Yazarlar teşekkür etmek istiyorum: Bayan Alexia Saunders ve Bayan Michelle McPhedran deneysel yardım için, elektrot imalat için Bayan Helen Feng; Dr Penny Allen ve cerrahi yardım için Dr Jonathan Yeoh, Royal Victorian Göz ve Kulak Hastanesi Biyolojik Kurmay hayvan bakımı Araştırma Merkezi; boyunca genel rehberlik için Prof Rob Çoban ve Dr Bryony Nayagam ve el yazması bir taslak form üzerinde eleştirel yorumlar için Sayın Ronald Leung. Bu çalışma Biyonik Enstitüsü ve St Vincent Hastanesi, Melbourne yapıldı. Fon Ian Potter Vakfı, John T Reid Bağış Güven ve Bionic Vision Avustralya (BVA) Bionic Vizyon Bilim ve Teknoloji hibe yılında Özel Araştırma Girişimi ile Avustralya Araştırma Konseyi tarafından sağlandı. Biyonik Enstitüsü onun Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı aracılığıyla Victoria Hükümeti aldığı desteği kabul eder.

1. Enükleasyon ve Post-Fiksasyon Bu protokol konu bir suprakoroidal elektrot dizi ile tek taraflı implante olduğunu varsayar. <ol><li> Cam Schott şişelerde postfix çözümler hazırlayın. <ol class="lalpha"><li> Davidson&#39;un fiksatif çözüm, 100 ml 2x <ul><li> Formalin 2 ml (% 37 formaldehit) </li><li> 10 ml buzlu asetik asit (% 99.7) </li><li> 35 ml etanol (% 98) </li><li> 53 ml distile su </li></ul></li><li> % 50 etanol, 100 ml 2x </li><li> % 70 etanol, 100 ml 2x </li></ol></li><li> Transcardially ile sıcak konu serpmek (37 ° C) takip heparinize tuzlu soğuk (4 ° C) nötr (10%) tamponlu formalin. </li><li> Her iki gözde üstün limbus (veya suprakoroidal diziden uzak bir yerde) de sütür kravat - Bir rektus doğrultusunda, bir dönüm noktası olarak hizmet etmek. </li><li> Aydınlatmak gözler, implante göz herhangi bir dış yol korumak. </li><li> EAC yerleştirinh Davidson&#39;un fiksatif solüsyonu 100 ml göz ve oda sıcaklığında post-düzeltmek için bırakın. </li><li> 18 st sonra -% 70 etanol ile (oda sıcaklığında) son olarak, daha sonra 8 saat - Davidson sabitleştirici 36 saat için 6,% 50 etanol (oda sıcaklığında) aktarın. </li><li> 4 numune buzdolabında diseksiyonu kadar ° C ve mağaza. </li></ol> Sağlam ve basınçlı göz küreler olumsuz sonuç histoloji etkilemeden 3 ay için bu şekilde kadar saklanır edilmiştir. 2. Kimlik ve Doku Haritalama Yukarıdaki tespit protokolü (adım 1) sklera saydam hale ve dizi şimdi görünür - bireyin elektrot siteleri (Şekil 3) de dahil olmak üzere. <ol><li> Etanol implante dünya çıkarın ve dikkatli konjonktiva ve Tenon kapsülü dahil olmak üzere aşırı doku, uzak trim. 3 mm uzunluk (Şekil 3A) - 2 ile optik sinir kesin. </li><li> Bir histolojik boya markin kullanarakg düzeni, önceden tanımlanmış bir renk kodu ile etiket elektrotlar, boya bulaşmaya özen. </li></ol><ul><li> Biz özel histolojik boya bir ticari paketi (Ek bakınız) seçti. Boya Az miktarda dikkatle dokuya ince uçlu boya fırçası (Roymac boyutu 00) ile uygulanır ve en fazla 5 dakika için kurumaya izin verildi. </li><li> Diğer aktif elektrotlar için kırmızı,, büyük çaplı geri dönüş elektrotları için sarı, (idi) olan aktif elektrot (ler) için yeşil çalışma süresi için, suprathreshold düzeyde, maksimum teşvik ve: Bizim için, biz seçtik ek kılavuzları ve / veya anatomik mesafe işaretleri (Şekil 3B ve 3C) için mavi. </li><li> Bazı deneme yanılma sonraki aşamalar boyunca stabil olan bir boya bulmak için gerekli olabilir. Örneğin, Şekil 4, bu yeşil boya kırmızı boyanın daha esnek olduğu görülebilir. % 70 etanol içinde boya sulandırma lipit Penet artırmaya yardımcı olurrasyon ve doku kaplama. </li><li> Bu ileride boyalı dünya kroki veya fotoğraf için yararlıdır. </li></ul><ol start="3"><li> Boya kurutmak için% 70 etanol dön. </li><li> Unimplanted kontrolü dünya için 2.1 adımı tekrarlayın. </li><li> Adım 1.3 dikişler kullanarak, kontrol göz ve bir aynalı çift olarak implante göz hizalayın. </li><li> Implant implante dizi konumunun hazır görselleştirme izin implante göz (NB saydam sklera ve adım 2.2 boya işaretleri bulunur gibi kontrol göz yansıtılmış yerde bir silikon şablon (elektrot dizisi ile aynı boyutlara sahip) yerleştirin .) </li><li> Her implante elektrot sitesi bir anatomik karşılaştırılabilir (yani ayna eşdeğer uyumlu) bir yerde bir kontrol çift vardır, böylece adımları kontrol göz için 2.2 ve 2.3 gerçekleştirin. </li></ol> 3. Diseksiyon ve Gömme <ol><li> Gözünden implant dizi çıkarın ve gözün ön kaldırma(Kornea, iris ve lens dahil). Kalan göz fincan (arka kamara) gelen vitreus sıvı çıkarın. </li><li> Birden Örnek şeritler (~ 2 mm kalınlık) boya işaretli bölgeler (Şekil 3B) bir alt kümesini içeren her biri içine göz implante ayır. Şeritlerin yönünü implant 7 doku tepkisi çeşitli yönlerini değerlendirmek yardımcı olmak için seçilmiş olması gerektiğine dikkat ediniz. </li></ol> Bu boya bölgelerde her şerit ve onların göreceli konumları (ve renk) mevcut olan bir kayıt yapmak için, ileride, yararlıdır. <ol start="3"><li> İlk bakan aşağı (Şekil 3E) kesilecek yüzü -, sıvılaştırılmış agar sığ bir havuz (90 ° C 80% 4) içine yan şerit yerleştirin. </li><li> Bir kez ağar, set köpük ekler (Şekil 3F) tarafından desteklenen bir doku kaset içine örnek ve yeri çevresinde azalttı. </li><li> Tekrar kontrol göz için 3.1-3.3 adımları - taking bakım ayna-uyumlu şeritler incelemek. </li><li> Standart (gece otomatik) parafin işleme tekniği yoluyla tüm kasetleri işleyin. </li><li> İlk aşağı bakacak kesilecek yüzü parafin içinde işlenen doku yerleştir. </li></ol> 4. Kesme ve Boyama <ol><li> Adım 2 ve 3 notları düzenli olarak atıfta 5 mikron bölüme parafin blok kesin. </li><li> Boyalı bölgelerin her birinden bölümleri toplayın ve slaytlar monte. </li></ol> Sklera her boyalı noktaya hemen bitişik bölge şimdi dizideki karşılık gelen elektrot (Şekil 4) en yakın yakınlık olduğunu güvenle değerlendirilebilir. <ol start="3"><li> Leke ya da istediğiniz gibi immünofloresan gerçekleştirmek. Şekil 5&#39;te gösterilen Örnek lekeleri ve immünhistokimya şunlardır: H &amp;e; Luxol hızlı mavi (LFB); cresyl menekşe, Masson trikrom mavi, periyodik asit schiff (PAS); Perls &#39;Prusya mavisi staiçerisinde, anti-glutamin sentetaz (GS), bir anti-sinir lifi Protein (NF), anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) ve 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). </li><li> Standart ve özel lekeleri ayrıntılı olarak yapıldı: <ol><li> H &amp; E boyama Leica multistainer banyosu dizi ST5020 (Leica Biosystems) tarafından sağlanan yönteme göre yapıldı. </li><li> LFB ve cresyl menekşe (11 değiştirilmiş): <ol><li> Ksilen 3 değişiklikler (3x 2 dakika) ve etanol 2 değişiklikler (% 100,% 100) (2 x 1 dakika) ve musluk suyu (45 sn) durulama mumunu gidermek. </li><li> % 95 etanol, hidrat bölümleri. </li><li> 37 LFB çözüm 11 koyun - 42 ° C (gece). </li><li> Fazla% 70 etanol ile leke durulayın. </li><li> Damıtılmış suyla durulayın. </li><li> Seyreltik lityum karbonat yerleştirin (8%) (birkaç saniye). </li><li> % 70 etanol (birkaç saniye) içinde ayırt. </li><li> Damıtılmış suyla durulayın. </li><li> Gerekirse b kadar, 4.4.2.8 adımları 4.4.2.6 tekrarlayınackground renksizdir. </li><li> 37 ° C (10 dakika) cresyl menekşe asetat çalışma çözüm yerleştirin. </li><li> Suda yıkamayın. </li><li> Mutlak alkol 3 değişiklik (1x 30 sn, 2x 20 sn) ve ksilen 3 değişiklik (1x 1 dk 30 sn, 2x 1 dak) kurutmak. </li><li> DPX Mount ve kapak. </li></ol></li><li> Masson trikrom mavi (11 değiştirilmiş): <ol><li> 4.4.2.1 göre mumunu gidermek. </li><li> Bölümler su (2 dk) getirin. </li><li> Weigert demir hematoksilen (2 dk) kullanarak çekirdekleri leke. </li><li> Musluk suyunda yıkayın, distile su ile durulayın. </li><li> Biebrich kızıl-asit fuksin solüsyonu (5 dk) leke. </li><li> Damıtılmış suyla durulayın. </li><li> Kollajen soluk pembe (6 dk) kadar fosfomolibdik-fosfotungstik asit ayırt. </li><li> Damıtılmış suyla durulayın. </li><li> Anilin blue (1 dakika) Counterstain. </li><li> % 1 asetik asit (1 dakika) içinde iyice yıkayın. </li><li> P olarak kurutmak, montaj ve kapaker 4.4.2.12 ve 4.4.2.13. </li></ol></li><li> PAS (11 değiştirilmiş): <ol><li> 4.4.2.1 göre mumunu gidermek. </li><li> % 1 periyodik asit (15 dakika) okside eder. </li><li> Su daha sonra saf su çalışan yıkayın. </li><li> Schiff reaktifi (15 dakika) leke. </li><li> Su (5 dakika) yıkanır. </li><li> Harris hematoksilen (1 dk) ile Counterstain. </li><li> Musluk suyu kısaca yıkayın. </li><li> % 0.5 asit alkol (1 dip) olarak ayırt. </li><li> Musluk suyu içinde iyice yıkayın. </li><li> Scott&#39;ın musluk suyu (1 dak) Mavi. </li><li> Su ile iyice yıkayın. </li><li> 4.4.2.12 ve 4.4.2.13 göre, montaj ve kapak kurutmak. </li></ol></li><li> 11 &#39;de tarif edildiği gibi perls&#39; boyası. </li></ol></li><li> İmmünofloresan boyama ayrıntılı olarak yapıldı: <ol><li> 4.4.2.1 göre mumunu gidermek. </li><li> Distile su (2x 5 dakika) ile durulayın. </li><li> ° C (20 dakika) 80-75% 0.01 sitrat tamponu, pH 6 kullanılarak antijen alma gerçekleştirmekD% 0.01 sitrat tampon çözeltisi (20 dakika) içinde soğumaya bırakın. </li><li> Fosfat yıkayın bölümler tuzlu su (PBS) (2 x 5 dakika) tamponlu. </li><li> Yıkama tampon çözeltisi (10 dakika) hücre zarının geçirgenliği artar. </li><li> Serum blok çözeltisi (2 saat) inkübe edin. </li><li> Antikor sulandırıcı ile sulandırılmış bir tek primer antikor (% 10 normal keçi serum/0.1% Triton X-100/PBS) (buzdolabında gece) bölümleri inkübe edin. Kullanılan her bir primer antikor titresi Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra, yıkama tampon çözeltisi (5x 3 dk) bölümleri yıkayın. Bu noktadan itibaren, karanlıkta bölümleri tutun. </li><li> Belirli bir süre (ayrıntılar için bakınız Tablo 1) için 1:500 bir titre de ilgili ikincil antikor bölümleri inkübe edin. </li><li> Yıkama tampon çözeltisi (3 x 5 dakika) bölümleri yıkayın. </li><li> DAPI (1:25000 / PBS) (30 dk) bölümleri inkübe edin. </li><li> Yıkama tampon çözeltisi (3 x 5 dakika) bölümleri yıkayın. </li><li> Montaj ve kapak floresan kullanaraknt montaj medya. </li></ol></li></ol> Test örnekleri ve kontrol örnekleri çiftli karşılaştırması için hazırdır.

<ol>
	<li>Santos, A., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Villalobos, J., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+approach+for+a+wide-view+suprachoroidal+retinal+prosthesis:+evaluation+of+implantation+trauma.">Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).</li><li>Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+testes+and+eyes+using+a+modified+Davidson's+fluid:+comparison+with+Bouin's+fluid+and+conventional+Davidson's+fluid.">Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid.</a> Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).</li><li>Agrawal, R. N., He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+proliferative+vitreoretinopathy.">In vivo models of proliferative vitreoretinopathy.</a> Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histological techniques. , (2008).</li><li>Horobin, R. W., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Troubleshooting histology stains. , (1998).</li><li>Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamante+in+some+retinal+neurons+is+derived+solely+from+glia.">Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia.</a> Neuroscience. 60, 355-366 (1994).</li><li>Lewis, S. E., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phosphorylated+variants+of+the+high+molecular+mass+subunit+of+neurofilaments+in+axons+of+retinal+cell+neurons:+characterization+and+evidence+for+their+differential+association+with+stationary+and+moving+neurofilaments.">Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments.</a> J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).</li><li>Ruiz-Ederra, J., Garc&#237;a, M., Hicks, D., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+neurofilament+subunits+within+pig+and+human+retinal+ganglion+cells.">Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells.</a> Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).</li><li>Bringmann, A., Pannicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M&#252;ller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina.">M&#252;ller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).</li><li>Seo, J. M., Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+polyimide+microelectrode+array+for+retinal+stimulation.">Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).</li><li>Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+implantation+of+epiretinal+retina+implants+(EPI-RET)+with+an+IOL-type+receiver+unit.">Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit.</a> J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).</li><li>Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Pardue, M. T., Stubbs, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+studies+of+the+retina+following+long-term+implantation+with+subretinal+microphotodiode+arrays.">Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays.</a> Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).</li><li>Gekeler, F., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+subretinal+prostheses+with+extra-ocular+parts+designed+for+human+trials:+successful+long-term+implantation+in+pigs.">Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs.">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li><li>Ray, A., Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+retinal+neurons+under+electrical+stimulation.">Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation.</a> Brain Res. 1255, 89-97 (2009).</li><li>Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+suprachoroidal-transretinal+stimulation+current+resulting+in+retinal+damage+in+rabbits.">Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits.</a> J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).</li><li>Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+chronically+stimulated+platinum+intracochlear+electrodes.">Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes.</a> Biomaterials. 6, 237-242 (1985).</li><li>Villalobos Villa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pre-Clinical+Model+for+Chronic+Electrical+Stimulation+of+the+Retina+via+Suprachoroidal+Electrodes.">A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes.</a> , (2012).</li><li>Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis+is+Safe+in+a+Chronic+Implantation+Model.">A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model.</a> in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. , (2011).</li><li>Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina:+effects+of+electrode+return+configuration.">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009 (2012).</li><li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil.">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li><li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs.">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li><li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wolff's anatomy of the eye and orbit. , (2001).</li><li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina.">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li><li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis.">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Implantın güvenlik değerlendirilmesi klinik öncesi çalışmalar için bir temel unsurlardan biridir. Bir retina protezi insanlarda implante edilebilir önce herhangi bir zarar vermez doğrulamak için gereklidir. Bu implant biyouyumluluk 17-23 hem de 24-26 kronik elektrik stimülasyonu neden olabilir olası hasar hem de bir değerlendirme gerektirir. Bu koklear implant gibi benzer nöral protez, deneyim, stimülasyon geniş ve doku hasarı 27 neden olmaz fiziksel, parametrelere fikir verir. Ancak, retina diğer implantasyon sitelere farklı özellikler ve bu nedenle hassas güvenlik sınırları (örneğin maksimum yük yoğunluğu gibi) diğer sistemlerde daha önceki çalışmalardan kabul edilemez vardır. Yük yoğunlukları aktif elektrot siteleri en yüksek ve bu zarar için en büyük potansiyeli olan gelir. Doğrudan bitişik dokuya lokalize Bu nedenle bir yöntemBireysel aktif elektrotlara büyük ölçüde bu çalışmaların yararını arttıracaktır. İmplantın belirli bölgelerine komşu doku da daha yakından inceleme için belirgin olarak görünebilir. Bu hedef yaklaşım &quot;en kötü durum senaryosu&quot; incelenmiştir olduğunu koruyarak güven iken, analiz edilmesi için daha az bölümleri izin verir. Burada açıklanan skleral boya lokalizasyon yöntemi yaygın el şeklinde ve kalıplı silikon / Pt elektrot dizileri 28-30 ile test edilmiştir. Bu ince film poliamid diziler 7,31 ve aynı zamanda ince film silikon / Pt diziler 32 ile kullanılmıştır. Bazı retina protezi çalışmalar intraskleral implantasyonu 33 ile &quot;mermi şeklinde&quot; elektrotlar kullandı. Mevcut teknik elektrod dizileri bu tür değerlendirmek için etkili olmalıdır. Ince sklera ile Kedi gözleri (arka kutup 90 kalınlığı - 200 mikron) bir dizi bireysel elektrot görselleştirme izin verdi. Ancak, olsa bile tek tek elektrodes konumlarını kolayca dizinin taslak (adım 2.6 kullanılana benzer) görülebilir bir silikon şablon kullanılarak türetilmiş olabilir, görünür değildi. Boya eşleme boya ile mevcut yalnızca bölümlerini elde edilen gibi ilgili olmayan doku bölümleri elde etmek için ihtiyaç sınırlar. Doğru elektrot konumu anlaması için yeteneği ilgili histopatolojik analizi ve daha fazla istatistiksel güç verir, ancak işçilik maliyeti yanı sıra kullanılan slaytlar ve bıçaklar miktarı azaltarak zaman ve maliyet yönetimi üzerinde önemli bir etkisi vardır sadece. Yapışık olduğunu ve aynı zamanda boyanmamış doku kesitlerinde görünür olmak iken doku işleme dayanabilir boyanın kullanılması önemli bir başlangıç ​​husustur. Diseksiyon da doku, boya ve oryantasyon ve gömme sırasında yeri hakkında bilgi kesme işlemi yardımcı olur. Bu doğru eğik kesilmez bir bölüm elde etmek için blok yönlendirici içeren ve tam representati verirdoku üzerinde. Bu kesim yapan kişi boya uygulama, diseksiyon ve gömme sırasında mevcut olduğunu önemlidir. Genel protokol özellikle tespit zamanlamaları ile, küçük değişiklik için sağlamdır. Ancak, göz diseksiyon ve boya işaretleme adımları iyi el becerisi yarar numune zarar vermemek için bu hassas işlemlerdir. Davidson&#39;un sabitleştirici bir implant yakın retina dekolmanı artefakt azaltmak için etkili olduğu kanıtlanmıştır iken, bu diseksiyonu sırasında doğrudan mekanik hasar engellemez. Davidson&#39;un sabitleştirici bazı özel histolojik ve immünohistokimyasal işlemleri ile kolayca uyumlu değildi. Bu nedenle yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi adımları değiştirmek / optimize etmek için bir ihtiyaç vardı. Optimum sonuç elde edilene kadar boyama süreleri ve konsantrasyonları artan değişiklikler yapılmıştır - Daha fazla bilgi için, ek materyalleri bakın. Retina ölçümühistoloji sorunlu olmaya devam etmektedir. Retina homojen olmayan ve kalınlığı ve alan centralis 34,35 den artan mesafe ile hücre yoğunluğu değişim hem de. Bu nedenle, göz implante içinde komşu doku karşılaştırmaları için kullanılamaz ve bir kontrol gözü yerine kullanılır. Pairwise kontrol gözle her bölümün uyan bize patolojik değişikliklerin daha güçlü bir istatistiksel karşılaştırma verir, bir konu 36 diğer gözleri karşılaştırırken retina protez ile etkinlik ve emniyet sonuçları daha iyi değerlendirilir. Özel bakım Bu miktar etkileyecek gibi eğik kesme en aza indirmek için alınması gerekir. Özet olarak, yöntemler belirgin da daha verimli bir ön-klinik akışına yol açmıştır eden histopatolojik inceleme, iyileştirilmiştir yukarıda tarif edilmiştir. Bu yöntemleri kullanarak klinik öncesi çalışmaların sonuçları doğrudan 3 RP hastaların güvenli bir şekilde suprachoroi ile implante edildiği bir klinik çalışma yol açtıdal retinal protez. Bu yöntemler, retina uyarıcıları ve uzun süreli implantasyon için patolojik yanıt değerlendirilmesi gereken diğer oküler implant hem de ilgilidir. Bu yöntem, implant üzerinde ilgi bölgelere patolojinin hücre mimarisini ve kayıt muhafaza edilmesi için değerli bir avantaj sağlanmaktadır. Özel olarak test Bununla birlikte, bu prosedürlerin bir modifikasyonudur bir dizi yüzeysel implante edilir özellikle burada, diğer türler ve diğer anatomik yerlerde kullanılabilir.

Retina protezleri kısa sürede ciddi görme kaybı çeşitli şekillerde tedavi için yararlı klinik müdahaleler olabilir. Bazı tür retinitis pigmentosa gibi koşullar, (RP), göz fotoreseptör yaygın dejenerasyonu sonucu, bu sinir sinyalleri ışık iletici sorumlu hücrelerdir. Bununla birlikte, retinanın diğer katmanları bazı hücrelerin kalır ve bir retina protez 1 ile elektriksel uyarımı için potansiyel hedeflerdir. Insan klinik çalışmalarda ilk sonuçlar elektrot epiretinal 2,3, subretinal 4,5 implante diziler ve intraskleral 6 yerler için umut verici olmuştur. Bu cihazlar farklı şekillerde farklı malzemelerden yapılmış, ama hepsi görsel gözlemleri yaratmak için retinanın kalan canlı nöronların etkinleştirmek için elektrik sinyalleri kullanırlar. Bizim daha geniş grup (Bionic Vision Avustralya) ilerleyici olan bir retina implant geliştirmiştirsuprakoroidal elektrot dizileri (Klinik Çalışma Numarası: NCT01603576) implante 3 RP hasta ile klinik pilot çalışma için sed. Şekil 1A bu suprakoroidal prototip retina protezi gösterir. Hasta güvenliği insan çalışmaları başlamadan önce, biz (Şekil 1B) klinik öncesi modellerde geniş akut ve kronik testi uygulandı, böylece klinik çalışmalarda her şeyden önemlidir ve. Histopatolojik değerlendirmeler, cerrahi işlemler refine elektrot tasarım yineleme, ve sonuçta implantın güvenliği açısından gerekli idi. Standart klinik patoloji uygulamaları ile örtüştüğünü verimli bir iş akışı sağlamak için, bir parafin gömme tekniği kullanılmıştır. Aynı zamanda kolayca patolog tarafından yorumlanır hematoksilen ve eozin (H &amp; E), gibi klinik standartlar ile karşılaştırılabilir boyama işlemleri kullanmak için arzulanan bir durumdur. Ayrıca, immünohistokimyasal analiz için adapte edilebilir bir tekniği, aranandaha da dokuların hücresel değerlendirme kolaylaştırmak için sipariş. Implant malzemeleri ve kronik elektriksel stimülasyon güvenlik biyouyumluluk, dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Bu, dizi içindeki ayrı uyarıcı elektrotlar bitişik oküler doku patolojisi test edebilmek için önemlidir. Ancak, diziler bunlar test edilebilir böylece örnekleri işleme önce kaldırılması için gerekli, ve metalik bileşenler kolayca kesitli olamazdı çünkü. Sonuç olarak, bizim kurulan doku hazırlanması implante elektrotlar 7 ile ilgili doku lokalizasyonu ve haritalama izin vermedi. Bir doku lokalizasyonu metodu eksikliği ek olarak, standart formaldehit bazlı tespit ve işleme teknikleri gözün çeşitli katmanlar ayırıcı çekme (Şekil 2) için en yaygın retina nedeniyle eser ve ayrılması ile sonuçlanmıştır. T homojensizlik nedeniyleo retina, özellikle kantitatif ölçümler için, kontrol doku ile geçerli karşılaştırmalar yapmak zordu. Bu kombine sınırlamalar bizim implante diziler neden potansiyel zararı doğru değerlendirmeler karmaşık. Burada bu sınırlamaları aşmak için yeni teknikler mevcut. Biz parafin bazlı histoloji ile uyumluluğu korumak için özel göz fiksasyon ve işleme teknikleri 8-10 değiştirdiniz. Biz klinik patologlar gelen yorumlarına dayanarak, karşılaştırılabilir sonuçlar vermek için standart histolojik ve immünohistokimyasal lekeleri değiştirdiniz. Skleral doku saydam render sonra, boya temelli renkli-kodu suprakoroidal uzaydan dizi çıkarmadan önce, her bir elektrot bitişik oküler doku işaretlemek için kullanılmıştır. Elektrot dizi ve tek tek elektrot siteleri işaretleyerek, örnekleri doğru elektrot komşu bölgelerden toplanmış olabilir. Uyumlu örnekleri inci elde edilebilirE kontrolü göz ikili karşılaştırmaları kolaylaştırmak için.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

Retina protezlerin son gelişmeler ile, klinik öncesi çalışmalarda bu cihazların güvenliğini değerlendirmek için güvenilir teknikleri geliştirmek önemlidir. Ancak, standart fiksasyon, hazırlık ve otomatik histoloji prosedürleri ideal değildir. Burada bir implant doğrudan bitişik retina sağlığı değerlendirmek için yeni prosedürler tarif. Retina protezleri göz dokusuna temas elektrod dizileri vardır. Önceki yöntemler mekansal dizi içinde tek tek elektrotlar bitişik oküler doku lokalize etmek mümkün olmamıştır. Buna ek olarak, standart histolojik işleme genellikle implante gözleri değerlendirilmesi retina tabakalarının brüt artefakt dekolmanı ile sonuçlanır. Sonuç olarak, implante edilmiş bir elektrot dizisi implantasyonu ve stimülasyon nedeniyle, mevcut ise, lokalize hasarı değerlendirmek için zor olmuştur. Bu nedenle, implante e bitişik oküler doku belirlenmesi ve lokalize için bir yöntem geliştirmiştirbir (renk kodlu) boya işaretleme düzeni kullanarak, ve biz artefakt retina dekolmanı en aza indirmek için bir göz fiksasyon tekniği modifiye lectrodes. Bu yöntem aynı zamanda bireysel elektrotlar ve bir implant belirli bölümlerine lokalizasyonu sağlayan sklera saydam hale. Son olarak, histopatolojik değerlendirmeler gücünü artırmak için bir eşleştirilmiş kontrol kullanılır. Özet olarak, bu yöntem implant göz retina hücre mimarisini güvenilir ve etkin ayrımcılık ve değerlendirme sağlar.

Şekil 4, Şekil 3 &#39;de gösterilen örnek bir kesim elde edilen temsili bir kesitini göstermektedir. Bölüm yukarıda tarif edilen protokollere göre, H &amp; E ile 5 um kalınlıkta ve lekeli de kesildi. Örnek şerit brüt şekli minimal diferansiyel doku eserler (Şekil 4A) ile korunur. Yeşil boya kırmızı (Şekil 4B) daha esnek olmasına rağmen her iki boya işaretleri, sklera üzerinde görünüyordu. Retina katmanları artifactually müstakil değildi ve retina morfolojisi (Şekil 4C) korunur. Dizideki elektrotların bulunduğu yere karşılık gelen boya işaretler bitişik, retina dokusu, kolayca tespit edilebilir. Şekil 5 doku bölümleri temsilcisi özel boyama ve immünhistokimyasal mevcut protokole göre hazırlanan gösterir. 5 captio bkz.özel lekeleri ve kullanımı yapılan değişiklikler hakkında daha fazla ayrıntı için n ve Yardımcı Malzemeler. Post-değişiklik, bu lekeleri ve immünhistokimya belirlenmiş standartlara eşitti - patolog tarafından doğrulanmadı gibi. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer antikor ve titre tipi (parantez içerisinde) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> Ikincil antikor ve titre tipi (parantez içerisinde) </td><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Alexa Fluor 488 </td></tr><tr><td> Ikincil antikor inkübasyon süresi </td><td> 1 saat </td><td> 2 saat </td><td> 45 dakika </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Antikor Tipi, Titre ve Etiketleme Süresi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> Şekil 1. Suprachoroidal Prototip Elektrod Dizisi. Bir klinik sınıf kalıp dizinin A) Makro fotoğraf. B) el yapımı klinik öncesi dizinin photomicrograph. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> Şekil 2. Eski Retina histolojisi. Standart histolojik yöntemler bu hazırlamak için kullanıldı, H &amp; E ile boyanmış, bir suprakoroidal elektrot dizisi ile implante edilen bir göz bölümleri. A) &#39;deki elektrot dizisinde, boşluğun (bir yıldız ile gösterilen) ile bir dik kesit. Retina dış göz dokusundan ayrılır. Bu implante bölgesi (ok) altında özellikle belirgindir. Bu dizinin her bir elektrot bitişik retina kısmının belirlemek mümkün değildir. Ölçek çubuğu = 1 mm. B) Masası&#39;ndaki kutulu bölgenin daha yüksek büyütme bir. Retina laye içinde, düzenli aralıklı, çeşitli eserler vardırRS (oklar) yanı sıra, tapetal katmanı (kedi gözü içinde yansıtıcı tabaka) dan büyük dekolmanı. Ölçek çubuğu = 100 mikron. C) paneli B kutulu bölgenin daha yüksek büyütme. Ok kopma olarak, in vivo ya da travma patolojisinde neden olmanın aksine, işleme bölgesinin yan etki, bir artefakt olduğunu düşündüren, fotoreseptör dış bölümler, hem de sağlam kalır pigmenter epitel olduğuna işaret etmektedir. Ölçek çubuğu = 20 mikron. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> Şekil 3,. Elektrot-Bitişik Doku. AD lokalizasyonu ve diseksiyonu) yerinde bir suprakoroidal elektrot dizi ile bir enükleasyon göz Yüksek dinamik aralık makro fotoğraf,. A) Mesaj Davidson&#39;un fiksatif ile sabit ve önce dizi kaldırılması, saydam sklera görselleştirme sağlardizi içinde özel elektrotlar (tek örnek ok ile gösterilen). B) elektrotlar önceden tanımlanmış bir boya renk ile işaretlenmiştir. C) anatomik düzenli aralıklarla Boya işaretler deneyler arasında tutarlılığı korumak için kullanılır. D) çıkarılması üzerine dizi, göz örnek şeritler halinde elle disseke edilir. Renkli oklar skleraya elektrot komşu bölgelerde iki göstermektedir. Sarı kesikli çizgi Kesit düzlemi gösterir. E) Panel E gelen agar-embed örnek şerit, köpük biyopsi yastıkları tarafından desteklenen kesip ve bir gömme kaset yerleştirilen bir agar bloğu. F içinde gömülü örnek şerit Makro-fotoğraf) Makro fotoğraf işlem sırasında bölümün hareketi en aza indirmek için. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> Şekil 4. Yeni Retina Histoloji. </s<html> trong&gt; elektrot cep içeren Yukarıdaki örnek şerit (Şekil 3 boyutlu), H &amp; E. A) Yeşil ve kırmızı boyalı bölgeleri (Şekil 3D aynı oklar, gösterilen) ile 5 mikron ve boyandı parafin, kesitli oldu görülebilir bir bölüm Şekil 3D sarı kesikli çizgi düzeyinde alınan. Ölçek çubuğu = 1,000 mikron. Retina dizi cep altında ne de uzaktan ne, müstakil değildir. B) Masası&#39;ndan kutulu bölge görünür kırmızı ve yeşil boya ile bir oklarla gösterilen ve sağlam retina boyunca. Ölçek çubuğu = 500 mikron. Yeşil boya bitişik sağlam, ekli, retina gösteren Panel B&#39;den C) kutulu bölge,. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Boya yerini bir elektrot olarak görev varsa, biz güvenle elektrik stimülasyonu neden, hasar komşu retina dokusunun değerlendirmek gösterir bilerek. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; her zaman &quot;&gt; <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> Şekil 5,. Özel lekeleri ve immun kullanılarak değiştirilebilir retina cytohistochemistry örnekleri. Olarak ana protokol metinde açıklanan standart formalin ile tespit yöntemleri, alışılmış boyama protokolleri için gerekli değişiklikler, aksine Davidson sabitleştirici, kullanımı. Patologlar bu değişiklikler eşdeğer boyama yol açtığını doğruladı. A) H &amp;e; pembe eozin leke hücre sitoplazma, kollajen ve destek doku çeşitli tonları. B) LFB lekeleri miyelin mavi cresyl menekşe counterstain mor hematoksilen lekeleri hücre çekirdekleri kullanılabilir iken ise . perikaryon mavi içinde Nissl organları boyama ve hücreleri çevreleyen uydu hücreleri vurgulayarak ganglion hücreleri belirlemek C) Masson trikrom mavi, Biebrich kırmızı-asit fuksin solüsyonu lekeleri kas fiyle kırmızı, anilin mavi lekeler kollajen, bu durumda sklera, mavi D) PAS ise,.. hematoksilen hücre çekirdekleri mor E) Perls &#39;Prusya mavisi counterstains ise bazal membran ve bağ dokusu bileşenleri glikoprotein bileşenleri, mor lekeli; nötr kırmızı leke renklerin yanı sıra kırmızı lizozomlar ise kanama yerinde, demir komplekslerinin bozulmuş kırmızı kan hücreleri ve açığa çıkan hemosiderin oluşumu bir mor renk üretir F) GS;. Müller hücrelerinde 13 fazlası Bu nörotransmitter aşağılayıcı enzim (yeşil .), iç nükleer tabaka ve iç sınırlayıcı membranı G), NF-200 oluşturan Müller hücre endfeet olarak Müller hücre yapıları ile her iki yönde uzanan görülebilir, bu ağır zincir iskelet proteini (yeşil) hücre soma ve işlemlerde bulunan , nöronlar 14,15 yapısını korumak için diğer nörofilament ile çapraz bağlar. Ganglionkedi retinada iç nükleer tabaka dış yatılı bulunan yatay hücrelerin aksonları sahip olmuştur hücreleri ve bunların aksonlar, ganglion hücre tabakası ve sinir lifi görülebilir. . DAPI (mavi) ile counterstaining retina katmanlarının görselleştirme H) GFAP sağlar, bu iskelet protein (kırmızı), gliozis 16 sırasında Müller hücreleri ve astrositlerde çoğaldı için iç ile ince uzantıları oluşturan Müller hücreleri ile sinir lifi tabakası astar görülebilir dış retina katmanları. DAPI ile counterstaining (mavi) retina tabakalarının görselleştirme sağlar. Tüm panellerde ölçek çubuğu = 50 mikron. Iç retina her görüntünün üst kısmında gösterilir; dış retina subscleral reaksiyon gösterir Panel E, hariç her görüntünün alt kısmında gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis at JoVE.com

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Bir retina uyarıcı içinde tek tek elektrotlar doğrudan bitişik retina hücre mimarisini görselleştirmek teknikleri.

Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

19.7K Görüntüleme.  Bionics Institute. Bir retina uyarıcı içinde tek tek elektrotlar doğrudan bitişik retina hücre mimarisini görselleştirmek teknikleri.

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Amiloid için Anterior Fat Pad FNA Sahne ve İşleme

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Tıp

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Yerel Gyrification Endeksi hesapla Adım Adım Öğretici: MR Görüntüleri Kortikal Katlama nasıl ölçülür

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Lokalize Histopatolojik Analiz için bir Retina Protez ile implant İşleme Teknikleri Gözler için: Bölüm Retina Tacks ile 2 Epiretinal İmplantlar

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Retina Hastalıkları Değerlendirilmesi Nicel Otofloresans

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Tavşanlarda Subretinal Cerrahi Adım Protokolle Bir Adım

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodoloji balgam indüksiyon ve laboratuvar için

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...