Yazarlar canlı hücre görüntüleme yaptığı giriş için teknik yardım ve Michael Rieger için Bofan Wu ve Hıristiyan Raithel teşekkür etmek istiyorum. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH tarafından desteklenir. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Savunma Bakanlığı W81XWH-11-1-0074 (REN), Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (R31-10069) tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla WCU (World Class Üniversitesi) programı (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Kemirgen Bariyer Tesisi Ekipman) ve NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi ve Görüntüleme ve Hayvansal Paylaşılan Kaynakları).

<html> 1. Genel Şeması <ol><li> Genetiği ve meme bezlerinden preneoplastic meme epitel hücrelerinin primer kültürlerinde üretmek ve wild-tip farelerden kontrol. </li><li> Canlı hücre görüntüleri 5 gün için Volocity görüntü alma yazılımı (sürüm 5.3.1, Perkin Elmer, Waltham, MA) kullanılarak her 15 min. </li><li> Zamanlama ve epitel hücre koloni oluşum mekanizması, apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı değerlendirmek için doğrudan zaman atlamalı görüntüleri görüntüle. </li><li> Için oluşturulan Volocity. TIFF yığınlarının dönüştürün. MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) ve rename dijital görüntü dosyaları (Rename 2.1.6 kullanarak JPG dosyaları <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Sistem / Dosya Yönetimi /-Rename.shtml</a> ) Timm en Takip Aracı yazılımı (TTT, uyum sağlamak için,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> TTT kullanarak, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi desenleri (simetrik karşı asimetrik) arasındaki süresinin belirlenmesinde hücre kaderinin haritaları oluşturmak. </li><li> Farklı genetik fare modelleri ve / veya vahşi tip kontroller arasında anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için adım 3 ve üzeri 5 kantitatif verileri analiz. </li></ol> 2. Primer Meme Epitel Hücre Kültürleri Nesil <ol><li> Üreticinin talimatlarına (EpiCult-B Fare Orta Takımı, Stemcell Technologies, Vancouver, BC) bir varyasyon takiben tek meme epitel hücrelerinin izolasyonu için Komple Media hazırlayın. 450 ml Epi-Cult-B ortam, 50 ml Epi-Cult B proliferasyon takviyesi,% 5 fetal sığır serumu (FBS), 50 ug / ml penisilin / streptomisin (PenStr Kombineep) ve 10 ng / ml &#39;Epidermal Büyüme Faktörü (EGF). </li><li> 2.1 9 parça Komple Media ile 10x kollajenaz / Hyaluronidaz karışımı, 1 kısım birleştirerek Ayrılma Medya hazırlayın. </li><li> Fare Euthanize ve hemen otopsiye geçin. Sıra bir styrofoam otopsi platformda sırtında fare ve ventral deri gergin olduğunu bu yüzden tüm dört bacağı sabitleyin. O% 70 etanol ile, bacaklarda örten dahil ventral deri ve saç, doyurabilecek. Medial her ön ekstremite cilt ve yoluyla bir Y-kesi içine uzatılır deri yoluyla ortadan ensizyon (periton girmeyin) yaparak # 2/3 (göğüs) ve # 4/5 (inguinal) meme bezlerinin Açığa her iki arka ekstremite medial deri yoluyla Y insizyonu baş aşağı bir. </li><li> Künt diseksiyon kullanarak underlyingperitoneum cilt ayırmak, bu gergin kadar cildin her iki tarafına geri çekin ve işaretçilerine kullanarak strafor otopsi platforma sabitleyin. Dış taraftan başlayarak, disse akılcı kullanımı ile künt diseksiyon kullanabilirsinizction makas sağlam kasık ve / veya altta yatan bağ dokusu ve kas torasik meme bezleri izole etmek. 10 cm steril Petri kabındaki ikiden fazla meme bezlerinin yerleştirin ve doku kültürü kaputu taşımak. </li><li> Doku kültürü kaputu içinde, sarımsı bir renk ile küçük, iyi sınırlı nodüller olarak tanımlanan meme lenf düğümleri için bezleri inceleyin. Steril neşter ve forseps kullanarak çevredeki bezinden lenf düğümleri kaldırın. İki steril neşter, her biri bir el kullanarak ~ 1 mm 3 küpler halinde meme dokusu Kıyma. </li><li> Sıra yavaşça 10 ml pipet kullanarak 2-3 kez aşağı yukarı pipetleme ve tarafından 5 ml Ayrışma Medya, mix meme dokusu kıyılmış ve% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör (en fazla ~ 16 saat) bir gece inkübe gevşeyen kapaklı 50 ml konik tüp. </li><li> Ertesi sabah, kırmızı bl teşvik etmek için amonyum klorür çözeltisi tamponlanmış% 2 FBS ve 4 kısım ihtiva eden 1 kısım Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) bir soğuk karışım hazırlamakood hücre lizisi (HFAmCl) yanı sıra, soğuk HBSS% 2 FBS (HF) ile desteklenmiştir. Ön sıcak Tripsin-EDTA (% 0.25), Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 5 mg / ml dispase, 1 mg / ml DNase I, ve Komple Media modifiye edilmiştir. </li><li> Inkübatör meme dokusu ile konik santrifüj tüpü çıkarın ve yavaşça girdap 2-3 sn iki kez darbe. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) için 450 x g&#39;de santrifüjleyin tüp, ve süpernatan atılır. </li><li> 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) için 450 x g hızında 10 ml HFAmCl ve santrifüj içinde en az bir pelet yeniden süspanse edin ve süpernatan atılır. </li><li> Pelet 3 ml tripsin-EDTA ekleyin ve 5 ml&#39;lik pipet ile ilk karıştırın ve daha sonra tel (1-3 dk) kadar P1000 mikropipet ile. 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) 450 10 ml HF, santrifüj × g ekleyin ve supernatant atın. </li><li> 5 mg / ml dispase 2 ml ve 1 mg / ml DNase I pelet ve 1 dakika süreyle bir P1000 mikropipet ile karıştırmak için 200 ul ekle. Örnek clo olmalıdırudy ama kılçıklı değil. Lifli ise, DNaz I 100 ul ekleyin ve tekrar karıştırın. </li><li> 5 dk (oda sıcaklığında ya da 4 ° C) 10 ml soğuk HF, 450 bir 40 mikron hücre süzgecinden ve santrifüj yoluyla gerginlik × g ekleyin ve supernatant atın. </li><li> Komple Media nihai pelletini tekrar. Hücrelerin toplam sayısı (hemasitometre veya Coulter Sayacı kullanılarak) ölçmek. İki meme bezlerinin yaklaşık 1 x 10 6 1 x 10 7 hücre verim. Kuyu başına 1,5 x 10 5 hücre yoğunluğunda bir düz dipli 6 plaka Plak primer epitelyal hücreler. </li></ol> 3. Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> Hemen hücreleri kaplama sonra, 2 / humidity/37 doymuş ° C sıcaklıkta inkübasyon odası% 5 CO içinde bir mikroskop sahne üzerine güvenli bir şekilde 6-plaka yerleştirin. Kohler aydınlatması ve merkezi faz halkaları için kondenser ayarlayın. Burada sunulan deneyler için, ters çevrilmiş bir Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Disk konfokal İplik10x objektif lens ile Widefield faz kontrast modunda mikroskop sistemi kullanılmıştır. </li><li> Açık görüntü toplama yazılımı, oluşturmak ve zaman atlamalı görüntüler için bir kütüphane isim ve büyük dosyalar için yeterli alana sahip bir yere kaydedin. Deneyleri burada kullanılan Volocity görüntü alma yazılımı (sürüm 5.3.1, Perkin Elmer, Waltham, MA) sundu. </li><li> Plaka 15 dk en az mikroskop inkübatör dengelemek için izin verin. Aşamasında objektif bir girişimi engellemek için lensler indirin. &quot;Sahne&quot; başlığı altında, &quot;Aşama kalibre edin.&quot; Seçeneğini Odak düzlemi, set Z başlığı &quot;Sahne&quot; altında &quot;Add noktası&quot; seçerek x, y, z sekmesi ve işareti görüntüleme puan altında = sıfır. Reacquire Faz kontrast görüntüleme gibi görüntüleme için 6-plaka Her kuyunun ortasına yerleştirin puan plastik kuyuların çevre yakın bozulabilir. 4 x 4 alan (650 mikron x 700 mikron alanları), küçük bir örtüşme (yaklaşık% 5) her bir kare noktaları düzenleyin. &quot;Stag altında seçilen noktalarını kaydedine &quot;. </li><li> &quot;Sahne&quot; altında seçin &quot;odak harita olun&quot; ve her noktasındaki odağı ayarlamak için yönergeleri izleyin. Saatte 4 fotoğraf (her 15 dakikada) yakalamak için görüntü toplama zamanlaması ayarlayın. Bu özel deney gereksinimlerine bağlı olarak ayarlanabilir. &quot;Sahne&quot; altında odak haritayı kaydedin. </li><li> Sağ sağ tarafında araç çubuğu &quot;Image Acquisition&quot; üzerine tıklayın ve görüntüleme ayarları kaydedin. Görüntüleme başlamak için kayıt düğmesine basın. 1 saat sonra, herhangi bir ayarlama gerekip gerekmediğini görmek için görüntülerin odağı kontrol. </li><li> Monitör ve hücreler konfluent olunca biten, 5 gün boyunca canlı görüntüleme devam eder. </li></ol> 4. Zamanlama Başlangıç ​​ve Epitel Hücre Colony Oluşum Mekanizması, Apoptozis insidansı ve Morfolojik Değişikliklerin Aşamalandırma Değerlendirememesi Time-lapse Görüntüler Doğrudan İzlenimi <ol><li> Zaman atlamalı görüntüleri Doğrudan görüntüleme uyumlu herhangi bir video izleme yazılımı (örneğin kullanılarak performans alınabilir <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer veya diğer ücretsiz ya da ticari olarak temin yazılımı). Görüntüler bu aşamada ya. JPG dosyaları (Adım 5) dönüşüm sonra. TIFF formatında izlenebilir. </li><li> İlk koloni oluşum mekanizmasını belirlemek için, plaka üzerinde bir görüntüleme alanını temsil eden tek bir görüntü yığını ile başlar. İlk çerçeve, hücreler yüzen olacaktır. Birinci epitel hücre plaka yapışır belirlemek için seri görüntü izleyin. Bu aşamada, epitel hücreleri tespit edilebilir ve bunların daha cuboidal morfolojisi ile fibroblastlar ayırt. Seri görüntüler aracılığıyla bu tek katlı epitel hücre izleyin ve sonraki 24 saat boyunca kendi kaderine izleyin. Bu ek epitel hücreleri tarafından çevrili olur veya hücre bölünmesi veya apoptoz görmesi durumunda kaydedin. Epitel hücreleri ile çevrili ise çevreleyen hücreleri daha sonra, ilk yapışık hücre (ler) i ya da toplayabilir yüzen hücrelerde elde edilir ise, koloni oluşumu mekanizmasını görüntüleyerek direkt olarak tespit edilebilirİlk yapışık hücre bölünmesi gelen. İlk 24 saat boyunca hücre agregasyonu karşı hücre bölünmesi ile oluşturulan kolonilerin sayısını kaydedin. </li><li> Belirli bir süre içinde apoptoza başlangıçta yapışık hücre sayısını belirlemek için, yapışık olan bir hücrede gelişen apoptozisin klasik özelliklerin görülmesi için seri görüntüleri izleyin ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ) ve görüntüleme tüm süresi boyunca ya da belirli süreler dahilinde belirlenen apoptotik hücre sayısı kaydedildi. </li><li> Zamanla, kültür epitel hücreleri EMT ile tutarlı daha ince uzun bir görünüm için bir ilk kübik şekle morfoloji değiştirebilir. Bu oluştuğunda Kaplama sonrası gün / saat belirlemek için seri görüntüleri izleyin. </li></ol> 5. Görüntü Dosyası Modifikasyon <ol><li&gt; Volocity yazılım sayesinde, TIFF yığınları görüntü dosyalarını ihraç. İşte MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) TIFF yığın dosyalarını açmak için kullanılan ve daha sonra tek. JPG görüntüleri olarak MetaMorph kaydedilen. </li><li> Timm en Takip Aracı yazılım gereksinimlerine göre görüntü klasörleri ve dosyaları yeniden adlandırın Rename 2.1.6 (gibi ücretsiz bir program kullanın <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> gruplar halinde dosyaları yeniden adlandırmak için). Deneyin tüm klasörleri ve dosyaları içeren bir klasör oluşturun ve (örneğin, klasör adını </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Kültür görüntülendi her noktası / pozisyon için bir alt klasör oluşturun. Alt Ad: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Pozisyon numarası 3 haneli olmalıdır. Örnek: 072511RN_p001. Alt bireysel konumunun tüm görüntü dosyalarını koyun. </li><li> Timepoint (5 basamak kullanarak) ve bu biçimde her dosya adının sonunda kanal numarasını (tek bir parlak alan kanal olmadığı için, &quot;0&quot; kullanın) ekleyin: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> İlk TTT web sitesinden ücretsiz program TTTlogfileconverter indirerek her pozisyon için bir günlük dosyası oluşturur. TTTlogfileconverter programını başlatın ve deney klasörü seçin. Girdi bir görüntü aralığını (saniye olarak). Her 15 dakikada çekilen bir resmi için 900 sn girin. Sonra yeşil örtülü log dosyaları düğmesine basın. </li></ol> 6. TTT Kullanarak Tek Hücre Hücre Kader Harita Üretimi <ol><li> CTTTexport adında bir klasör REATE ve tüm hücre izleme verileri TTT yazılım talimatları izleyerek saklanacağı bir alt TTTfiles denir </li><li> TTT programını başlatın, kullanıcı harfleri seçin ve tıklayın &quot;Devam.&quot; </li><li> Basın &quot;Set NAS,&quot; &quot;TTTexport&quot; klasörü oluşturulur kullanıcıyı seçin ve Tamam &#39;ı tıklatın. Tarayıcıda tuşuna basın &quot;Load konumu&quot; düğmesi, bir deney klasörü seçin bir pozisyon klasörü seçin ve. </li><li> Için oküler faktörü belirle &quot;10x.&quot; Gerekli görüntü sayısını yükleyin (tüm görüntüleri yükleme ilk kez tavsiye edilir). </li><li> Hücre editörü penceresinde, Dosya menüsü altındaki &quot;Yeni koloni&quot; seçeneğini seçin. Film penceresinde, bir hücre izlemeye başlamak için &quot;Parça hücre&quot; veya F2 tuşuna basın. </li><li> M bir hücrenin belirlenmesiOvie penceresi ve hücre üzerine imleci yerleştirmek için kullanmak fare. F2 tıklandığında sonra hücre sayısı ile bir daire görünür. Sonraki resme hücre ve avans yerleşim izlemek için Klavyenin numara pad üzerinde &quot;0&quot; tuşunu kullanın. Her çerçeve ile her hücrenin yerleştirme takip götür. Bir parçayı silmek ve sayı pad üzerinde önceki görüntü basın &quot;Del&quot; geri dönmek için. &quot;, 3&quot; hücre basın izleme olmadan ileriye kareleri hareket etmek ve numara pad basın &quot;1&quot; izleme olmadan geri gitmek için. </li><li> Bir hücre bölünmesi Film penceresinde &quot;Bölüm&quot; butonuna tıklayın işaretlemek için. Hücre ölümü münasebetiyle Film penceresinde &quot;Hücre ölümü&quot; düğmesini tıklatın. Bir bölünme oluştu sonra, kızı Hücreleri sağa otomatik modunda izlemeye başlamak için Hücre editör penceresinde belirlenen yavru hücre çemberi sembolü tıklayarak aynı hücre kaderinin harita izlenebilir. </li><li> Ağaç kaydetmek için F10 tuşuna basın. Her ağaç belirlenen çıkış kat kaydederer (TTTExport). Yeni bir hücre kaderinin haritası başlatmak için, Hücre editör penceresinde &quot;Dosya&quot; ardından &quot;Aç&quot; menüsü altındaki &quot;Yeni koloni&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Hücre düzenleyicisi penceresinde &quot;Hücre veri&quot; sekmesinden toplama sonra hücrenin ömür veri sıralayınız. </li></ol> 7. İstatistiksel Analizler <ol><li> Ya Student t-testi kullan (iki genotipi karşılaştırarak) veya ANOVA belirlemek için (&gt; iki genotipi karşılaştırarak varsa) gibi başlangıç ​​hücre kolonileri, hücre yaşam veya saat numaraları gibi parametrik veriler farklılıklar farklı genotipleri arasındaki EMT görünümünü istatistiksel kadar ise önemli. Apoptotik frekans numarası / Student t-testi ve ANOVA kullanılarak toplam sayısı kaplamalı hücreler veya yapışık hücrelerin yüzdesi olarak türetilmiş Mann-Whitney veya Kruskal-Wallis ile mukayese edilebilir. </li><li> Gerek deneysel çoğaltır kaç belirlemek için ilk deneyleri analiz verileri kullanarak güç testleri gerçekleştirin yeterli s için yapılan ve hücre kaderinin haritalar her çoğaltmak eldemevcut ücretsiz kullanarak tatistical güç (örn. <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). Burada sunulan deneylerde, genotip başına üç fareler türetilmiş hücre kültürlerinde spesifik genetik değişiklikler yapılmış iken hücre koloni oluşumu ve hücre yaşamlarda istatistiksel olarak anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için yeterli idi. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Kritik adımlar Bu meme bezlerinin meme epitel hücre davranışlarını yaşa bağlı değişkenlik kontrol etmek için aynı yaştaki farelerin hasat sağlamak için önemlidir. Hücreler kaplama, hücreler aynı sayıda her bir deney için her bir kuyuya kaplanacaktır. Kültürler mümkün seri görüntüleri aracılığıyla birden çok tek tek hücrelerin takip yapma çok hızlı konfluent olmazlar böylece kaplama yaparken Hücreleri nispeten seyrek olmalıdır. Bu plaka dengelenmiş son...

Genetik mühendisliği fare modelleri incelemek ve farklı genetik lezyonlar meme kanseri riskine katkıda anlamak için kullanılan araçlardır. Örneğin, genetiğiyle oynanmış farelerin göstermiştir ki, üç faktörün kombinasyonu: tam uzunlukta meme kanseri 1, erken başlangıçlı (BRCA1) meme epitel hücrelerinde gen, tümör protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency ve epitel meme kaybı hücre hedefli up-regüle östrojen reseptör alfa, BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Meme Tümör Virüsü (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (% 100 oranında meme kanseri gelişiminde (ERA) ifadesi sonuçları tet-op) -ER/MMTV-reverse tetrasiklin Transaktivatörü (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 bildirilen düşük yüzdeler + / karşılaştırıldığında yaş 12 ay rtTA farelerde - ERA olmadan fareler aşırı ekspresyonu (~ 50 - % 60) ve TP53 haploinsuf olmadan BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre farelerdeficiency (&lt;% 5). 1 Preneoplastic birincil meme epitel hücrelerinin davranış Dinamik time-lapse görüntüleme az kolayca statik doku kesitlerinde takdir hücre davranış farklılıkları ortaya koymaktadır. Proliferasyon ve farklılaşma değişiklikler insan BRCA1 mutasyon taşıyıcılarında primer meme hücrelerinde görülmektedir. Tek hücre normalden birincil meme epitel hücrelerinin süspansiyonlar ve genetiğiyle oynanmış farelerin 2 Yaratılış Rezeke meme bezi dokusu enzimatik ayrışma yoluyla üretilir. 3. Time-lapse görüntüleri hücre kolonisi görünümü ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve apoptoz gibi hücrelerinde morfolojik değişikliklerin insidansı mekanizmasını ve zamanlamasını değerlendirmek için görüntülenebilir. Hücre kaderinin harita üretimi, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi kalıplarının belirlenmesi arasındaki sürenin uzunluğu ölçümü tek hücreli izleme kullanımı ile kolaylaştırılmaktadır. Timm&#39;S Takip Aracı (TTT) tek hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılan kamuya açık yazılım. Hücre kaderinin mekanizmalarının aydınlatılmasına Onun programı normal hematopoetik kök hücre gelişimi 6-9 ve nöronların nesil inceleyerek 4,5 kurulmuştur. 10.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> EpiCult-B Bazal Orta Fare </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Yayılmasının Önlenmesi Takviyeler Fare </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinant insan Epidermal Büyüme Faktörü (rhEGF) </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz / Hyaluronidaz </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Tek Scapels </td><td> Tüy </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Klorür </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 mikron hücre süzgecinden </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Zaman aralıklı görüntüleme meme kanseri farklı genetik olarak fare modelleri elde edilen kültür birincil preneoplastic meme epitelyal hücrelerinin davranışını karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, hücre bölünmeleri (hücre yaşam), apoptotik hücre sayıları, morfolojik değişiklikler evrimi ve koloni oluşum mekanizması arasındaki zaman ölçülebilir ve belirli genetik lezyonlar taşıyan hücreler karşılaştırıldı. Primer meme epitel hücre kültürlerinde palpabl tümör olmadan meme bezleri tarafından üretilir. Bezler dikkatlice bitişik kas açık bir ayrım ile eksize edilir, lenf düğümleri kaldırılır ve zenginleştirilmiş meme epitelyal hücrelerinin tek hücre süspansiyonları enzimatik çözünme ve süzme, ardından kıyma meme dokusu tarafından oluşturulur. Tek hücre süspansiyonları canlı hücre görüntüleme için bir inkübatör içinde kaplama ve mikroskop altında doğrudan yerleştirilir. Her w bir 4x4 konfigürasyonunda Onaltı 650 mikron x 700 mikron alanları6-kuyulu plakanın arşın 5 gün için her 15 dakikada görüntülü. Time-lapse görüntüleri doğrudan ilk 24 hücreleri kaplama ve sa (agregasyon karşı hücre çoğalması), apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı içinde hücre koloni oluşum mekanizması ve frekans içerebilir hücresel davranışları ölçmek için incelenmiştir. Tek hücreli izleme bireysel hücre yaşam ve hücre bölünmesi desen soruşturma ölçümü için hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılır. Nicel veriler istatistiksel olarak belirli genetik lezyonlar ile ilişkili davranış önemli farklılıklar için değerlendirmek için analiz edilir.

Epitel ve fibroblast hücreleri hücre morfolojisi ile ayırt edilebilir. Epitel hücreleri kübik şekil (Şekil 1A-B) ve form hücre kolonileri (Şekil 1A) var. Fibroblastlar, stromal hücre türü olan bir ince uzun morfoloji (Şekil 1C) sahiptir. Hücreler yuvarlak ve görüntüleme başlangıçlı (Şekil 2A-D) yüzen edildi. Plakasına eki sonra onlar düz oldu ve kübik tipi görünümü (Şekil 2E, H)</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

11.8K Görüntüleme.  Georgetown University. Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Video: Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Tıp

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Boyuna MRG Ardından Meme Kanseri Beyin Metastaz bir Fare Modeli geliştirmek için ultrason görüntüleme eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Katı Örneklerinin From İlköğretim Yumurtalık Kanseri Hücreleri alma için yöntem

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

Manyetik Rezonans Difüzyon Tensor Görüntüleme ile Meme Mimari Özellikleri İzleme ve algılama Meme Kanseri

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...