Exvivo model, çeşitli fizyolojik müdahalelerin ve farmakolojik bileşiklerin ve kas glukoz alımının etkisini değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir. Bu teknik, sağlam bir hayvan modeline müdahale edebilecek kafa karıştırıcı faktörlerin yokluğunda, izole fare iskelet kasında glikoz alımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bir deneye başlamadan önce, entegre kas şeridi biyografi sistemini açın ve odaları 30 santigrat dereceye ısıtın.
Veri toplama yazılımını açın ve veri kümeleri arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için cebri dönüştürücüleri kalibre edin. Her bir inkübasyon odasına dört mililitre önceden ısıtılmış 30 santigrat derece bazal inkübasyon ortamı ekleyin ve ortamın sürekli olarak% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit ile oksijenlendiğinden emin olun. Fareyi bir diseksiyon tepsisinde yüzüstü konuma getirin ve pedal refleksine yanıt verilmediğini onaylayın.
Sonra bir iğne ile tek bir ön pençeyi sabitleyin. Hem aşil tendonu hem de diz eklemi görünene kadar cildi alt bacaktan çıkarmak için makas kullanın. Soleus kasının diseksiyonu için, 16 santimetrelik emilemeyen cerrahi naylon bir dikiş parçasından hazırlanan 0.4 santimetre çapında tek bir dikiş ilmeğini aşil tendonuna bağlayın ve aşil tendonuna ditel olarak peen forsepsleri döngüye sabitleyin.
Soleus ve gastroknemius kaslarını pençeden serbest bırakmak için kesin ve soleus kasını ortaya çıkarmak için peen forsepslerini fare boyunca dikkatlice kaydırın. Peen forsepslerini sabitleyin ve soleus kasının proksimal tendonunun etrafına ikinci bir dikiş halkası yerleştirin. Proksimal tendonu kesin ve gastroknemius kasından arındırılmış iki bağlı sütür halkası da dahil olmak üzere soleus'u diseke edin.
Toplandıktan sonra, soleus kasını inkübasyon odalarından birindeki ilgili kancalara hızlı bir şekilde bağlamak için halkaları kullanın. Tibialis anterior kasını kaplayan fasyayı çıkarmak için forseps kullanın. Tibialis anterior veya EDL kaslarının distal tendonları açık beyaz, görünür ve birbirinden ayrı olmalıdır.
Tibialis ön kasının damıtılmış tendonunu kesin ve kası diseke edin. EDL kasını çevreleyen dokulardan nazikçe serbest bırakmak için forseps kullanın ve tendonları kesmeden kası sağlam bırakın. Damıtma ve proksimal EDL tendonlarının etrafına bireysel sütür halkaları yerleştirin.
Döngüler yerleştirildiğinde, EDL kasını dikiş halkaları takılı olarak serbest bırakmak için tendonları kesin ve halkaları ikinci inkübasyon odasındaki kancalara hızlı bir şekilde takın. Daha sonra her kasın dinlenme gerginliğini yaklaşık beş milinewtona ayarlayın ve deneye başlamadan önce kasların ortamda en az 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. İnsülin ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için, odalardaki bazal inkübasyon ortamını insülinsiz inkübasyon ortamı, submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu veya 20 dakikalık bir inkübasyon için maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu ile değiştirin.
Stimülasyon süresinin sonunda, inkübasyon ortamını, 10 dakikalık bir inkübasyon için aynı insülin konsantrasyonunu içeren glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirin. Glikoz alım inkübasyonunun sonunda, kasları inkübasyon odalarından dikkatlice çıkarın ve numuneleri buz gibi soğuk bazal inkübasyon ortamında yıkayın. Yıkamadan sonra, kasları filtre kağıdında hızla kurutun ve sıvı azotta dikiş halkaları olmadan dokuyu dondurun.
Daha sonra 20 santigrat derece depolama ve kas glikoz alım analizi için her odadan 100 mikrolitre glikoz alım inkübasyon ortamı toplayın. Kasılmayı uyaran glikoz alımını ölçmek için, platin elektrotları merkezi olarak ve inkübasyon odalarındaki kasların her iki tarafına yerleştirin ve bazal inkübasyon ortamını glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirdikten hemen sonra kas kasılmasını başlatın. Her inkübe edilmiş kastan zorla üretimi kaydedin.
10 dakika sonra, gösterildiği gibi kasları nazikçe toplayın ve dondurun, gösterildiği gibi kas glikoz alım analizi için her odadan glikoz alım inkübasyon ortamının 100 mikrolitre alikotunu saklayın. Aynı kas numunesi setinde batı lekelenme analizi ile miyosellüler sinyalleşmeyi belirlemek için, her dondurulmuş kas örneğini 400 mikrolitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda homojenize edin ve numuneyi dört santigrat derecede bir saat boyunca uçtan uca döndürün. Daha sonra santrifüjleme yoluyla lisansı toplayın ve standart batı leke analiz protokollerine göre her numune paletindeki ilgili protein miktarını ölçün.
Her numunedeki glikoz alımını ölçmek için, şişe başına üç mililitre sıvı sintilasyon sıvısı içeren sıvı sintilasyon sayma şişelerini ayırmak için her numuneden 150 mikrolitre süpernatant ve ilgili inkübasyon odalarından 25 mikrolitre glikoz alım inkübasyon ortamı ekleyin. Daha sonra şişeleri bir sıvı sintilasyon sayacına yükleyin ve üreticinin yönergelerine göre iki deoksiglikoz ve mannitolün radyoaktivitesini ölçün. Bu temsili analizde, bazal glukoz alım oranları, dişi farelerden izole edilen soleus ve EDL kasları arasında benzerdi.
Glukoz alımı, hem submaksimal hem de maksimal olarak etkili insülin konsantrasyonlarına yanıt olarak soleus ve EDL kaslarında artmıştır. Ayrıca, hem submaksimal hem de maksimal insülin uyarılmış glukoz alımları soleus kasında anlamlı derecede yüksekti. Buna karşılık, kasılmaya bağlı glikoz alımı, EDL'de soleus kasına kıyasla anlamlı derecede yüksekti.
Burada 10 dakikalık stimülasyon periyodu boyunca soleus ve EDL kaslarında üretilen maksimum kas kuvveti gözlemlenebilir. Beklendiği gibi, EDL kası stimülasyon periyodunun ilk bölümünde daha fazla kuvvet üretti, ardından stimülasyon periyodunda daha sonra hızlı bir düşüş oldu. Submaksimal ve maksimal insülin konsantrasyonları Akt treonin 308 ve TBC1D4 Serin 588'in fosforilasyonunda bir artışa neden olurken, kasılma AMPK Alpha treonin 172 ve ACC serin 212'nin fosforilasyonunda bir artışa neden olmuştur.
Ne insülin ne de kasılma, toplam protein içeriğinde bir değişikliğe yol açmadı. İzole fare kaslarında glikoz alımını ölçmeye çalışmadan önce, soleus ve EDL kaslarının diseksiyonunu iyice uygulamak hayati önem taşır. Kas glikoz alımının değerlendirilmesini takiben, kalan kas proteini lizat, glikoz alım oranlarında gözlenen değişiklikleri aydınlatabilecek ek biyokimyasal analizler için kullanılabilir.
