Bu çalışma Paul D. Wellstone Kooperatif Araştırma Merkezi (AR052646) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler Pennsylvania IACUC Üniversitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. 1. EDL Diseksiyon ve Hazırlama (yaklaşık 30 dk) <ol><li> Onlar işlem sırasında herhangi bir ağrı veya sıkıntı yaşamaya emin olmak için fareler uyuştur, ama iyi dolaşımını kaslar tarafından kalmasını oksijenli. Biz rutin IP üzerinden enjekte Ketamin / xylazine kokteyl (100/10 mg / kg) kullanın. Anestezi Cerrahi düzlemi pedalı veya palpedral çekilmesi refleksler, veya kulak seğirme yanıtı eksikliği tam yokluğu ile belirlenir. </li><li> Tıbbi bant kullanarak arka ayaklarında hareketsiz, ve bu bölgenin kasları ortaya çıkarmak için ön alt bacak ve deri kaldırmak. Düzenli aralıklarla PBS uygulama ile kas nemli tutun. </li><li> Diseksiyon kapsamında, EDL kasının proksimal tendon ortaya koymak için diz lateral küçük bir kesi yapmak. İşte bu bölgede iki tendon, ve her ikisi de yeniden sağlamak için kesilmelidirEDL moval. </li><li> Medial ayak bileği, meta tarsals boyunca uzanan EDL distal tendon, açığa TA kas tendon kesti. EDL altında kesmek veya dokunmamaya dikkat ederek, yol TA kas dışarı doğru kaldırın. , EDL distal tendon dön kırt her biri ve daha sonra tendon kavrama, ayak bileği ile bunları çizmek, yavaşça bacak geri kalanı uzak EDL çekin. Serbestçe proksimal ucundan serbest, ama değilse, tendonu kesilmiş olduğundan emin olmak için lateral insizyon dönmesi gerekir. Soğutulmuş oksijenli Ringers dolu bir diseksiyon çanak kas ve yer çıkarın. In vivo olarak bulunan uzunluğu yaklaşık olarak dinlenme süresi, de tendon ile kas Pim. Kas diseksiyon işaretçilerine çekerek ise uzunluğu kas çanak sarkık olduğunda çok kısa ve çok uzun. </li><li> Servikal dislokasyon ile kas çıkarılması hemen ardından fareyi Euthanize. </li><li> On sütür Tiemümkün olduğu kadar yakın kas, ancak kas dokunmadan değil Dons. Sütürler kullanılarak yaklaşık istirahat boyunda kas Pin. </li></ol> 2. Diyafram Diseksiyon ve Hazırlama (yaklaşık 30 dk) <ol><li> Aynı fare hem diseksiyonları maruz kalıyorsa, anestezi altında servikal dislokasyon ile önce bu prosedüre fareler Euthanize veya CO 2 ile servikal dislokasyon ile teyit izledi. </li><li> Karın ve göğüs boşluğuna maruz deride bir kesi olun. Karın boşluğu açın ve sadece kaburga altında vücut duvarı kesti. Kemik makası kullanarak, ve omurga ile diyafram kaburga çizgi izleyen tüm göğüs kafesine çepeçevre kesilir ekleme, ve eşik üstü başlangıç. Diyafram kolayca çıkarılabilir, böylece diyaframın merkezine doğru akan kan damarları kesin. </li><li> Fare diyafram ve oksijenli Ringers dolu bir diseksiyon çanak yer çıkarın. Yavaşça diap ajitasyonkanı yıkamak için çanak hragm. Gerektiğinde Yenile çözümü Ringers. </li><li> Hemidiaphragms yanal bir merkez kısmı içinde liflerin yönelim boyunca merkezi tendondan kaburga diyafram ince bir şerit kes. Şerit geniş 2-4 mm arasında olmalıdır. Kemik makas kullanılarak, diyafram şerit her iki tarafında kaburga, yaklaşık 1-2 mm çıkıntı bırakarak, şerit her iki tarafında kaburga kesti. </li><li> Merkezi tendon sütürleri bağla. Yanal olarak çıkıntılı kaburga uçlarının her bir dikiş için bağla ve daha sonra bir büyük döngü yapmak için birlikte bu bağlar. </li><li> İki şerit herhangi bir diyafram (her iki tarafta birer) dan elde edilebilir. </li></ol> 3. Mekanik Bath Montaj Kaslar <ol><li> Sütürler kavrayın ve bir ucunda bir rijit yazılan kas eklemek için kullanabilirsiniz ve diğer ucunda bir kuvvet dönüştürücü için. </li><li> Kas gevşek değil, gergin olmadığından emin olmak için uzunluğunu ayarlayın. İyi bir yaklaşıklık dinlenme musc olduğunu1.4 gibi le uzunluğu - 1.5. </li><li> Banyo ° C testi için kas kararlılık uzatmak için 22 tutulur oksijenli Ringers çözeltisi ile doldurulur. O kas sıcaklığı 22 ° C&#39;ye dengelenmiş yani Kaslar önceki fonksiyonel test için bu banyosunda 5 dakika dinlenmek gerekir </li></ol> 4. İzometrik Kasılmaları <ol><li> Supramaksimal Uyarım Koşullar oluşturulması. Bir kas banyosuna yerleştirilir sonra, bir seğirme oluşturmak için tek 0,5 msn stimülasyon darbeleri kullanın ve kuvvet çıktı izlemek. Kuvveti maksimum ama istikrarlı attains kadar yavaş yavaş akımı artar. Kalan deneyler için bu seviyenin% 10 daha fazla akım artırın. </li><li> Optimum Uzunluk Kurmak. Maksimal kuvvet elde edilinceye kadar izometrik kasılan uyaranları kullanarak, yavaş yavaş kas uzunluğunu ayarlayın. Her kasılma arasındaki kas ~ 10 sn dinlendirin. Seyirme kuvvet maksimum olduğunda en iyi kas uzunluğu (L o) elde edilir. Rekor kas boyu (uzunluğuaranın myotendinous EDL için kavşaklar ve merkezi tendon myotendinous kavşak ve Vernier kaliper yardımıyla kaburga kas ekleme) arasında. </li><li> Maksimum İzometrik Tetanik Kuvvetleri. Supramaksimal stimulasyon 0.5 msn darbe bir dizi ve füzyon frekansı (frekans-kuvvet ilişkisi (örneğin Ref platosundan azından 500 milisaniye süreyle L o ayarlanmış kas Canlandıracak:. 8) EDL kasları için yayla genellikle 120 Hz ve 100 Hz ile diyafram kasları için elde. her kas için stimülasyon nöbetleri arasında 5 dk dinlenme süreleri ile ilgili frekansta, 3 kez teşvik. </li></ol> 5. Eksantrik Kasılmaları <ol><li> Kas izometrik ve eksantrik kasılmalar performans aras 5 dakika dinlenmeye bırakın. </li><li> Nihai 200 msn uyarım içinde bir% 10 L O stretch (0.5 L o bir esneme oran ardından ilk 500 milisaniye için, izometrik olarak 80 Hz kaslarını/ Sn). </li><li> Eksantrik kasılmalar istenilen sayıda arasında 5 dakikalık molalar ile stimülasyon desen tekrarlayın. </li><li> Streç öncesinde süre her kasılma için kuvveti ölçün. Ilk ve son kontraksiyon arasında yürürlükte damla hesaplayın. </li></ol> 6. Aparat gelen kas Kaldırma <ol><li> Transdüser kas sökmek için izin ve nakletmek ve Ringers bir diseksiyon çanak geri döndürmek için kas uzunluğu kısaltın. </li><li> Kaslardan sütürler çıkarın. </li><li> EDL kasının için, daha sonra (örneğin donma, sabitleme, vb) daha sonraki işleme önce, tartmak, iki kas bekletin. Bu enine kesit alanı, ve spesifik kuvvet hesaplanması için önemli olacaktır. </li><li> Diyafram kası için,% 0,1 procion turuncu, 15-20 dk bir membran geçirgenliği olmayan boya bekletilebilir. Bu diseksiyon hasarın bir göstergesi sağlayacaktır. </li><li> Uzakta kemik yerleştirilmesine bağlı kas teşrih yanı sıra, yüzderal tendon. Bu, kas doğru bir ağırlık sağlamak için gereklidir. Tartım ve sonraki hazırlanmasından önce yukarıda kurutun. </li><li> Kesitsel Alan (CSA) Çapraz hesaplayın: CSA (mm 2) = kütle (mg) / [(ğ mm) * (L / L o) * (1.06 mg / mm 3)], L / L o elyaf burada kas uzunluk oranı (EDS için 0.45, diyafram için 1.0), 5 ve 1.06 kas yoğunluğudur. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function.">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li><li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice.">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old.">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle.">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle.">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li><li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Aurora Scientific tarafından desteklenmektedir.

EDL ve diyafram - Bu makalenin amacı farelerin iki kasları izole kas fonksiyonu gerçekleştirmek için rehberlik sağlamaktır. Bu kasların değerlendirilmesi kas hastalığı için tedavi adaylar yararlı olup olmadığı konusunda bir fikir verebilir. Her iki kas için sağlam veri elde en önemli faktör temiz bir diseksiyon olduğunu. Bu nedenle, uygulama ve ilk izolasyon adım mükemmelleştirmek fonksiyonel test geçmeden önce esastır. Buna ek olarak, normal kas için işlevsel ölçütler oluşturma öncesinde distrofik kas ile karşılaştırma yapma, ya da tedaviler arasındaki kritik önem taşımaktadır. Bu çalışmanın sonuçları deney yapan kişinin yeteneği kazandırdığı yüksek değişkenlik tabi olmadıklarını temin edecektir. Bir Membran geçirgenliği olmayan boya kullanımı böyle bir boya en hasarlı lifleri işaretler içeren bir solüsyona herhangi bir kas kuluçka, diseksiyon hazırlık optimize yardımcı olabilir, ve d bir göstergesi olarak hizmet verebilirissection başarı. Kas hasar liflerinin sayısını en aza indirmek ölçüm optimize etmeye yardımcı olacaktır. Disseksiyon zarar lifler eksentrik sonucu tahrip olan çok daha parlak flüorışı, ve aynı zamanda boya mekanik işlemi sırasında kullanılır ise, yani bir hasar iki tür arasında ayırt etmek için boya yoğunluğunu kullanılabilir. Diyafram şeritlerin Diseksiyon hemen hemen her zaman liflerin uzunluğu boyunca kesme, kaçınılmaz olarak bir imha, çünkü fiber zarar sahip olacaktır. Boya alımı bu hasarlı lifleri güçlü olduğunu ve bu normal hazırlık dış kenarları ile sınırlıdır. Ortalama olarak, kas şeridinin her iki yanında da genişlik ~ 3 fiberler (~ 120 um) olan bozuk bir lif bandı görüyoruz. Hasarlı bandı kas% 15&#39;den fazla oluşuyorsa, o zaman veri atılır. Diyafram hazırlığı da işlevsel önlemler için optimum boyut kısıtlamaları vardır. Bulduk ki d parçalarınımerkezi tendon kravat tek bir noktadan olduğu için 5 mm daha geniştir iaphragm, kendilerini katlayın başlar. Bu sonuç olarak hazırlanmasında bir spesifik kuvvet azalmıştır. Ayrıca, disseksiyon sırasında zarar liflerin sayısının toplam lif sayısının daha büyük bir kısmını oluşturan çünkü dar şeritlere ayrıca olduğuna inanıyoruz düşük bir spesifik kuvvet, sahip olduğunu bulduk. Örneğin, her iki tarafta 0.1 mm bozuksa, o, zorla katkıda bulunmaz kas hazırlık% 5 (2x0.1 mm / 4 mm şerit) iken şerit sonra sadece 1 mm, 20 ise kas hazırlık% hasarlı. Böylece, hasarlı bölgenin genişliğini hem de tüm hazırlık enine hem de kontrol etmek için önemli bir faktördür. Maksimum izometrik gerilim ölçümleri kas tüm kas lifleri uyarılır gerektirir. Bir işlev aygıtın bileşenlerinin büyük farklılıklar olmadığı için, bu tek tek her bir grubu için tespit edilmelidirkadar. Örneğin, boyut veya banyo stimülatörü kullanılarak tip uyarma yoğunluğunu etkileyebilir. Twitch stimülasyon supramaksimal uyarım koşulları belirlemek için makul bir yoludur. Bu, belirli bir kurulum ve kas için kurulmuş sonra, daha sonraki çalışmalar için kullanılabilir. Buna karşın, verilen herhangi bir kas optimum uzunluğu yukarıda tarif edilen iteratif işlem kullanılarak her bir hazırlık için ölçülen gerekmektedir. Bu, kalın ve ince filament örtüşme optimum ve maksimum potansiyel kuvvet oluşturma kapasitesi ölçülür sağlar. Alternatif prosedürler kas çizikleri ile ilişkili kırınım desenleri güvenebilirsiniz, ama bu burada açıklanmayan ek donanım gerektirir. Biz rutin bu alanda diğer araştırmacılar tarafından kullanılan bu parametre orta menzilli düşüyor 500 msn stimülasyon süreler kullanın. Bu kasılma sırasında kas bazı yorgunluğa sebep olabilir, ancak bu açıktırmaksimal kuvvet üretimi bir &quot;sarkma&quot; tarafından, kendi içinde bu bilgilendirici olabilir. Örneğin, yorgunluk bir fark dolayısıyla aktif kasılma sırasında yürürlükte sarkma iyileştirme için bir dizin olarak hizmet edebilir, bu hedef kalsiyum taşıma dahil tedavileri farklı tipleri ile elde edilebilir. Alternatif olarak, güç kaybı tendonları üzerinde dikişler yeterince sıkı olmadığını göstermektedir, ve onlar kasılması sırasında kayma olduğunu olabilir. Kas banyo kaldırılmış olması ve bu oluşursa dikişlerle yeniden bağlanmalıdır. Ayrıca preparat kararlılık değerlendirmesine olanak sağlar 3 tetanik kasılmalar, bir dizi kullanım. Yine, dikiş fişleri yeniden bağlama sütür gerektiren, kasılmalar arasında güç kaybına yol açacak. Büyük kaslar da protokol esnasında güç kayıplarına yol açan, anoksik çekirdek oluşturabilir. Kas boyutu izole kas fonksiyon testleri gerçekleştirmek için sınırlayıcı faktör, nerede 20 mg&#39;ın kitleler ile EDL kasları her kontraktürü ile yürürlüğe kaybetmekğinde ve banyo superfusion tarafından desteklenen edilemez. Onlar banyoda uzun süre sürdürebilmesi için yeterince ince olduğu için Diyafram şeritler aynı komplikasyonlar olmaz. Diğer kasları yaygın olarak kullanılan soleus dahil izole kas fonksiyonu için kullanılan, ancak burada açıklanan değildir olabilir. Aynı prosedürlerin çoğu hazırlanması ve fonksiyonel test açısından soleus için kabul edilebilir. Ancak, ana farklar stimülasyon frekansı vardır ve eksantrik kasılmalar için parametreleri. Fonksiyonu için soleus kullanımı diğer iki kas tamamlar, ve bu yüzden, distrofik fareler 7 4 değerlendirmek için bir &quot;standart paket&quot; bir parçası olarak kabul edilmelidir. Eksantrik kasılma kasılma kırılganlığının bir göstergesi sağlar ve bir protokol kullanmak için önemli olduğunu yabani-tip hayvanların kaslarında kuvvet mütevazı kaybı ve kuvvet önemli bir kaybına nedenTedavi edilmeyen distrofik kas karşılaştırmalar için geniş bir dinamik aralık kalmayacak şekilde. Normal kaslarda herhangi bir kuvvet kaybı eksikliği eksentrik çok hafif olduğunu göstermektedir, ve etkin olmayan tedaviler ve gerçekten yararlı olduğunu ayırt etmek yeterli olmayacaktır. Ancak, eksentrik tabi normal bir kas kuvvet dramatik kaybı hastalığı ile ilişkili farklılıkların didiklemek için çok büyük olabilir. EDL ve diyafram Bizim protokol 10% uzunluğu değişimi üretmek için 0.5 Lo / sn streç hızını kullanır. Biz genellikle 5 eksantrik kasılmalar, normal kas kuvvet küçük bir kaybı ve distrofik kas kuvveti önemli bir kaybına neden gerçekleştirmek. Elbette, bu parametrelerin her hastalıklı ve sağlıklı kas arasındaki farklar, aynı zamanda mutasyon belirli bir tip üzerine etkisi ile ayırt etmek için toplam uzunluk değişimi, germe oranı, ya da eksantrik kasılmaları sayısını artırmak için değiştirilebilir ya da treatment birini okuyor. Sürece normal ve hastalıklı kasları arasında belirgin bir fark olduğu, daha sonra tedavileri açısından ulaşmak için bir altın standart yoktur. Özetle, bu protokol izometrik ve eksantrik kasılmalar gerçekleştirmek için yönergeler kurar, ve umarım sizin laboratuarında bu tekniği kurarken önlemek için potansiyel tuzaklar tanımlar.

Kas fonksiyonunun measurements kas patoloji yanı sıra, bu dokuda fizyolojik altında yatan mekanizmaların tayin etmek için potansiyel tedavi değerlendirme katkıda bulunur. Kas hastalığı için, fare modellerinin kullanımı ve potansiyel tedavi tasarım ve test içine bu bilgiyi genişletmek için genotip ve fenotip arasındaki bağlantıları anlamak için merkezi bir bileşeni haline gelmiştir. Müsküler distrofi, özellikle de, bu maddeler değerlendirmek ve hastalardaki denemeler için ileriye doğru hareket ettirmek için gerekli ön-klinik veri bağlantısı kurmak için fareler yararlanmıştır. Bir sık ​​sonuç ölçüsü çalışmalar çeşitli uygulanabilir güç belirlemek için izole kas fonksiyonunu kullanır. Başka bir önlem eksantrik veya uzatma kullanımı, kasılmalar Duchenne müsküler distrofi eksiktir kas zarı bütünlüğü değişiklikler, ve bu hastalık (mdx) için fare modelini belirlemek için. Bu nedenle, bu tür measurem için gereklidirveliler hassas ve tekrarlanabilir. Fare ekstansör digitorum longus (EDL) kas üniform elyaf oryantasyonu ve kati tendonlar 2, 5, 6, 10, 12 gibi ideal geometrisi ve boyutu nedeniyle izole kas fonksiyonu için yaygın olarak kullanılır olmuştur. EDS, kaslar izometrik fonksiyonel ölçümleri için yöntemler Treat-NMD SOP 1 içinde bir önceki Jüpiter yayın 8, yanı sıra içinde tarif edilmiştir. Biz izometrik ve eksantrik kasılmalar hem dahil etmek için bu yöntemlerin tanımı genişletmiştir. Hastalığın karakteristik dejenerasyonu / rejenerasyon ve azalmış güç çıkışı heighted döngüleri de dahil olmak üzere, EDL belirgindir. Fare diyafram fare 11 diğer kaslara oranla müsküler distrofi en hızlı patolojik ilerlemesi sergiler. 6 aylıktan göre, kümülatif fibrozis kas yaklaşık% 50 oluşturmaktadır. Önemli ölçüde bozuyor Bu sonuçd kuvvet çıkışı 11. Bu nedenle, fibrotik gitmesini engellemek için terapötik maddeler olarak etkili bir diyafram değerlendirilebilir. Kas distrofin kaybı tüm kasları 9 arttı kırılganlık ve artan kasılma hasara yol açar. Duchenne müsküler distrofi Bu nedenle birçok tedaviler distrofin değiştirme içindir. Gibi, bu stratejileri değerlendirmek için gerekli hale geldi bir deneyde de kasılma hasarı 2, 3, 4 bir distrofik kas korumak için belirli bir strateji olmuştur yarar ne olduğunu belirlemek gibi, normal ve distrofik kas ayırabileceğini eksentrik, bir 12. Bu işlem / kayıt uzunluğu ve kuvvet veya kuvvet dönüştürücü itibaren hızla ayrı boy ayarlama yöntemi modüle olabilir ya bir çift modlu servo motor gerektirir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> in vitro kas Test Sistemi içinde </td><td> Aurora Bilimsel </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Diseksiyon </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE ışık kaynağı </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Açılı kesme makası </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi sapı </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10003-12 </td><td> alternatif kesme aleti </td></tr><tr><td> Kavisli neşter bıçakları # 12 </td><td> Güzel BilimAraçlar </td><td> 10012-00 </td><td> alternatif kesme aleti </td></tr><tr><td> Kemik makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T, sütür bağlama forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS forseps - açılı </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Örgülü ipek sütür büyüklüğü 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tıbbi bandı </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin hidroklorid 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Final Doz 80 mg / kg &#39;dır </td></tr><tr><td> TranquiVed Enjeksiyon (ksilizin 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Final Doz 10 mg / kg &#39;dır </td></tr><tr><td> Reaktif turuncu 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Çözüm Bileşenleri Ringers </td><td></td><td></td><td> Çözelti% 95 O2 ve% 5 CO2, nihai pH 7.4 ile dengelenmiş bir gazdır </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Final Konsantrasyon: 118 mM </td></tr><tr><td> Potasyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Final Konsantrasyon: 4.7 mM </td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür dihidrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Nihai konsantrasyon: 2.5 mM </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat tekbazlı </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Nihai konsantrasyon: 1.2 mM </td></tr><tr><td> Magnezyum sülfat </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Final Konsantrasyon: 0.57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-Hidroksietil) borurazine-1-etansülfonik asit (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Nihai konsantrasyon: 5.95 g / l </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Nihai konsantrasyon: 5.5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Kas hastalığı için potansiyel tedavilerin değerlendirilmesi Kritik kas fonksiyonlarının hassas ve tekrarlanabilir fizyolojik değerlendirmeler vardır. Birçok klinik öncesi çalışmalarda bu hastalıklar için fare modelleri dayandıklarından izole kas fonksiyonu hastaların içine doğru ilaç adayları hareketli Go / NoGo kararları için standartlardan biri haline gelmiştir. Biz bu çalışmalar için kullanılan baskın kasların fonksiyonel test için ekstansör digitorum longus (EDL) ve diyafram kaslarının hazırlanması gösterecektir. EDL kasının geometrisi iki kolayca erişilebilir tendonlar ve bir banyo superfusion tarafından desteklenen küçük bir boyutu olan, izole kas hazırlıkları için idealdir. Diyafram distrofik hayvanlarda derin ilerleyen patolojiyi sergiler ve fibrozis karşı birçok potansiyel tedaviler değerlendirmek ve myofiber istikrarı teşvik etmek için bir platform olarak hizmet verebilir. Izometrik ve eccen gibi rutin testler için Protokoller,mide kasılmaları, görünecek. İzometrik kuvvet gücü değerlendirmesini sunar ve eksantrik kasılmalar kas distrofiler birçok çeşit bozulur sarcolemma istikrar değerlendirmek için yardımcı olur. Yabani-tip ve distrofik kasların kaslar arasındaki beklenen sonuçların karşılaştırılması da sağlanacaktır. Bu önlemler, doku homeostazında ve morfolojik ve biyokimyasal ölçümler, hem de kas fonksiyonunun tüm hayvan değerlendirmeler tamamlayıcı olabilir.

12 haftalık hayvandan kaslarının EDS izometrik kuvvetleri için beklenen değerleri Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Mdx kasları kompansatuar hipertrofi sergilemek olduğundan, toplam tetanik kuvvet yaş uyumlu yabani-tip kontrollere göre mdx kas daha yüksek olabilir. Bununla birlikte, fonksiyonel üretiminin daha uygun bir ölçü kuvvet bu değer hesaplamak için enine kesit alanı için normalleştirilmiş bir spesifik kuvvet (Şekil 2) &#39;dir. Spesifik kuvvet mutlak güç ve kesit alanı hem muhasebeleştirilmesi sırasında distrofik kas zayıflığı daha belirgindir kas doğasında fonksiyonel kapasite, bağlıdır. Bizim ellerde, mdx fareler EDL kasları yaklaşık 20 üretir - yaşı 26 hafta - 10 yabani-tip farelerden yaştaki oranla% 25 daha düşük özel kuvvetler. Hazırlık disse bağlı kas bir parça olduğundan, diyafram için, sadece bir spesifik kuvvet karşılaştırmaları için uygundurction. Yabani-tip ve mdx diyafram kasları arasındaki spesifik kuvvet Karşılaştırılması bu dokuda ilerleyen patolojiyi yansıtır. İzometrik kuvvet çıkış yaşı 6 ay, mdx fareler diyafram kasları daha fazla yaş uyumlu yabani-tip denetimler diyafram şeritler fonksiyonel çıkış yarısından üretmek, böylece yaş (Şekil 3) azalır. Diyafram testlerinden eksantrik kasılmalar bir örneği Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. Sonraki her eksentrik ile kuvvet çıkışı yabani-tip (C57) ve mdx farelerde hem diyafram şeritler azalır. Bununla birlikte, güç kaybı distrofinin ve ilişkili proteinlerin yokluğunda dan muhtemelen, MDX fare kas örneklerde daha dramatik. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Şekil 1. Yabani-tip ve mdx EDL kasları f izometrik tetanik kuvvet<html> rom 12 haftalık fareler. Mutlak güç kompansatuar hipertrofisine bağlı yaştaki mdx EDL kaslarında yüksek olabilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Kas kesit alanı ile normalize Şekil 2. İzometrik tetanik kuvvet Özgül Kuvvet ve yabani-tip farelerden kıyasla mdx fareler EDL kaslarının depresyona fonksiyonel kapasitesini ortaya koymaktadır. İzler Şekil 1 &#39;de olduğu gibi aynı fareler elde edilmiştir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Şekil 3,. Spesifik kuvvet ile değerlendirilmiştir güç üretim kapasitesinin sürekli bir şekilde azalması (mavi çizgi olarak C57) yabani-tip ile karşılaştırıldığında, MDX fareler (kırmızı bar) diyafram en belirgindir. 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. 12. Eski hafta C57 ve mdx fareler diyafram kasları için eksentrik sayısının bir fonksiyonu olarak güç kaybı. Veriler, ortalama ± olan genotip başına N SEM = 4 kasları.

Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Kas fonksiyonunun measurements kas patoloji için potansiyel terapötik değerlendirilmesi yanı sıra, bu dokuda fizyolojik altında yatan mekanizmaların belirlenmesi için katkıda bulunur. Biz fonksiyonel testleri için ekstansör digitorum longus ve diyafram kaslarının hazırlanması gösterecektir. Izometrik ve eksantrik kasılmalar için Protokoller patolojik bir devleti temsil eden distrofik kaslar arasındaki sonuçlar farklılıklar, ve yabani-tip kaslar yanı sıra görünecek.

İskelet Kası İzometrik ve Eksantrik Kuvvet Oluşturma Değerlendirme İzole Müsküler Distrofisi arasında murin Models

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

32.5K Görüntüleme.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. Kas fonksiyonunun measurements kas patoloji için potansiyel terapötik değerlendirilmesi yanı sıra, bu dokuda fizyolojik altında yatan mekanizmaların belirlenmesi için katkıda bulunur. Biz fonksiyonel testleri için ekstansör digitorum longus ve diyafram kaslarının hazırlanması gösterecektir. Izometrik ve eksantrik kasılmalar için Protokoller patolojik bir devleti temsil eden distrofik kaslar arasındaki sonuçlar farklılıklar, ve yabani-tip kaslar yanı...

Video: Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Biyoloji

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Ex vivo</emVasküler Reaktivite incelenmesi için> İzole İskelet mikrodamar Hazırlık

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...