저자는 감사드립니다 : 양 알렉 손더스 씨와 미셸 McPhedran 실험 지원, 전극 제조를위한 양 헬렌 펭, 박사 페니 알렌 및 수술 지원 조나단 예오, 로얄 빅토리아 눈과 귀 병원의 생물의 직원 동물 케어 연구 센터;에 걸쳐 일반적인 지침에 대한 교수 롭 셰퍼드, 박사 브리오니 Nayagam 및 원고의 초안 양식에 중요한 주석 씨 로널드 양조위. 이 작품은 생체 공학 연구소와 세인트 빈센트 병원, 멜버른에서 수행되었다. 기금은 이안 포터 재단, 존 T 리드 자선 신탁 및 생체 공학 비전 호주 (BVA)에 슈퍼​​맨 비전 과학 기술 기금에서 특별한 연구 이니셔티브를 통해 호주 연구위원회에 의해 제공되었다. 생체 공학 연구소는 그것의 운영 인프라 지원 프로그램을 통해 빅토리아 정부로부터받은 지원을 인정합니다.

1. 안구 적출술 및 사후 고정 이 프로토콜은 피사체가 맥락막 상강 전극 배열을 일방적으로 이식 된 것으로 가정합니다. <ol><li> 유리 쇼트 병에 접미사 솔루션을 준비합니다. <ol class="lalpha"><li> 데이비슨의 정착액 솔루션 100 ml의 2 배 <ul><li> 포르말린 2 ㎖ (37 % 포름 알데히드) </li><li> 10 ㎖ 빙초산 (99.7 %) </li><li> 35 ML 에탄올 (98 %) </li><li> 53 ML 증류수 </li></ul></li><li> 50 % 에탄올 100 mL를 2 배 </li><li> 70 % 에탄올 100 mL를 2 배 </li></ol></li><li> Transcardially 따뜻함 제목을 붓는다 (37 ° C) 다음에 헤파린 생리 식염수 감기 (4 ° C) 중립 (10 %) 포르말린. </li><li> 두 눈의 윤부 (또는 맥락막 상강 배열에서 원격 위치)에서 봉합을 연결 - 직근에 맞춰, 랜드 마크 역할을 할 수 있습니다. </li><li> 명백히 눈, 이식 눈에서 외부 리드를 유지. </li><li> EAC를 놓고H 데이비슨의 정착액 솔루션 100 mL에 눈과 상온에서 사후 해결하기 위해 떠난다. </li><li> 18 후 - 70 % 에탄올 (실내 온도)에 마지막으로 다음 8 시간 - 데이비슨의 고정액에 36 시간, 6에서 50 % 에탄올 (실내 온도)로 전송. </li><li> 4에서 샘플을 냉동 해부까지 ° C 및 저장. </li></ol> 손상 및 가압 아이 글로브는 부정적인 결과 조직학에 영향을 미치지없이 3 개월이 방법에 저장되어있다. 2. 식별 및 조직 매핑 위의 고정 프로토콜 (단계 1) 공막 반투명 렌더링하고 배열을 지금 볼 수 있습니다 - 각 전극 위치 (그림 3)를 포함. <ol><li> 에탄올 이식 지구를 제거하고 조심스럽게 결막과 테 논낭 등의 과잉 조직을 멀리 트림. 3mm 길이 (그림 3A) - 2 시신경을 잘라. </li><li> 조직 학적 염색 markin를 사용하여G 계획, 미리 정의 된 색상 코드 레이블이 전극은 염료를 더럽되지 않도록주의. </li></ol><ul><li> 우리는 전문 조직 학적 염색의 시판 스위트 (부록 참조) 선택했습니다. 염료의 소량주의 깊게 조직에 뾰족한 페인트 브러시 (Roymac 크기 00)를 적용하여 최대 5 분까지에서 건조 할 수 있었다. </li><li> 다른 활성 전극 빨간색; 큰 직경의 반환 전극 황색; (했다)이었다 활성 전극 (들) 녹색 연구 기간 동안, suprathreshold 수준에서 최대한 자극 : 우리의 목적을 위해, 우리는 선택했다 추가 가이드 및 / 또는 해부학 거리 표시 (그림 3B 및 3C) 파란색. </li><li> 약간의 시행 착오가 후속 단계에 걸쳐 안정 염료를 발견해야 할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 4에, 그것은 녹색 염료 붉은 염료보다 더 탄력적이라고 ​​볼 수있다. 70 % 에탄올에 염료를 희석하여 지질 penet을 향상시킬 수배급 및 조직 코팅. </li><li> 그것은 나중에 참조 염색 지구를 스케치하거나 촬영하는 데 유용합니다. </li></ul><ol start="3"><li> 염료를 탈수 70 % 에탄올로 돌아갑니다. </li><li> unimplanted 제어 글로브 2.1 단계를 반복합니다. </li><li> 단계 1.3에서 봉합사를 사용하여 제어 눈과 미러링 쌍으로 이식 눈을 맞 춥니 다. </li><li> 임플란트 이식 배열 위치의 준비를 시각화 할 수 있도록 이식 눈 (NB 반투명 공막과 2.2 단계에서 염료 표시에 위치하고으로 컨트롤 눈에 미러 위치에 실리콘 템플릿 (전극 배열과 같은 크기로) 배치 ). </li><li> 각각의 이식 전극 사이트 해부학 비교 (즉, 미러가 상당 일치) 위치 제어 쌍을 수 있도록, 단계 통제 눈을위한 2.2 2.3를 수행합니다. </li></ol> 3. 해부 및 포함 <ol><li> 눈에서 임플란트 배열을 제거하고 눈의 앞쪽을 제거(각막, 홍채 렌즈 포함). 나머지 아이 컵 (후방 챔버)에서 유리체 액체를 제거합니다. </li><li> 여러 대표 스트립 (1 ~ 2 mm 두께) 염료 표시 영역 (그림 3D)의 하위 집합을 포함하는 각에 이식 눈을 해부하다. 스트립의 방향이 임플란트 7 조직 반응의 다양한 측면을 평가에 도움을 선택해야합니다. </li></ol> 그것은 염료 영역이 각 지구와의 상대적인 위치 (및 색상)에 존재하는의 기록을 만들기 위해 나중에 참조 할 수 있도록 유용합니다. <ol start="3"><li> 처음 마주 아래쪽 (그림 3E)를 절단 할면 -; 액화 한천의 얕은 수영장 (90 ° C 80 4 %)에 자사의 측면에 스트립을 놓습니다. </li><li> 일단 한천 설정 폼을 삽입합니다 (그림 3 층)에서 지원하는 조직 카세트에 시료와 장소 주위 인하했다. </li><li> 반복 제어의 눈에 대한 3.1-3.3 단계 - 탁ING 케어 거울 일치 스트립을 해부한다. </li><li> 표준 (야간 자동) 파라핀 가공 기술을 통해 모든 카세트를 처리합니다. </li><li> 처음 마주 아래​​쪽을 절단 할면 파라핀 처리 조직을 포함합니다. </li></ol> 4. 절단 및 염색 <ol><li> 2 단계와 3 단계에서 노트를 정기적으로 참조 5 μm의 섹션으로 파라핀 블록을 잘라. </li><li> 염색 각 지역에서 섹션을 수집하고 슬라이드에 장착합니다. </li></ol> 공막의 각 염색 현장 바로 옆 지역은 지금은 배열에서 해당 전극 (그림 4)에 가까운 근접 있다는 자신감과 함께 평가 될 수있다. <ol start="3"><li> 얼룩이나 원하는대로 면역을 수행합니다. 그림 5의 예를 들어 얼룩과 면역는 : H &amp;E; Luxol 빠른 블루 (LFB) 크레 실 바이올렛, 메이슨의 trichrome 블루, 주기적으로 산 쉬프 (PAS) Perls &#39;감청 역에서, 안티 - 글루타민 합성 효소 (GS), 안티 - 신경 미세 섬유 단백질 (NF), 안티 - 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 4 &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI). </li><li> 표준 및 특수 얼룩 자세한으로 수행 하였다 : <ol><li> H &amp; E 염색 라이카 multistainer 목욕 배열 ST5020 (라이카 생물계)에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행되었다. </li><li> LFB와 크레 실 바이올렛 (11에서 수정) <ol><li> 크실렌의 3 변화 (배 2 분)과 에탄올의 2 변경 (100 %, 100 %) (배 1 분)과 수돗물 (45 초)에 린스 Dewax. </li><li> 95 % 에탄올로 수화 섹션을 참조하십시오. </li><li> 37 LFB 솔루션 11 위 - 42 ° C (하룻밤). </li><li> 초과 70 % 에탄올로 얼룩을 씻어 낸다. </li><li> 증류수에 씻어. </li><li> 묽은 탄산 리튬의 장소 (8 %) (몇 초). </li><li> 70 % 에탄올 (몇 초)로 구분. </li><li> 증류수에 씻어. </li><li> 필요한 경우 B까지, 4.4.2.8 단계 4.4.2.6를 반복고는 ackground은 무색이다. </li><li> 37 ° C (10 분)에서 크레 실 바이올렛 아세테이트 작업 솔루션의 장소입니다. </li><li> 물로 세척하지 마십시오. </li><li> 절대 알코올의 3 변화 (1X 30 초, 2 배 20 초)과 크실렌의 3 변화 (1X 1 분 30 초, 2 배 1 분)에서 탈수. </li><li> DPX와 마운트와 coverslip을. </li></ol></li><li> 메이슨의 trichrome 블루 (11에서 수정) <ol><li> 4.4.2.1에 따라 Dewax. </li><li> 섹션 물 (2 분)을 가져옵니다. </li><li> Weigert의 철 haematoxylin (2 분)를 사용하여 핵을 얼룩. </li><li> 수돗물에 씻고 증류수에 씻어. </li><li> 비 에브리 히 주홍 산성 푹신 용액 (5 분)에 얼룩. </li><li> 증류수에 씻어. </li><li> 콜라겐 창백한 핑크 (6 분) 때까지 phosphomolybdic-phosphotungstic 산에서 차별화. </li><li> 증류수에 씻어. </li><li> 아닐린 블루 (1 분)에 Counterstain. </li><li> 1 % 아세트산 (1 분)에서 잘 씻으십시오. </li><li> P로 탈수, 마운트 및 coverslip에어 4.4.2.12 및 4.4.2.13. </li></ol></li><li> PAS (11에서 수정) <ol><li> 4.4.2.1에 따라 Dewax. </li><li> 1 % 정기 산 (15 분)에서 산화. </li><li> 물에 증류수를 실행에 씻으십시오. </li><li> 시프 시약 (15 분)에 얼룩. </li><li> 물 (5 분)에 씻으십시오. </li><li> 해리스 haematoxylin (1 분)에 Counterstain. </li><li> 수돗물에 잠시 씻으십시오. </li><li> 0.5 % 산성 알코올 (1 딥)에서 차별화. </li><li> 수돗물에서 잘 씻으십시오. </li><li> 스콧의 수돗물 (1 분) 블루. </li><li> 물에 잘 씻는다. </li><li> 4.4.2.12 및 4.4.2.13에 따라 마운트와 coverslip을 탈수. </li></ol></li><li> 11에 설명 된대로 Perls &#39;감청 얼룩. </li></ol></li><li> 면역 형광 염색 자세한으로 수행되었다 : <ol><li> 4.4.2.1에 따라 Dewax. </li><li> 증류수 (배 5 분)에 씻어. </li><li> ° C (20 분) 80-75시 0.01 % 구연산 버퍼, 산도 6을 사용 항원 검색을 수행D 0.01 %의 구연산 완충 용액 (20 분)에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 인산염 세척 섹션 식염수 (PBS)을 (2X 5 분) 버퍼. </li><li> 세척 완충 용액 (10 분)의 세포막을 Permeabilize. </li><li> 혈청 블록 솔루션 (2 시간)에 품어. </li><li> 항체 희석액에 희석 한 일차 항체 (10 % 정상 염소 serum/0.1 % 트리톤 X-100/PBS) (냉장고에 하룻밤)의 섹션을 품어. 사용 된 각 일차 항체의 역가가 표 1에 나타나있다. </li><li> 하룻밤 배양 한 후 세척 완충액 (배 3 분)로 섹션을 씻으십시오. 이 점에에서 어두운 부분을 유지합니다. </li><li> 특정 기간 (자세한 내용은 표 1 참조) 1:500의 역가에 해당하는 이차 항체의 섹션을 품어. </li><li> 세척 완충 용액 (배 5 분)의 섹션을 씻으십시오. </li><li> DAPI (1:25,000 / PBS) (30 분)의 섹션을 품어. </li><li> 세척 완충 용액 (배 5 분)의 섹션을 씻으십시오. </li><li> 마운트 및 coverslip에 형광을 사용하여NT 장착 매체. </li></ol></li></ol> 시험 시료 및 제어 샘플 쌍 비교를 위해 준비가되어 있습니다.

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Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li><li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs.">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li><li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wolff's anatomy of the eye and orbit. , (2001).</li><li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. 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저자는 공개 아무것도 없어.

임플란트의 안전성을 평가하는 임상 연구를위한 주요 고려 사항이다. 망막 보철물이 인간에 이식하기 전에 그것이 어떤 악영향을 미치지 않을 것이라는 점을 확인하는 것이 필수적입니다. 이 임플란트 생체 적합성 17-23뿐만 아니라 24-26 만성 전기 자극에 의해 발생 될 수있는 모든 잠재적 인 손상 모두에 대한 평가가 필요합니다. 이러한 인공 와우와 유사한 신경 보철, 경험은 자극의 넓은 범위 및 조직 손상 27가 발생하지 않습니다 물리적 매개 변수에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나 망막 다른 주입 사이트에 서로 다른 특성 때문에 정확한 안전 기준 (예 : 최대 충전 밀도 등) 다른 시스템에서 이전의 연구에서 가정 할 수 있습니다. 충전 밀도는 활성 전극 사이트에서 가장 높은이 손상에 대한 큰 잠재력과 일치합니다. 직접 인접 조직을 지역화 따라서 방법각 활성 전극에 크게 이러한 연구의 유용성을 증가시킬 것입니다. 임플란트의 특정 지역에 인접한 조직은 또한 가까운 검사에 강조 표시 할 수 있습니다. 이 타겟 접근 방식은 &quot;최악의 시나리오&quot;를 검토했다 유지 신뢰하는 동안, 분석 할 적은 부분​​을 허용합니다. 여기에 설명 된 공막 염색 지역화 방법은 광범위 손 모양과 성형 실리콘 / 백금 전극 배열을 28-30로 테스트되었습니다. 그것은 박막 폴리 아미드 배열 7,31 또한 박막 실리콘 / 태평양 표준시 배열을 32로 사용되었습니다. 일부 망막 보철 연구 intrascleral 착상 33과 &quot;총알 모양의&quot;전극을 채택했다. 본 기술은 전극 배열의이 유형을 평가하기위한 효과적이어야한다. 얇은 공막을 가진 고양이 눈 (극부 90 두께 - 200 ㎛) 배열의 각 전극의 시각화를 허용했다. 그러나 경우에도 개별 전기DES는 자신의 위치를​​ 쉽게 배열의 외곽선 (단계 2.6에서 사용되는 것과 유사한) 볼 수있는 실리콘 템플릿을 사용하여 추론 할 수있는 보이지 않았다. 염료 매핑 염료 현재 만 섹션을 얻을 수있다 비 관련 조직 섹션을 얻을 필요성을 제한합니다. 정확하게 전극의 위치를​​ 추론하는 능력은 관련 조직 병리학 적 분석과 큰 전력 통계 수 있지만, 노동 비용뿐만 아니라 사용되는 슬라이드와 블레이드의 양을 줄임으로써 시간과 비용 관리에 큰 영향을 가지고뿐만 아니라. 부착하고도 흠 조직 섹션에 표시되는 동안 조직의 처리를 견딜 수있는 염료의 사용이 중요한 초기 고려 사항이다. 해부에서 조직의 염료 방향 및 포함시 위치의 지식은 절단 과정을 지원합니다. 이 제대로 비스듬하게 절단되지 않은 부분을 달성하기 위해 블록을 배향 포함 전체 representati을 제공합니다조직의합니다. 그것은 절단을 수행하는 사람이 염료 응용 프로그램, 해부 및 포함시 존재한다는 것이 중요하다. 전체 프로토콜은 특히 고정 타이밍으로, 사소한 변경에 대한 강력한 것입니다. 그러나, 눈의 해부 및 염료 표시 단계는 좋은 손재주의 혜택은 시편의 손상을 방지 할 수있는 섬세한 과정이다. 데이비슨의 정착은 임플란트 주변 망막의 인공적인 분리를 줄이는 효과가 입증 동안, 그것은 해부 동안 직접적인 기계적 손상을 방지하지 않습니다. 데이비슨의 정착은 특별한 조직 학적 및 면역 절차와 쉽게 호환되지 않았습니다. 따라서 위에서 설명한대로 다음 단계를 수정 / 최적화 할 필요가 있었다. 최적의 결과를 얻을 때까지 염색 시간과 농도 증분 변경되었다 - 자세한 내용은 보충 자료를 참조하십시오. 망막의 정량조직학 문제가 남아있다. 망막은 비 균일하며 두께와 지역 centralis 34,35에서 거리 증가와 세포 밀도의 변화 모두. 따라서 이식 된 안구 내 주변의 조직은 비교를 위해 사용할 수 없으며 컨트롤 눈 대신 사용됩니다. 페어 제어 눈을 가진 각 섹션의 일치는 우리에게 병적 인 변화의보다 강력한 통계 비교를 제공, 대상 36 동료의 눈을 비교할 때 망막 보철에 효능과 안전성 결과는 더 나은 평가됩니다. 특별한주의는이 정량에 영향을 미칠 수로 경사 절단을 최소화하기 위해주의해야합니다. 요약하면, 방법은 크게 차례 더 효율적인 임상 워크 플로우하게되었다 우리의 조직​​ 병리학 적 분석, 개선 위에서 설명한. 이러한 방법을 사용하여 전임상 연구의 결과는 직접 3 RP 환자가 안전하게 suprachoroi에 이식되어있는 임상 시험을 주도DAL 망막 보철. 이러한 방법은 망막 자극 및 장기 이식에 대한 병적 인 반응을 평가해야 할 다른 안구 이식에 모두 적합하다. 이 방법은 임플란트에 대한 관심 영역에 병리의 cytoarchitecture 및 등록 유지를위한 가치있는 이점을 제공했다. 구체적으로 테스트되지는 않았지만, 이러한 절차의 수정은 배열이 피상적 이식, 특히 여기서 다른 종과 다른 해부학 적 위치에서 사용할 수 있습니다.

망막 보철는 곧 심각한 시력 상실의 다양한 형태의 치료에 유용한 임상 개입 될 수 있습니다. 일부 같은 색소 성 망막염과 같​​은 조건 (RP), 눈의 광 수용체의 광범위한 변성 결과, 이러한 신경 신호로 빛을 transducing에 대한 책임을 세포입니다. 그러나 망막의 다른 레이어에있는 일부 세포가 남아 망막 보철 1 전기 자극에 대한 잠재적 인 공격 대상입니다. 인간의 임상 실험에서 초기 결과는 전극 망막 2,3, 망막 4,5에 이식 배열, intrascleral 6 위치에 대한 약속되었다. 이러한 장치는 다른 모양과 다른 재료로 만든,하지만 그들은 모두 시각적 지각을 만들기 위해 망막의 잔여 가능한 뉴런을 활성화하기 위해 전기 펄스를 사용하고 있습니다. 우리의 넓은 그룹 (생체 공학 비전 호주) 진행이가 망막 임플란트를 개발했습니다맥락막 상강 전극 배열 (임상 시험 번호 : NCT01603576)와 이식 3 RP 환자와 임상 시험 연구에 나오지. 그림 1A이 맥락막 상강 프로토 타입 망막 보철물을 보여줍니다. 환자의 안전은 인체에 실험을 시작하기 전에, 우리는 (그림 1B) 전임상 모델에서 광범위한 급성 및 만성 테스트를 수행함으로써 임상 연구에서 가장 중요합니다. 조직 병리학 적 평가는 수술을 세분화 전극 디자인을 통해 반복하고, 궁극적으로 임플란트의 안전을 확립하는 것이 필수적이었다. 표준 임상 병리 관행이되었으며, 효율적인 워크 플로우를 유지하기 위해, 파라핀 임베딩 기술이 채택되었다. 그것은 또한 쉽게 병리학 자에 의해 해석되는 haematoxylin과 에오신 (H &amp; E)와 같은 임상 기준과 비교 염색 절차를 활용하는 것이 바람직했다. 우리는 또한 면역 조직 화학 분석에 적용 할 수있는 기술에를 원또한 조직의 세포 평가를 촉진하기 위하여. 임플란트 재료, 만성 전기 자극의 안전의 생체 적합성은 신중하게 평가해야합니다. 그것은 배열 내의 개별 자극 전극에 인접한 안구 조직의 조직 병리학을 검토 할 수있을 것이 중요합니다. 그러나 배열은 테스트 할 수 있도록 샘플을 처리하기 전에 제거 할 필요가, 그들의 금속 부품은 쉽게 단면 수 없습니다 때문입니다. 따라서, 우리의 설립 조직 준비 이식 전극 7에 대해 조직의 현지화 및 매핑을 허용하지 않았다. 조직의 지역화 방법의 부족뿐만 아니라, 표준 포름 알데히드 기반의 고정 및 처리 기술은 눈의 다양한 계층의 차등 수축률 (그림 2)에 망막 따라 광범위 유물과 분리습니다. t의 비 동질성으로 인해그는 망막, 그것은 특히 정량적 측정, 제어 조직에 유효한 비교를하기가 어렵습니다. 이 결합 제한은 우리의 이식 배열에 의한 손상의 정확한 평가를 복잡. 여기에서 우리는 이러한 한계를 극복하기위한 새로운 기술을 제시한다. 우리는 파라핀 기반의 조직학과의 호환성을 유지하기 위해 전문적인 눈을 고정 및 처리 기술 8-10을 수정했습니다. 우리는 임상 병리학의 의견에 따라 비교 결과를 제공하는 표준 조직 학적 및 면역 얼룩을 수정했습니다. 공막 조직 반투명 렌더링 한 후, 염료 기반 컬러 코드는 맥락막 상강 공간에서 배열을 제거하기 전에, 각 전극에 인접한 안구 조직을 표시하기 위해 사용되었다. 전극 배열과 각각의 전극 위치를 표시하여, 샘플을 정확하게 전극의 인접 지역에서 수집 할 수 있습니다. 일치하는 샘플은 일에서 수집 할 수전자 제어 눈 쌍 비교를 용이하게하기 위해합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

망막 보철의 최근 발전과 함께, 그것은 전임상 연구에서 이러한 장치의 안전성을 평가하기위한 신뢰성있는 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 하지만 표준 고정, 준비, 자동화 조직학 절차는 이상적인 없습니다. 여기에서 우리는 임플란트에 바로 인접한 망막의 상태를 평가하기위한 새로운 절차에 대해 설명합니다. 망막 보철 눈 조직에 접촉 전극 배열을 갖추고 있습니다. 이전 방법은 공간적으로 배열 내의 각 전극에 인접한 안구 조직을 지역화 할 수 없었다. 또한, 표준 조직 학적 처리는 종종 이식 눈을 평가 망막 층의 총 인공적인 분리의 결과. 따라서, 그것은 이식 된 전극 배열의 주입 자극에 의​​한, 존재하는 경우, 지역화 손상을 평가하기 어렵게되었습니다. 그러므로, 우리는 이식 전자에 인접한 안구 조직을 식별하고 지역화하는 방법을 개발(색상 코드) 염료 마킹 기법을 사용하여, 우리는 인공적인 망막 박리를 최소화하기 위해 눈을 고정 기법을 수정 lectrodes. 이 방법은 각각의 전극과 임플란트의 특정 부분의 국산화를 가능 공막 반투명 렌더링. 마지막으로, 우리는 조직 병리학 적 평가의 힘을 높이기 위해 대조군을 사용했다. 요약하자면,이 방법은 이식 눈 망막 cytoarchitecture의 안정적이고 효율적인 차별과 평가를 할 수 있습니다.

그림 4는 그림 3에 묘사 된 샘플을 절단에서 얻은 대표적인 섹션을 보여줍니다. 섹션은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 H &amp; E와 5 μm의 두께와 스테인드에서 절단되었다. 샘플 스트립의 총 모양은 최소 차동 조직 아티팩트 (그림 4A)로 유지됩니다. 녹색 염료 빨강 (그림 4B)보다 더 탄력 있었지만 모두 염료 표시는, 공막에 표시 하였다. 망막 층은 artifactually 분리되지 않은 및 망막 형태는 (그림 4C) 보존됩니다. 배열 전극의 위치에 해당하는 염료 표시에 인접한 망막 조직은 쉽게 식별 할 수 있습니다. 그림 5는 조직 섹션의 대표 특수 염색 및 면역 현재 프로토콜에 따라 제조이다. 5 오세영 그림을 참조하십시오특정 얼룩과 사용에 적용된 수정 사항에 대한 자세한 사항 n과 보충 자재. 수정 후,이 얼룩 및 면역 설립 기준에 해당했다 - 병리학 자에 의해 검증으로. <table border="1"><tbody><tr><td> 차 항체 역가의 유형 (괄호 안) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> 이차 항체 역가의 유형 (괄호 안) </td><td> 알렉사 플 루어 594 </td><td> 알렉사 플 루어 488 </td><td> 알렉사 플 루어 488 </td></tr><tr><td> 이차 항체의 배양 기간 </td><td> 1 시간 </td><td> 2 시간 </td><td> 45 분 </td></tr></tbody></table> 표 1. 항체 종류, 역가 및 라벨링 기간. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> 그림 1. SuprachoroIDAL 프로토 타입 전극 배열입니다. 임상 등급 성형 배열의) 매크로 사진. B) 수제 전임상 배열의 현미경 사진. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> 그림 2. 전 망막 조직학. 표준 조직 학적 방법은 다음을 준비하는 데 사용 된, H &amp; E 염색, 맥락막 상강 전극 배열을 이식 눈의 섹션을 참조하십시오.) 전극 배열 캐비티 (별에 의해 설명)를 통해 직교 섹션을 참조하십시오. 망막은 외부 안구 조직에서 분리된다. 이 이식 부위 (화살표) 아래에 특히 분명하다. 이 배열의 각 전극에 인접한했다 망막의 어떤 부분을 결정하는 것은 불가능하다. Scalebar = 1mm. B) 패널 박스 영역의 높은 배율. 망막 앙레에서 정기적으로 간격, 여러 가지 유물이 있습니다RS (화살표)뿐만 아니라, tapetal 층 (고양이 눈에서 반사 층)에서 주요 분리. Scalebar = 100 μm의. C) 패널 B에서 박스 영역의 높은 배율. 화살표 박리 등의 생체 외상이나 병리에 의해 발생되는 반대, 처리의 부작용 인공적인 것을 제안, 광 수용체의 외부 세그먼트뿐만 아니라, 그대로 남아있는 색소의 상피 세포를 지적했다. Scalebar는 = 20 μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> 그림 3. 전극 인접 조직. 광고의 현지화 및 해부) 현장에서 맥락막 상강 전극 배열 적출 눈의 높은 동적 범위 매크로 사진.) 포스트 데이비슨의 고정액으로 고정하고, 사전에 배열 제거에, 반투명 공막의 시각화를 가능하게배열의 각 전극 (한 예는 화살표로 표시). B) 전극은 미리 정의 된 염료 색으로 표시됩니다. C) 해부학 적 랜드 마크에서 일정한 간격으로 염료 표시는 실험에서 일관성을 유지하는 데 사용됩니다. D)이 제거되면 배열, 눈이 샘플 스트립에 손으로 해부한다. 색 화살표는 공막에 전극을 인접 사이트 중 두 가지를 나타냅니다. 노란색 점선 단면의 평면을 나타냅니다. E) 패널 E에서 한천 - 소스 샘플 스트립, 거품 생검 패드에서 지원 잘라 끼워 카세트에 배치의 한천 블록. F에 내장 된 샘플 스트립의 매크로 사진) 매크로 사진 처리하는 동안 섹션의 움직임을 최소화 할 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> 그림 4. 새로운 망막 조직학. </s<html> trong&gt; 전극 포켓을 포함하는 위의 예제 스트립 (그림 3D에서), H &amp; E.) 녹색과 빨간색 염색 한 지역 (그림 3D와 같은 화살표로 표시)와 5 μm의 스테인드에 파라핀 임베디드 단면이었습니다은에서 볼 수 있습니다 섹션은 그림 3 차원 노란 점선의 수준에서 찍은 사진. 스케일 바는 1,000 μm의. 망막 배열 포켓 아래도 원격으로도, 분리되지 않습니다. B) 패널에서 박스 영역 표시 빨간색과 녹색 염료로는 화살표로 표시하고, 그대로 망막에 걸쳐. 스케일 바는 = 500 μm의. 녹색 염료에 인접한 그대로, 첨부, 망막를 보여주는 패널 B에서 C) 박스형 지역. 스케일 바는 = 50 μm의. 염료의 위치가 전극의 위치에있는 경우, 우리는 자신있게 전기 자극에 의​​한, 손상 인접한 망막 조직을 평가할 수 있음을 나타냅니다 것을 알고. ve_content &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> 그림 5. 특별한 얼룩 및 면역을 사용하여 수정 망막 cytohistochemistry의 예.만큼 주요 프로토콜 텍스트에 설명 된 표준 포르말린 고정 기술, 일반적인 염색 프로토콜에 필요한 변경에 반대 데이비슨의 고정액의 사용. 병리학 이러한 수정은 해당 염색 결과 확인되었습니다.) H는 &amp;E; 핑크 에오신 얼룩 세포의 세포질, 콜라겐과 지원 조직의 다양한 음영이. B) LFB는 얼룩 수초 블루 크레 실 바이올렛 counterstain가에 보라색 haematoxylin 얼룩 세포 핵 사용할 수 있지만 동시에 . perikaryon 파란색에서 Nissl 시체를 염색하고 세포를 둘러싸고있는 위성 세포를 강조 신경절 세포를 식별 C) 메이슨의 trichrome 청색, 에브리 히 주홍 산성 푹신 솔루션 얼룩 근육 Fi를BERS 빨강, 아닐린 블루 얼룩은 콜라겐,이 경우 공막, 파란색 D) PAS 동안,.. haematoxylin 세포 핵 보라색 E) Perls &#39;감청을 counterstains 동안 지하 막과 결합 조직 성분의 당 단백질 구성 요소는 보라색 염색된다; 중립 붉은 얼룩 색상의 추가가 빨간색 리소좀 동안 출혈의 사이트에서 철 복합체의 저하 적혈구 및 릴리스 haemosiderin의 형성 보라색 색상을 생산 F) GS는;. 뮐러 세포가 13이되는 신경 전달 물질 분해 효소 (녹색 .), 내부 핵 계층과 내부 경계 막 G) NF-200를 형성 뮐러 세포 endfeet에서 뮐러 세포 기관으로 양쪽 방향으로 연장 볼 수 있습니다,이 무거운 사슬 골격 단백질 (녹색) 셀 소마와 프로세스에서 발견 뉴런 14,15의 구조를 유지하기 위해 다른 neurofilaments와 가교. 신경절고양이 망막의 내부 핵 계층의 외부 국경에있는 수평 세포의 축삭은 또한 강조하는 동안 세포와 그 축삭은 신경절 세포 레이어와 신경 섬유 층에서 볼 수 있습니다. . DAPI (파란색)와 Counterstaining은 망막 층의 시각화 H) GFAP 수 있습니다,이 세포 골격 단백질 (적색), gliosis 16시 뮐러 세포와 성상 세포의 증식에 내부를 통해가는 확장을 형성 뮐러 세포와 신경 섬유 층을 일렬로 볼 수 있습니다 바깥 쪽 망막 층. DAPI와 Counterstaining은 (파란색) 망막 층의 시각화 할 수 있습니다. 모든 패널의 스케일 바는 = 50 μm의. 안쪽 망막은 각 이미지의 상단에 표시되며 외부 망막 subscleral 반응을 보여 패널 E, 제외, 각 이미지의 하단에 표시됩니다.

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Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

망막 자극기 내의 개별 전극에 바로 인접한 망막 cytoarchitecture를 시각화하는 기술.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.7K 조회수.  Bionics Institute. 망막 자극기 내의 개별 전극에 바로 인접한 망막 cytoarchitecture를 시각화하는 기술.

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Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

아밀로이드에 대한 앞쪽에 지방 패드의 FNA 공연 및 처리

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

연구

의학

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

지역 Gyrification 인덱스를 계산하기위한 단계별 자습서 : MR 이미지에서 두피 접기를 측정하는 방법

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

망막 질환의 평가에 대한 정량적 안저 자기 형광

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

선 유도 및 실험실 방법론

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...