Dr Robert A. Weinberg (Whitehead Biyomedikal Araştırma, Cambridge Enstitüsü) Biz, bu iş ve bu yazının kritik düzenleme için Sayın Kieran Mellody (Manchester Üniversitesi, Manchester) cömert destek ve denetim için teşekkür ederim. Bu proje Research UK (CR-UK) hibe sayısı C147/A6058 (AO) tarafından desteklenen

1. Primer kültürlerinde insan normal meme fibroblastlar izolasyonu Şekil izole primer kültürlerinde insan normal meme fibroblastlar için deneysel prosedürleri özetlenmiştir. 1A. <ol><li> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM) gibi daha önce 12 açıklanan hücre disosiasyon tampon,% 10 fetal buzağı serumu (FCS), penisilin-streptomisin (200 üniteler / ml), kollajenaz tip I (1 mg / ml) ve hiyalüronidaz (hazırlayın 125 ünite / ml). </li><li> Meme dokusunun bir azalma mammoplasty (~ 0,5 gram) birkaç kez fosfat tamponlu salin (PBS) disseke yıkayın. Steril Jilet kullanarak küçük parçaları (&lt;1.5 mm 3) doku Kıyma. </li><li> Yukarıdaki hücre disosiasyon tampon (0.5 gram doku başına 10 ml) ve maksimum hızda 1 dakika için vorteks uygun bir miktar içeren 15 ml konik boru içine doku parçaları aktarın. </li><li> Disosiasyon tampon f hücre doku parçaları Digestveya 12-18 h 37 ° C yavaş ajitasyon * Not hala birçok tüp içinde kalan sindirilmemiş doku parçalarının parçaları olacağı. </li><li> Ajitasyon olmadan tüpü oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 5 ml serolojik pipetlemeyin kullanarak yeni bir konik tüp içine elde edilen stromal hücre ile zenginleştirilmiş süpernatant aktarın. </li><li> Stromal fraksiyonu 250 X g de 5 dakika santrifüj ve PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 250 X g de 5 dakika için tekrar Santrifüj ve% 10 FCS ile desteklenmiş DMEM hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Kültür DMEM 37 ° C ve% 5 karbondioksit az 15 cm petri% 10 FCS içeren hücreler. </li><li> Konfluent kadar hücreleri yayma. Genellikle 8-10 gün sürer. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta (% 10 dimetil sülfoksit ve DMEM 20% FCS). Özgün bir stok olarak 5 dondurulmuş şişeleri hazırlayın. 5 nüfus içinde geçişli bir flakon çözülme ve hücreler, fibroblastlar içeren ikincil hisse senedi için 5 flakon hazırlamak için genişletmeksonraki deneyler için çiftlenmeler (PDS). Bu prosedürler uzun süreli doku kültürü sırasında meydana gelebilir klonal seçimi ve kültür stresi en aza indirmek. P1.1-7 aynı zamanda bir mastektomi 12 ile elde edilen meme karsinomlarında CAFs izole etmek için kullanılabileceğini unutmayın. </li></ol> 2. GFP-etiketli puromycin dayanıklı, ölümsüzleştirilmiştir normal insan meme fibroblastlar Üretimi <ol><li> P1.7 izole birincil normal insan meme fibroblastlar) ölümsüzleştirmek için, hem hTERT ve GFP ifade eden bir retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektör 12, tanıtmak. Kültür sonra 4-5 gün boyunca hücre ve GFP pozitif flow sitometri kullanarak hücrelerin sıralayabilirsiniz. </li><li> GFP etiketli ölümsüzleştirilmiştir fibroblastlar bir puromycin direnç geninin kodlama inşa retroviral pBabe-puro tanıtın. Kültür puromycin varlığını 5-7 gün (son konsantrasyonu: 1 mcg / ml) hücreler, GFP pozitif (GFP +), puromycin dayanıklı (puro R izole etmek için </sup&gt;) insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirdi. </li><li> Sonra, bu fibroblastlar, GFP ve puromycin direnci kodlayan genlerin yatay transferi yol büyüyebilir aktif virüsler, 2.5x10 5 GFP + puro R 2 gün boyunca 6 cm Petri kabındaki insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirdi. Üreten olmadığını incelemek için </li><li> Filtre orta bir şırınga filtresi (gözenek boyutu: 0.45 mikron) kullanarak bu fibroblastlar tarafından klimalı ve virüs enfeksiyonu verimliliğini artırır protamin sülfat (5 mg / ml) varlığında 12 saat için 10T1 / 2 fare fibroblastik hücreler üzerine ekleyin. Orta, sonra ek olarak 2 gün boyunca% 10 FCS-DMEM değiştirildi. </li><li> Floresan mikroskobu ile hücrelerin inceleyin. GFP virüs tarafından enfekte 10T1 / 2 hücreleri GFP pozitif olacak. 5-7 gün puromycin (1 mcg / ml) ile de hücrelerin tedavi ve herhangi bir puro R 10T1 / 2 hücreleri puromycin tedaviden sonra mevcut ve form koloniler halinde plaka gözlemlemek. </li><li> Not yatay gen tranebeveyn, GFP + puro R insan meme fibroblastlar tarafından üretilen aktif virüsler tarafından sfer içinde tümör xenografts çevreleyen fare hücreleri ve / veya karsinom hücreleri GFP + puro R neden olabilir. Bu başlangıçta enjekte GFP + puro R tümör xenografts insan meme fibroblastlar tecrit işlemleri engelleyebilir. </li></ol> 3a. Immünyetmezligi fare meme kanseri hücreleri, insan meme fibroblastlar Coinjection Exp-CAFs üretmek için deneysel prosedürleri Şekil gösterilmiştir. 1BA. <ol><li> Mix 1x10 6 MCF-7-ras insan meme karsinomu hücreleri ve 3x10 6 GFP + R puro, P2.2 oluşturulan ölümsüzleştirdi insan meme fibroblastlar). Hücreleri,% 50 (v / v) enjeksiyon başına Matrigel 400 ul kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Subkutan immünyetmezligi çıplak bir farenin hücre karışımı enjekte edilir. CAFs farklı bağımsız olarak ayıklanırtümörler, bazı farelerin sağ ve sol yanları içine her karışımı implant. </li></ol> 3b. Insan meme fibroblastlar immünyetmezligi bir fare içine enjeksiyon <ol><li> Exp-CAFs karşı kontrol fibroblastlar oluşturmak için,% 50 (v / v) Matrigel başına enjeksiyon (Şekil 1Bb) ile kültür ortamı 400 ul P2.2 üretilen 3x10 6 GFP + puro R ölümsüzleştirdi insan meme fibroblastlar hazırlar. Fibroblastlar karsinom hücreleri ile karıştırın VERMEYİN. </li><li> Çıplak farelerin deri altı sitelerine P3b.1 hazırlanan fibroblastlar İmplant. </li></ol> * Inoküle fibroblastlar cilt altında fibroblastik doku değil, tümör oluşturacak unutmayın. 4a. Tümör xenograft diseksiyonu <ol><li> Diğer karsinom hücreleri ve / veya fibroblastlar coimplanted 42 gün post-implantasyon (Şekil 1BA). * Not subkutan insan meme kanseri xenograft barındıran fare EuthaniseFibroblastlar miyofibroblastik fenotip başlatmak için tümörün xenograftlarının içinde daha uzun bir süre 42 gün süreyle inkübe gerekebilir. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak künt diseksiyonu fare kanadını tümör xenograft Hasat. PBS içinde tümör dokusu bırakın. </li></ol> 4b. Fibroblast xenograft diseksiyonu <ol><li> Fibroblast xenograft 42 gün post-implantasyon (Şekil 1Bb) barındıran fare Euthanise. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak subkutan fibroblast xenograft parçalara ayır. Fibroblastik doku PBS içine yerleştirin * Not küçük bir saydam bir doku olarak görünen bir fibroblast xenograft, cilt altında bulmak zor olabilir . </li></ol> 5. Xenografts primer kültürlerinde hücrelerin hazırlanması <ol><li> Tümör (~ 0.5 gram) veya fibroblastik doku (~ 0,1 gram) incelemek için steril bir biyogüvenlik kabini kullanın. D 15 cm kültür üstüne eksize dokuların transferi1 ml PBS ish. Dokuların steril Jilet kullanarak küçük doku parçaları (&lt;1.5 mm 3) Kıyma. * Not fibroblast xenograft az 0.1 gram ağırlığında ise, birkaç ek fibroblast xenografts toplamak ve izolasyonu için hücre sayısını artırmak için bunları karıştırın. </li><li> Doku parçaları içeren bir hücre disosiasyon tampon (0.5 gram doku başına 10 ml) ve maksimum hızda 1 dakika vorteks 15 ml konik boru içine aktarın. </li><li> 3 saat hücre süspansiyonu 37 ° ° C&#39;de sürekli yavaş ajitasyon. </li></ol> 6. Kültür puromycin dayanıklı hücrelerin izolasyonu <ol><li> 250 X g de 5 dakika süreyle tümör veya fibroblast xenograft ya ayrışmış hücre süspansiyonu santrifüj ve PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 250 X g. az 5 dakika için tekrar Santrifüj % 10 FCS-DMEM ortaya çıkan hücre pelletini tekrar 37 puromycin varlığı (1 mcg / ml), 15 cm&#39;lik petri Kültür hücreleri ° Cve% 5 karbondioksit kirlenmesine neden olan herhangi bir karsinom hücreleri ve / veya fare stromal hücreleri ortadan kaldırmak için. Konfluent (2-4 hafta) kadar hücreleri yayma. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta kullanarak. * Not çıkan puro R hücreleri, belirlenen 42 günlük exp-CAF1 (Şekil 1BA) veya kontrol fibroblast-1 hücreleri (Şekil 1Bb), ölümsüz ve GFP için olumlu. Bu, bu hücrelerin, P2.3-6 açıklandığı gibi 10T1 / 2 hücreleri kullanarak aktif virüsler üretir kontrol edilmesi tavsiye edilir. </li></ol> 7a. Kültür exp CaF2 hücrelerin izolasyonu CAFs aktive miyofibroblastik fenotip daha da artırmak için, MCF-7-ras hücreleri ile 42 gün exp CAF1 hücreleri karıştırmak ve subkutan 200 gün ek süre için çıplak bir farenin içine onları tekrar enjekte. Puromycin (1 mcg / ml) varlığında% 10 FCS-DMEM ile 15 cm&#39;lik petri tek bir hücre süspansiyonu ve kültür hücreleri içine tümör xenograft inceleyin ve ayrıştırmaları gibi P6 belirtilen.1. Konfluent kadar (8-10 gün) hücreleri yayma. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta kullanarak. Çıkan puro R hücreleri, 242 günlük exp-CaF2 hücreleri (Şekil 1BA) olarak adlandırılır . 7b. Kültür-2 fibroblast hücreleri kontrolü çıkarımı Exp-CaF2 hücrelerine karşı kontrol fibroblastlar oluşturmak için, 200 gün için ayrıca çıplak bir fare içine subkutan karsinom hücreleri olmadan tek başına 42 gün kontrol fibroblast-1 hücreleri enjekte. Inceleyin ve P6.1 belirtildiği gibi puromycin (1 mcg / ml) varlığında% 10 FCS-DMEM ile 15 cm&#39;lik petri tek bir hücre süspansiyonu ve kültür hücreleri içine fibroblastik doku ayrıştırmaları. Konfluent (3-4 hafta) kadar hücreleri yayma. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta kullanarak. Çıkan puro R hücreleri kontrol fibroblast-2 hücreleri (Şekil 1Bb) olarak adlandırılır. 8. Temsilcisi Sonuçlar: Denetim fibroblast-2 ve exp-CaF2 cells, meme tümörü xenografts çıkarılan, insan belirten, insana özgü vimentin, prolil-4-hidroksilaz kollajen 1A, fibronektin, S100A4 ve fibroblast yüzey proteini (Şekil 2A) 11 mezenkimal belirteçler de dahil olmak üzere, güçlü bir pozitif boyanan bu hücrelerin köken ve mezenkimal doğa. Buna karşın, sitokeratin, epitel hücreleri için bir belirteç, bu GFP + fibroblastlar (Şekil 2B) lekeli değildi. Bu bulgular, bu nedenle çıkarılan exp CaF2 ve kontrol-2 fibroblast hücreleri başlangıçta fare xenografts girmiş ebeveyn insan meme fibroblastlar kökenli olduğunu göstermektedir. Önemlisi, daha yüksek bir oranda exp-CaF2 hücreleri α-SMA ve her ikisi de 42 günlük exp-CAF1 ve kontrol (Şekil-2 fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında miyofibroblastlar belirteçleri ekstraselüler matriks glikoprotein tenaskin-C 5, pozitif boyanan 2C, D) 11. Bu veriler, bu yerleşik insan meme fibr gösteriroblastlar giderek tümör xenografts içinde CAF miyofibroblastlar dönüşmeye. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> Şekil 1 şematik insan meme fibroblastlar izolasyonu. A) azalma mammoplasty doku steril Jilet (P1.2) kullanarak 15 ml konik tüp (P1.3) içine kıyılmış ve transfer edildi. Küçük doku parçaları sindirilir ve hücre disosiasyon tamponu (P1.4) (P1.5-7), in vitro kültür için hazırlanmıştır. Izole birincil insan meme fibroblastlar, hem hTERT ve GFP ifade retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektörü, ölümsüzleştirmek için kullanılmaya başlandı ve ortaya çıkan GFP pozitif hücreler flow sitometri (P2.1) kullanılarak sıralanır. Bir puromycin direnç geninin kodlama retroviral pBabe-puro vektör daha sonra bu hücrelerin içine tanıtıldı. Puromycin tedavi üzerine, GFP etiketli (GFP +) puromycin-dirençli (R) Puro, immortalised insan meme fibroblastlar (P2.2) izole edildi. Ba) oluşturmak için exp-CAFs, GFP + puro R ölümsüzleştirdi insan meme fibroblastlar subkutan immünyetmezligi çıplak bir fare (P3a) içine MCF-7-ras meme kanseri hücreleri coinjected. Tümör xenograft 42 gün sonra (implantasyon P4A) rezeke ve tek bir hücre süspansiyonu (P5) içine ayrışmış oldu. Bu hücreler daha sonra, herhangi bir kirlenmesine karsinom hücreleri ve fare stromal hücreler (P6) ortadan kaldırmak için puromycin varlığında in vitro kültüre edildi. Çıkan puromycin dayanıklı hücrelerin deneysel olarak üretilen CAF1 (exp-CAF1) hücreleri olarak adlandırılmıştır. 42 gün implantasyon sonrası rezeke Bu hücreler, MCF-7-ras hücreleri ile bir kez daha karışık ve subkutan (P7a) önce bir ev sahibi fare içine implante. Ortaya çıkan tümör, sonra disseke ayrışmış ve puromycin varlığı içinde kültür, ek süre için 200 gün büyümeye izin verildi. Izolepuromycin-dayanıklı hücrelerin exp-CaF2 hücreleri (242 gün) olarak adlandırılır. Bb) exp-CAFs karşı kontrol hücreleri izole etmek için, GFP + puro R MCF-7-ras hücreleri (P3b) olmadan insan meme fibroblastlar subkutan saf kültürlerin olarak çıplak bir farenin içine enjekte edildi ölümsüzleştirdi. Disseke fibroblastik doku implantasyon sonrası (P4b), 42 gün, kontrol fibroblast-1 hücreleri olarak adlandırılan tek hücreli süspansiyonlar (P5) ve puromycin dayanıklı hücreleri, ayrışmış, daha önce açıklandığı gibi (P6) izole edildi. Bu fibroblastlar 200 gün (p7b) için ek MCF-7-ras hücreleri olmadan bir kez daha çıplak bir farenin içine subkutan implante edildi. Fibroblastik doku ayrışmış, disseke ve puromycin varlığı içinde kültür edildi. Izole puromycin dirençli hücreleri kontrol fibroblast-2 hücreleri (242 gün) olarak adlandırılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> Şekil 2 <stRong&gt; Uzm CAFs ve kontrol fibroblastlar ebeveyn insan meme fibroblastlar kaynaklanan. (A) kontrol fibroblast-2 (kontrol f.) ve exp-CaF2 hücreleri immünofloresan analizleri. Hücre tipleri prolil-4-hidroksilaz insan vimentin, kollajen 1A, fibronektin, S100A4 ve fibroblast yüzey proteini de dahil olmak üzere mezenkimal belirteçleri (kırmızı), olumlu bir leke. (B) kontrast, pan-sitokeratin, epitel hücreleri için bir belirteç GFP (yeşil) ifade exp-CaF2 hücreleri tespit değildir. Hücre çekirdekleri 4&#39;-6 Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (mavi) ile boyandı. Ölçek bar, 50 mikron (Kojima ve ark anılacaktır. 11) (C) α-SMA (kırmızı) veya tenaskin-C (TN-C), (kırmızı) karşı antikorlar kullanarak exp-CaF2 hücreleri ve kontrol-2 fibroblast hücreleri (kontrol f.) İmmünofloresan. Hücre çekirdeklerinin DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçeği bar, 50 mikron exp-CaF2 hücreleri (D) 48% 1 ise, α-SMA için olumlu leke42 günlük exp-CAF1% 4 ve% 2,5 &#39;i kontrol fibroblast-2 hücre popülasyonlarının α-SMA için olumlu. (Kojima et al.11 sevk)

<ol>
	<li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+by+proxy:+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence?.">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?.</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+and+SF/HGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac.">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment.">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li><li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis.">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li><li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li><li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

CAFs bu hücre tipi kendi içinde bir meydan okuma karakterizasyonu hale arasından CAF-spesifik belirteçler ve heterojenlik eksikliği görülmektedir. In vitro olarak incelenmesi CAFs, ayrıca bu hücrelerin senesce ve uzun bir süre için kültüre prolifere ek bir komplikasyon engel olmuştur. Retroviral hTERT cDNA inşa kullanarak birincil CAFs doğrudan ölümsüzleştirmek için önceki girişimi başarısız oldu. Bu nedenle, bu hücrelerin tümör arttırıcı özellikleri daha fazla araştırmak içi...

<table border="1"><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu </td><td></td><td> Gibco </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz tip I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> hiyalüronidaz </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentin (V9) antikoru </td><td></td><td> Novocastra Laboratuvarları </td><td> NCL-L- Vim-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenaskin C (BC-8) antikor </td><td></td><td></td><td></td><td> bir hediye Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) antikoru </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolil-4-hidroksilaz </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) antikoru </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kollajen tip1 1A antikor </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-sitokeratin antikor </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronektin antikor </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblast- spesifik protein 1) antikoru </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblast yüzey proteini (Klon 1B10) antikoru </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP inşa </td><td></td><td></td><td></td><td> Yazarlar İsteği </td></tr><tr><td> pBabe-puro inşa </td><td></td><td></td><td></td><td> Satın alma Addgene gelen </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konik tüp </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Çıplak fare </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Bayan NCR Nude </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 hücreleri </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Karsinomlar neoplastik hücreler ve &#39;stroma&#39; olarak anılan bir kanser olmayan gözü oluşan karmaşık dokulardır. Stroma ekstrasellüler matriks (ECM) ve mezenkimal hücreler, fibroblastlar, miyofibroblastlar endotel hücreleri, perisitlerden ve 1-3 lökosit de dahil olmak üzere , çeşitli oluşur. Tümör ile ilişkili stroma komşu karsinom hücreleri tarafından yayımlanan önemli parakrin sinyaller duyarlı. Hastalık süreci boyunca, stroma genellikle miyofibroblastlar büyük numaraları da dahil olmak üzere, karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tarafından doldurulur olur. Bu hücreler in vitro kültürü için daha önce birçok farklı insan karsinomların tipleri çıkarılan edilmiştir. CAFs bir ICSI&#39;nin α-düz kas aktin up-regülasyon (α-SMA) ifade 4,5 ile ayırt edilebilir. Bu hücreler miyofibroblastlar c ile benzer özellikleri paylaşan bir işaretidir &#39;aktif fibroblastlar&#39;ommonly yaralı ve fibrotik dokuların 6 gözlenmiştir. Bu miyofibroblastik CAF alt kümesinin varlığı son derece yüksek dereceli maligniteler ile ilgili ve yoksul hastaların prognozları ile ilişkilidir. Birçok laboratuar, kendi de dahil olmak üzere CAFs karsinom hücreleri ile bağışık yetmezliği olan farelere enjekte tumourigenesis 7-10 önemli ölçüde teşvik yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Ancak karsinom hastaları hazırlanan CAFs,, sık sık devam eden deney boyunca kullanım yaygınlığı sınırlayıcı kültürünün yayılma sırasında yaşlanması tabi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, biz coimplantation meme tümörü xenograft modeli kullanılarak, deneysel insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirdi meme insan CAF hücre hatları (exp-CAFs) oluşturmak için yeni bir teknik geliştirdi. Azalma mammoplasty doku elde exp CAFs, ebeveyn insan meme fibroblastlar, üretmek için, ilk immortalihTERT, telomeraz holoenzyme katalitik subunit ve ifade GFP ve bir puromycin direnç geninin için tasarlanmış sed. Bu hücreler aktive ras onkogen (MCF-7-ras hücreleri) bir fare xenograft ifade MCF-7 insan meme kanseri hücreleri ile coimplanted. In vivo bir inkübasyon döneminden sonra, başlangıçta enjekte insan meme fibroblastlar, onların puromycin direnci 11 temelinde tümör xenografts çıkarıldı . Biz bir miyofibroblastik fenotip benimseyerek, yerleşik insan meme fibroblastlar farklılaşmış olduğu görülmektedir ve tümör progresyonu sırasında tümör destekleyici özellikleri satın aldı. Önemlisi, bu hücrelerin, exp-CAFs olarak tanımlanan yakından hastaların disseke meme karsinomları izole CAFs tümör teşvik miyofibroblastik fenotip taklit. Bu nedenle tümör xenograft türetilen exp CAFs, insan breas CAFs biyolojisini çalışmak için etkili bir modelt karsinomlar. Açıklanan protokol aynı zamanda, insan karsinomları diğer türleri türetilen çeşitli CAF popülasyonları ve tanımlamak için uzatılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts at JoVE.com

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tümör stroma içinde mevcut miyofibroblastlar zengin, tümör progresyonu sürüş önemli bir rol oynamaktadır. Biz deneysel insan meme fibroblastlar CAFs üretmek için bir coimplantation tümör xengraft modeli geliştirdi. Protokolü tumourigenesis teşvik etmek için bir yeteneği kazandırmak CAF miyofibroblastlar kurmak anlatılmaktadır.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K Görüntüleme.  University of Manchester. Karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tümör stroma içinde mevcut miyofibroblastlar zengin, tümör progresyonu sürüş önemli bir rol oynamaktadır. Biz deneysel insan meme fibroblastlar CAFs üretmek için bir coimplantation tümör xengraft modeli geliştirdi. Protokolü tumourigenesis teşvik etmek için bir yeteneği kazandırmak CAF miyofibroblastlar kurmak anlatılmaktadır.

Video: Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Tıp

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

İnsan internal meme arter (İMA) Transplantasyon ve Stent: In-Stent Restenozis Geliştirme Eğitim Bir İnsan Modeli

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

Parkinson Hastalığı Alanında Mitokondriyal Fenotiplerinin İzleme İlköğretim İnsan Fibroblast Kullanımı

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...