliklerini gösterir. Şekil 4 temsili kasılma ve pasif özelliklerini gösterir BL10 ve mdx fareler EDL kasının. EDS kasının kasılma özelliklerini spesifik (mutlak CSA bölünmüş kuvvet) seyirme kuvvet (Şekil 4A), belirli bir maksimum kuvvet tetanik (Şekil 4B), TPT ve yarım maksimum mutlak tetanik kuvvet RT dahil olmak üzere, aşağıdaki terimler ile tanımlanır (Şekil 4C, D). TPT ve ½ RT de mutlak kasılan kuvveti hesaplamak mümkündür. Stres-gerilme profili (Şekil 4E) ve SRR (Şekil 4F) birEDL kasının pasif özelliklerini tanımlamak için kullanılır yeniden. Distrofin yokluğu EDL kasının 6,9 kasılma ve pasif özellikleri üzerinde önemli bir etkisi vardır. Belirli seğirme ve tetanik güçleri önemli ölçüde mdx EDL kasının azalır. ½ RT mdx EDL kasının daha yavaş iken TPT çok daha hızlıdır. Stres-gerilme profili bu sertliği belirgin mdx EDL kasının artış olduğunu göstermektedir. Sonrası yüksek gerilimleri daha hızlı düşüş ise mdx EDL kasının da tepe stres ulaşmadan önce bir ölçüde çok daha yüksek direnç kuvveti (pasif stres) vermektedir. Ayrıca, SRR BL10 EDL kasının kıyasla mdx EDL kasının anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. İstatistiksel analiz İki grup arasında istatistiksel anlamlılık Student t-testi ile analiz edilmiştir. Ler içinBirden gruplar arasında tatistical önemi, Tek yönlü veya Bonferroni post hoc analizi takiben iki-yönlü ANOVA analizi SAS yazılımı (SAS Institute Inc, Cary, NC) kullanmanız önerilir. Fark durumunda p &lt;0.05 anlamlı olarak kabul edilmektedir. Tablo 1. Malzemeler ve ekipmanlar. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Deney </td><td class="jove_content_small"> Dinlenme gerginlik (gram) </td><td class="jove_content_small"> Darbe frekansı (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Puls genişliği (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stimülasyon süresi (ms) </td><td class="jove_content_small"> Streç uzunluğu </td><td class="jove_content_small"> Streç süresi (ms) </td><td class="jove_content_small"> Streç oranı </td><td class="jove_content_small"> Yorumlar </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. EDL kasının ex vivo kasılma ve pasif özelliklerin değerlendirilmesi </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 EDL kasının kasılma özelliklerinin ölçülmesi </td></tr><tr><td> 1. Isınmak </td><td> 1.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Her uyaran arasındaki 60 saniye boyunca kas dinlendirin. Bunlar ön tetanik kasılmalar sonraki ölçümler için kas stabilize. </td></tr><tr><td> 2. Optimal kas uzunluğu (Lo) </td><td> 0.5, 1.0, 1.5 ve 2.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Kas Her uyaran arasındaki 30 saniye dinlenmek için izin verin. Bir dijital kumpas kullanılarak kas optimum uzunluğunu ölçün. </td></tr><tr><td> 3. Tek twitch kuvveti (Pt) </td><td> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Tetanik kas kuvveti </td><td> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 ve 200 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Kas her uyaran arasında 1 dakika dinlenmek için izin verin. Maksimal mutlak tetanik kuvvet (Po) oluşturmak frekansı belirleyin. </td></tr><tr><td> 5. Eksantrik kasılma </td><td> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın </td><td> Maksimum tetanik kuvvet (Po) üretir frekansı kullanın </td><td> 0.2 </td><td> 700 </td><td> % 10 Lo </td><td> stimülasyon süresinin son 200 ms </td><td> 0.5 Lo / sn </td><td> Çevrimleri arasında 2 dk dinlenme ile 10 döngü için eksentrik tekrarlayın. </td></tr><tr><td> 6. EDL kasının CSA </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (kas kütlesi (g) / [1.06 g / cm 3 x (Lo x 0.44)]. 1.06 g / cm 3 kas yoğunluğu ve 0.44 oranı Lo EDL kas lif uzunluğu. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 EDL kasının pasif özelliklerinin ölçülmesi </td></tr><tr><td> 1. Altı adım protokolü germe </td><td> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın </td><td></td><td></td><td></td><td> % 10 Lo </td><td></td><td> 2 cm / sn &#39; </td><td> % 160 Lo ulaşıldığında kadar Lo% 10 bir artış ile germe protokolü tekrarlayın. Streç döngüleri arasındaki alow 1,5 sn. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Lo dinlenme gerginliğini ayarlayın </td><td></td><td></td><td></td><td> % 10 Lo </td><td></td><td> 2 cm / sn &#39; </td><td> SSR t gerilme farkı bölünmesiyle hesaplanırime bir zaman dilimi içinde iki zaman nokta arasında geçen. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2.3 TA kas kasılma özelliklerinin ölçülmesi </td></tr><tr><td> 1. Isınmak </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Her uyaran arasındaki 60 saniye boyunca kas dinlendirin. </td></tr><tr><td> 2. Optimal kas uzunluğu (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 ve 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0.2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Kas Her uyaran arasındaki 30 saniye dinlenmek için izin verin. Bir dijital kumpas kullanılarak kas optimum uzunluğunu ölçün. </td></tr><tr><td> 3. TA kas CSA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (kas kütlesi (g) / [1.06 g / cm 3 x (Lo x 0.6)]. 0.6 Lo ra TA kas lif uzunluğutio. </td></tr></tbody></table> Tablo 2. EDL ve TA kasların mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi için Parametreler. <table border="1"><tbody><tr><td> Zorlanma </td><td> Yaş (ay) </td><td> Vücut ağırlığı (g) </td><td> EDS ağırlığı (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDS, CSA (mm2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32.03 ± 0.57 </td><td> 13.90 ± 0.77 </td><td> 14.09 ± 0.04 </td><td> 2.12 ± 0.12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35.44 ± 0.42 * </td><td> 16.73 ± 0.42 * </td><td> 13.93 ± 0.05 * </td><td> 2.57 ± 0.07 * </td></tr></tbody></table> Tablo 3. MD EDL kas morfometrik özellikleri. * Değerinex fareler arasında BL10 fareler yaştaki önemli ölçüde farklı olduğunu. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Şekil 1. Ismarlama fare diseksiyon kurulu şematik diyagramı. Diseksiyon kurulu bir ½ inç kalınlığında pleksiglas malzemeden yapılmış ve kurumsal dükkanında imal edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Şekil 2. MTJ bir döngü düğüm tarafından izlenen bir çift kare düğüm bağlama aşamalarını gösteren dijital görüntüler bir dizi. Asterisk,EDL kasının; Ok, EDL kasının distal tendon. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Şekil 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Şekil 3,. Yerinde TA kas fonksiyonu tayininde için ısmarlama platformu şematik diyagramı. Pleksiglas hayvan platformu ve paslanmaz çelik diz tutucu in situ fare aygıtı içinde 809B üzerine monte edilmek üzere tasarlanmıştır. * Paslanmaz çelik çubuk (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR); #, Evrensel elektrot tutucu (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR); §, elektrot eki çubuk (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Sylgard blok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Şekil 4. EDL kasının kasılma ve pasif özellikleri Temsilcisi sonuçları. EDL kasının kasılma özellikleri Belirli bir seğirme kuvveti (A), spesifik tetanik kuvvet (B), tepe noktası gerilimi (C) ve yarı gevşeme süresi (D) için süre ile karakterize edilir. EDS kas pasif özellikleri gerilme şekil profil (E) ve SSC ile değerlendirilir. *, MDX farelerden alınan BL10 fareler yaş grubundaki önemli ölçüde farklıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice at JoVE.com

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Ekstremite kas kasılma ve pasif mekanik özelliklerinde değişimler kas hastalıkları için önemli belirteçler vardır. Bu yazıda murin ekstansör digitorum longus ve tibialis anterior kaslar bu özellikleri ölçmek için fizyolojik testler anlatılmaktadır.

Ekstansör digitorum longus kas ve kas Fonksiyonunun Değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Ve tibialis anterior kas<em&gt; Yerinde</em&gt; Farelerde

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K Görüntüleme.  University of Missouri. Ekstremite kas kasılma ve pasif mekanik özelliklerinde değişimler kas hastalıkları için önemli belirteçler vardır. Bu yazıda murin ekstansör digitorum longus ve tibialis anterior kaslar bu özellikleri ölçmek için fizyolojik testler anlatılmaktadır.

Video: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biyoloji

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli<emIn vivo</em&gt; Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...