Bu çalışma Florida TL1 TR000066 ve UL1 TR000064, Ulusal Sağlık Enstitüsü, BD Biosciences reaktif hibe Veli Grant R01AI056152 bir çeşitlilik takviyesi Üniversitesi NIH / NCATS Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülleri ve Üniversite tarafından kısmen desteklenen Florida.

Tüm hayvan kullanımı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. 1.. Karışımları ve Medya hazırlanması <ol><li> Steril PBS pH 7.3 (1 L) 0.23 g NaH 2 PO 4 1.15 g Na 2 HPO 4 9.0 g NaCl DI su ile sesini alın. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> Hücre Kültürü Ortamı (100 mi) 89 ml RPMI 10 mi% 10 FBS 1 ml antibiyotik antimikotik (ABAM) 100 ug, 50 mM 2-merkaptoetanol (96.5 ug PBS&#39;ye 3,5 ug stok 2-merkaptoetanol) </li><li> , Steril PBS içinde FACS tampon (Floresan sokma Hücre Ayırma) (akış sitometrisi sırasında kullanılmak üzere)% 2 FBS </li><li> iTh17 Mix (numune sayısına dayanarak, tüm karışımları ve medya için gerekli hacmi belirlemek) 1.5 ug / ml anti-CD28 20 ng / ml IL-6 5 ng / mlTGF-β </li></ol> 2. Hücreler aşağıdaki koşullar altında, üç nüsha olarak Tabakta Olacak <ol><li> Anti-CD3 bağlı Plate, anti-CD28 (bu aktivasyon kontrol karışımıdır). </li><li> iTH17: levha anti-CD3 bağlı, anti-CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. Levha-bağlı anti-CD3 (10 ug / ml) Bu plaka bağlı anti-CD3 plakaların hazırlanması önce hücreler plakalardan eklenecek zaman için en az 4 saat yapılması önerilir. <ol><li> Kuyulara 30 ul anti-CD3 ekleme yeni bir 96 oyuklu U tabanlı bir Microtest doku kültür plakasının (anti-CD3, steril PBS içerisinde seyreltilmektedir) ve kuyu yeknesak bir şekilde kaplanmasını sağlamak için levhanın kenarlarını dokunun. Bu plaka karışımları ve hücreleri ekleme zamanı gelinceye kadar buzdolabında daha sonra 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve. </li></ol> 4. Fare Diseksiyon <ol><li> Bu protokol, C57BL / 6 mikrofon kullanımına dayanıre, 3-8 aylık, ve The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) satın alınmıştır. </li><li> CO 2 boğulma kullanarak fare Kurban ve sonraki servikal dislokasyon ile ölüm onaylayın. </li><li> % 70 etanol ile fareler diseksiyon araçları ve kesi alan sterilize ve diseksiyon başlamak. </li><li> Ventral görünümünde, üretral açılış anterior olan cildi kapmak ve çene alanı ulaşana kadar makas ile ventral orta hat kesmeye başlar. Önlemleri gözyaşı veya periton duvarı zarının içine kesmek için değil almak. </li><li> Ciltte geri çekin ve çıkarılması sırasında lenf düğümlerine rahat erişim sağlamak için aşağı pin. </li><li> Toplanan lenf düğümleri ve dalak tüm forseps ile çıkarılır, ve tampon (lenf bezi ve dalak kaldırma diyagramları için, Şekil 2 ve 3&#39;e bakınız) Miltenyi Biotec satın Running autoMACS 5 ml ihtiva eden steril bir Petri tabağına yerleştirilir. <ol><li> Olan aksiller lenf düğümleri kaldırmakHer fare göğüs kaslarının arkasında aksilla (koltuk altı) yanında bulundu. </li><li> Her aksillaya yakınında bulunan bağ dokularında bulunan brakiyal lenf düğümleri kaldırın. </li><li> Her bir fare boyun bulunan yüzeysel servikal lenf düğümleri çıkarın. </li><li> 3 kan damarlarının bağlantılı olarak kalça bölgesinde bulunan kasık lenf düğümleri çıkarın. </li><li> Periton zarının yukarı ventral orta hat kesti mezenterik lenf düğümleri, erişmek için. Mezenterik lenf düğümleri bağırsakları arada tutan bağ dokusu bulunur. Genellikle 4-8 düğümleri bir dizesinde bulunan ve bir &quot;inci string&quot; olarak görünebilir. Tüm dize çekin emin olun. </li><li> Dalak, mide ve bağırsakların arkasında, karın bölgesinde yer almaktadır. Pankreas çekerek ve ayırarak çıkarın. </li></ol></li><li> 2 buzlu mikroskop slaytlar kullanılarak steril bir başlık altında organlarını eziyet. Lenf düğümleri veya dalak üzerine yerleştirinparçalanmış kadar ikinci sürgünün buzlu tarafı ile bir mikroskop lamı, ve ovmak buzlu tarafı. Tüm lenf düğümleri ve dalak toprağa kadar tekrarlayın. </li></ol> Not: Kan zor autoMACS tamponunda kalan lenf düğümleri görmek için yapacak gibi, lenf düğümleri ile başlar ve dalak ile bitirmek için tavsiye edilir. <ol start="9"><li> Tek bir hücre süspansiyonu halinde öğütülmüş organları filtre etmek için, 40 um naylon bir parça üzerinde bir kaç kez katlanır ve bir 15 ml santrifüj tüpünün üst yerleştirilmesiyle başlar. Naylon malzeme kabaca 3 x 3 inç olmalıdır </li><li> Tampon ve toprak organları Koşu autoMACS içinde 5 ml aspire bir 5 ml şırınga ve 21 G iğne kullanın. Katlanmış naylon malzeme yavaşça koyun. Iğne ile malzemeyi delinmesiyle önlemek için özen gösterin. </li></ol> Not: tek bir hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, çözelti visib hiç sahip, açık ve tutarlı bir çözüm olarak görünmelidirkatı doku le adettir. Katı maddeler, yeniden aspire kalır ve yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne yerleştirilmiş naylon yeni bir katlanmış parça aracılığıyla dağıtım edin. <ol start="11"><li> Kullanılmadığı zaman her zaman buz üzerinde hücre tutmak. </li></ol> 5. Hücre Ayırma <ol><li> En iyi sonuçlar için, MACS CD4 + CD25 + düzenleyici T hücre izolasyon kiti, fareyi kullanarak autoMACS Pro Hücre Ayırıcı ile en az% 80 oranında saf CD4 + CD25-hücre popülasyonu edinin. CD4 + CD25-hücre popülasyonu negatif tutulması için protokol Miltenyi Biotec ile elde edilir. </li></ol> 6. Th17 Farklılaşma <ol><li> AutoMACS Pro hücre ayırıcı ile ayrıldıktan sonra CD4 + CD25-hücre popülasyonu toplayın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak, tripan mavisi ile 1:1000 oranında seyreltilmiş hücre sayımı. </li><li> Yoğunluğu hücre sayısı tespit edildikten sonra, hücre kültür ortamı içinde 1 x 10 6 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> 4 saat sonra anti-CD3 bağlı plaka ile 96 oyuklu plakalar çıkar. </li><li> PBS içinde 200 ul anti-CD3 kaplı kuyu yıkayın. 2 kez tekrarlayın. <ol><li> Yıkamak için anti-CD3 kaplı oyuklara steril PBS içinde 200 ul ekleyin ve bir atık kabı içine PBS çıkarın. </li></ol></li><li> Üç kopya halinde oyuklara iTh17 karışımı ya da aktivasyon kontrol karışımı, 100 ul (noktası # 2 ye bakınız) eklenir. </li><li> Her bir Th17 karışımı veya aktivasyon kontrol karışımı da altına yerleştirilebilir edildiği hücre 100 ul ekle. </li><li> En az 72 saat boyunca ya da 5 güne kadar inkübe hücreleri (Th17 farklılaşma 72 saat sonra ya da 5 gün sonra elde edilebilir.) </li><li> Th17 farklılaşma, hücre içi boyama ve akış sitometrik analizi, ELISA veya qPCR ile değerlendirilebilir </li></ol> 7. Hücre Aktivasyon (Sadece gerekli Intraselüler Boyama için) <ol><li> 72 saat ve 5 gün ya da sonunda, kuluçka 96 kuyucuğu çıkarmak <ol><li> Hatırlayın Th17 differentiation, 72 saat ya da 5 gün sonra ya da elde edilebilir. </li></ol></li><li> Her bir durum (ör. aktivasyon kontrol veya iTh17) için, 24 gözlü hücre kültür plakasının bir yuvası içine üç kopya halinde olan hücrelere transfer. 96 oyuklu U tabanlı bir kültür plakasında, üç kopya halinde olmanın aksine bir durum için hücreler artık, 24 delikli kültür plakasının bir yuvası içine toplanmış edilmiştir. </li><li> 24 yuvalı hücre kültürü plakasının her bir in toplam hacmi hemen 600 ul. Iyi hücre kültür ortamı ile 1 ml her bir hacmini kaldırın. </li><li> (1 uM) ve iyonomisin, PMA (phorbol myristate asetat) (50 ng / ml) ekleyin ve BFA (Brefeldin-A) (10 ug / ml) belirtilmiş olan konsantrasyonlarda 24 yuvalı hücre kültürü plakasının her bölmeye. </li><li> 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li></ol> 8. Hücre içi boyama <ol><li> Akış sitometrik analiz için arzu edilen hücre dışı ve hücre içi işaretleri ile Leke hücreleri. O varlığı tespit etmek içinf IL-17, hücre içi boyama anti-IL-17A antikorları ile yapılır. Tavsiye edilen hücre dışı bir yüzey belirteçleri, CD4, CD8, CD25 ve içerir. <ol><li> IL-17 Hücre içi boyama BD Bioscience&#39;den içi sitokin boyama Starter Kit-Mouse kullanın. </li><li> Her numune için, hücreler topak, süpernatant kaldırmak ve 200 ul FACS tampon maddesi (PBS içinde% 2 FBS) tekrar süspansiyon hücre topağı. </li><li> Plaka 96, hücre akış sitometresi için hücreler yeniden süspansiyon haline aktarın. </li><li> 1.200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca hücreleri aşağı Spin ve süpernatant atın. </li><li> 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca 200 ul PBS FACS tampon, santrifüj ekleyin ve supernatant atın. </li><li> FACS 100 ul tampon içinde süspanse hücreler ve hücre dışı bir antikor, 100 ul (Ab) karışımı (hücre dışı Ab kanşımı FACS tampon maddesi içinde yapılır) uygulanır. Folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 8.1.4 adımı tekrarlayın. </li><li> Adımı tekrarlayın 8.1.5 2x. </li><li> BD Cytofix / Cytoperm Tampon 100 ul hücreleri tekrar. Inkubasyonfolyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yedi. </li><li> 1x BD Perm / Wash tampon 100 ul, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. Tekrarlayın. </li><li> Hücre içi Ab karışımı 50 ul ekle. Folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin (hücre içi Ab karışımı 1x BD Perm / Wash içinde yapılır). </li><li> 8.1.10 adımı tekrarlayın. </li><li> BD Boyama Tampon 200 ul hücreleri tekrar. </li><li> 200 ul BD Boyama Buffer (son hacmi 400 ul) içeren tüplere sitometri akışına süspanse hücreleri yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın örnekleri okunacak hazır olana kadar. </li></ol></li></ol> 9. Akış Sitometrik Analizi <ol><li> Gate canlı hücre popülasyonu. </li><li> Canlı hücre popülasyonu, CD4 + CD8-nüfus kapısı. </li><li> CD4 + CD8-nüfus, IL-17A + nüfus kapısı. <ol><li> Daha önceki deney sonuçlarına göre, IL-17A + nüfusunun% 100 CD25 + olacaktır. </li></ol></li></ol> * Toplam mutlak hücre sayımları örnek triplicates havuzu sonra elde edildi ** CD4 + CD25 + IL-17A + hücrelerinin mutlak sayısı, canlı kapı yüzdesi ve soy spesifik işaretleyicileri, CD4, CD25 ve IL-17A taşıyan toplam hücrelerin yüzdesi ile hücrelerin toplam sayısı çarpılarak, olarak belirlendi akış sitometresi ile tespit edilmiştir. 10. QPCR ve ELISA <ol><li> Yer hücreler 5-10 dakika süreyle 13,000 rpm&#39;de bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne ve santrifüj akış sitometrik analiz için kullanılmaz. Santrifüj sonrasında hücre peleti bulunan hücreler QPCR analiz için kullanılacaktır. QPCR analiz PTC-200 Peltier termal döngü cihazı (Biorad) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </li><li> ELISA için santrifüj tüplerinden süpernatan toplamak. IL-17A ELISA antikor çifti TC11-18H10 (yakalama, katalog numarası 555068) kullanılarak gerçekleştirildi ve TC11-8h4 biotin (tespiti, katalog no 555067) BD Biosciences &#39;den satın alınmıştır. IL-17A ELISA standards eBioscience (katalog no: 14-8171-80) &#39;dan elde edilmiştir. </li><li> Yüzer maddelerin alınmasından sonra, (daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de RNA ekstre etme, cDNA sentezi ve QPCR veya deposu için hemen kullanılmalıdır) 175 ul lisis tamponu içinde RNA QPCR için kullanılmak üzere geri kalan hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. <ol><li> IL-17A ve aktin (house-keeping gen) için primer dizileri için Tablo II bakın </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chen, Z., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+ROR&#947;T:+transcriptional+regulation+of+Treg+and+Th17.">Foxp3 and ROR&#947;T: transcriptional regulation of Treg and Th17.</a> International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).</li><li>Cua, D. J., Sherlock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain.">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421, 742-748 (2003).</li><li>El-Behi, M., Rostami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+views+on+the+roles+of+Th17+and+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalitis.">Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).</li><li>Inaba, K., Kroide, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+memory+T+lymphocytes+isolated+from+the+mixed+leukocyte+reaction.">Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction.</a> Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).</li><li>L, I. v. a. n. o. v. F. r. u. t. o. s. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine.">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).</li><li>Jager, L. D., Dabelic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinase+Inhibitory+Region+of+SOCS-1+is+Sufficient+to+Inhibit+T+helper-17+Function+in+Experimental+Allergic+Encephalomyelitis.">The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis.</a> J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).</li><li>Kimura, A., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6:+regulator+of+Treg/Th17+balance.">IL-6: regulator of Treg/Th17 balance.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li><li>Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+transmitted+segmented+filamentous+bacteria+segregate+with+diabetes+protection+in+nonobese+diabetic+mice.">Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice.</a> PNAS. 108, 11548-11553 (2011).</li><li>Langrish, C. L., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).</li><li>Lau, K., Benitez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+1+diabetes+by+a+Lactobacillus+johnsonii+mediated+Th17+bias.">Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias.</a> J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).</li><li>Lee, Y., Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells.">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).</li><li>Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+regulatory+T+cells+in+mediating+and+restraining+inflammation.">Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation.</a> Cell. 140, 845-858 (2010).</li><li>O'Connor, W., Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protective+function+for+interleukin+17A+in+T+cell-mediated+intestinal+inflammation.">A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation.</a> Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).</li><li>Picca, C. C., Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TCR+specificity+in+CD4+CD25++regulatory+T+cell+selection.">Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection.</a> Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).</li><li>Shah, K., Lee, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disregulated+balance+of+Th17+and+Th1+cells+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 12, R53 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+Multiple+Sclerosis.">Immunology of Multiple Sclerosis.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).</li><li>Stockringer, B., Veldhoen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+function+of+Th17+T+cells.">Differentiation and function of Th17 T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGF&#946; in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24, 179-189 (2006).</li><li>Zou, Y., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+production+of+interleukin-17/interferon-&#947;+and+matrix+remodeling-associated+genes+in+experimental+Candida+albicans+keratitis.">Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-&#947; and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis.</a> Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).</li></ol>

Ilan etmek hiçbir açıklama.

Burada in vitro Th17 farklılaşma ulaşmak için protokol tanımlanmıştır. T farklılaşma insan patojenleri 13 etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için kritik olan Th17 alt kümesi içine lenfositler gibi Th17 farklılaşma çalışma önemlidir. Tersine, IL17 üretim otoimmün hastalık ilerlemesi 13 ile ilişkilendirilmiştir. Bu, bağışıklık düzenleme ve otoimmünitenin çok sayıda farklı kemirgen modelleri için uygulanabilir olarak Th17 farklılaşma gibi bir yönt...

CD4 + T lenfositler (T hücreleri), bulaşıcı mikroorganizmalara karşı bağışıklık sistemi aracılı savunma önemli bir rol oynamaktadır. Tersine, T-hücreleri, aynı zamanda iyice bu tip 1 diyabet, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkların başlaması ve ilerlemesi ile ilişkilidir. CD4 + T lenfositleri, T hücresi reseptörü kognat antijeni / majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II) molekülleri ile (TCR) etkileşimlerinin bir kombinasyonu ile aktif hale gelir ve B7.1/B7.2 ile CD28 reseptör etkileşimleri 15 ligandları. TCR ve CD28 uyarımı ko-stimülasyon sağlanmasına ek olarak, antijen sunan hücreler de bu şekilde belirli bir antijene T lenfosit yanıtı yönlendirme, T lenfosit farklılaşması durumunu belirleyen bir sitokin ortam sağlar. Farklı patojen / antijen sunan hücre etkileşimleri T eli odaklanmış farklı yollar aşağı lenfosit çarpık ayrı sitokin ortamları oluşturmak,başlatılması patojen ele almaktadır. Ne yazık ki, orijinal olarak, istila eden patojenlere ortadan kaldırmak için tasarlanmış T lenfosit efektör yolları, hatalı kendi dokularına 15 karşı yönlendirilebilir. Bu nedenle, her farklı CD4 + T hücre alt sitesini farklılaşması durumunun daha iyi anlaşılması patojenlerin ortadan kaldırılması ve kendini hoşgörü arasındaki dengeyi düzenleyen nasıl anlayışımız için çok önemlidir. Th1, Th2 ve indüklenebilir düzenleyici T hücresi farklılaşma yollarının ek olarak, naiv T lemfositleri aynı zamanda Th17 yolunun aşağı sitokinler tarafından tahrik edilebilir. Th1 hücreleri, hücre içi patojenlere mücadele ise, Th2 hücreleri, hücre-dışı patojenlerin uzaklaştırılması ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) enflamatuar tepkileri 1, 16, en aza indirmek, Th17 hücre dışı bakteri ve mantar yok edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Th17 hücreler genel olarak soy spesifik transkripsiyon faktörü ve IL RORγT üretim ifadesi ile gösterilirMakrofajlar ve nötrofiller 1, 7 aktivasyonunu teşvik-17A. Th17 hücreler çeşitli otoimmün hastalıklarda rol oynadığı ve bunların ilişkili kemirgen modelleri edilmiştir. Örneğin, IL-23 (Th17 fenotipi sürdürmek için gerekli olan) olduğu gösterilmiştir, ancak IL-12, deneysel otoimmün ensefalitte (EAE) &#39;de, merkezi suçlu olduğu, MS için kemirgen hastalık modeli. Bu, daha sonra IL-17 üretiminde azalma EAE önleme 2, 6, 17 ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri arterit ve sistemik lupus eritematosus (SLE) 10, 16 dahil olmak üzere diğer oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olmuştur. IL-23 p19 eksikliği olan - / - fareler Th17 hücrelerinin çok az sayıda olduğu gösterilmiştir ve EAE sadece gelişen karşı dirençli olan, ama aynı zamanda kollajen ile indüklenen artrit, romatoid artrit 10, 18 için bir model. Buna ek olarak, fare kıç IL-17A, nötralize edici antikor ile işleme tabier kollajen kaynaklı arterit başlangıcı da eklem hasarı 18 çözünürlüğe sahip olduğu bulunmuştur. Bu son araştırmalar aynı zamanda, Tip 1 diyabet 9, 11 ve bağırsak iltihabı 14 Th17 hücre koruyucu bir rol gösterildiği gibi otoimmün hastalık ilerlemesinde Th17 hücrelerinin rolünün, özelliği gerekmektedir unutulmamalıdır. Bu çalışmalar otoimmünitede Th17 farklılaşma önemini doğrulamaktadır. 1) tam olarak nasıl IL-6 Treg ve Th17 farklılaşma arasındaki dengeyi düzenleyen etmez ve 2) kesin mekanizmaları nelerdir: daha fazla araştırılması gereken en az iki kafa karıştırıcı soru vardır çünkü in vitro Th17 farklılaşma T hücre araştırmalarındaki gerekli bir yöntemdir IL-17 kaynaklı enflamatuvar hastalıkların arkasında? Bizim yöntem olup, C57BL / 6 fare dalak ve lenf düğümleri CD4 + CD25-T hücreleri kullanır. Şunu belirtmek önemlidir ki bir saf olmayan kullanılarak Th17 farklılaşmasını teşvik etmek mümkün olmasına rağmenNüfus, en az bir% 80 saf CD4 + CD25-T hücresi popülasyonu elde herhangi bir kirlenme ortadan endişe ve daha başarılı Th17 farklılaşma sonuçlar sağlar. Uygun Th17 farklılaşma elde etmek için, CD4 + CD25-T-hücreleri, sırasıyla, anti-CD3 ve anti-CD28, aktivasyon sinyalleri sağlamak, 1 ve 2 varlığında inkübe edilir, ve IL-6 ve TGF-β. IL-23 tek başına Th17 farklılaşma elde etmek için kullanılabilir olduğunu rapor edilmiş olmasına rağmen, bu daha sonra IL-23 Th17 hücre popülasyonunun istikrarı için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak, IL-6 ve TGF-β Th17 farklılaşması için gerekli olan 3, 18, ​​19. Murin çalışmalar, IL-23 reseptör IL-6 ve TGF-β 13, 18 ile uyarılmış sonra CD4 + T hücreleri üzerinde ifade olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri başarılı olduğu sürece, IL-6 ve TGF-β 18, 19 mevcut olduğu gibi IL-23 bloke edici antikorların varlığı gelişecektir. Bu nedenle, bu Th17 farklılaşma protokol atabaşarıyla Th17 farklılaşma ikna etmek için uygun koşullar Ides. Otoimmün hastalıklar 13 hedefleyen daha iyi terapötik maddelerin geliştirilmesi için fırsat sunmaktadır Th17 farklılaşması ve IL-17 üretimini altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması geliştirilmesi.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Polyestrene Petri Dish</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>0875713A</td>
 <td>60 mm x 15 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>autoMACS Running Buffer</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-091-221</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Premium Microscope Slides, Frosted</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>12-544-3</td>
 <td>3" x 1"1 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309632</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Corning 15 ml Centrifuge Tubes</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon 40 microns</td>
 <td>Miami Aquaculture</td>
 <td>Nylon 40/26</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtest tissue culture plate 96 well U bottom </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>35-3077</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Corning Costar 24 well cell culture plates</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CL3524</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Tubes 1.5 ml</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553057</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553294</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IL-6 Recombinant Protein</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>14-8061-62</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TGFbeta</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>240-B-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan blue solution 0.4 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>66H2364</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>558107</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Conjugated Anti-mouse CD25</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>E01155-516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>560820</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>51-2041AK (559311)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-091-221</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ABAM </td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>30-004-CI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Corning, Cellgro</td>
 <td>10-040-CM</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B 2-MercaptoEthanol</td>
 <td>MP Biomedical</td>
 <td>194834</td>
 <td>Hazardous</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Calcium Salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>13909-1ML</td>
 <td>Hazardous</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brefeldin A (BFA)</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>159027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Capture mAb </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555068</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Detection mAb </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555067</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Standard</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>14-8171-80</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IL-2 ELISA Kit</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMB Substrate Reagent Set </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>autoMACS Pro Cell Separator</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-092-545</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Napco series 8000 WJ CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td>
 <td>Biorad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation and th17 differentiation of na&iuml;ve cd4 t lymphocytes

Th17 hücreleri 17 (IL-17), interlökin üretmek için tespit edilmiştir T hücrelerinin bir alt kümesi ayrı olan ve Th1, Th2 ve düzenleyici T hücreleri dahil olmak üzere, diğer T hücre alt ikinci fonksiyon farklıdır. Th17 hücreler çok oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili çok istekli inflamatuar immün cevapların merkezi bir suçlu olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntemde biz C57BL / 6 farelerinin dalak ve lenf düğümleri T lenfositleri arındırmak ve kontrol ve Th17 uyaran ortamlarda saflaştırılmış CD4 + T hücrelerini teşvik eder. Th17 uyaran ortam anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları, IL-6 ve TGF-β varlığında uyarımı içerir. En az 72 saat süre ile inkübe edildikten sonra ve 37 ° C&#39;de en fazla beş gün boyunca, hücreler daha sonra sitometrisi, QPCR, ELISA ve akış boyunca IL-17 üretmek için yeteneği açısından analiz edilir. Th17 farklılaşmış CD4 + CD25-T hücreleri daha Th17 hücreleri otoimmün ve ev sahibi de başlangıcı ve ilerlemesinde oynadığı rolü aydınlatmak için kullanılabilirfense. Ayrıca, farklı kemirgen nakavt / hastalık modellerinde CD4 + CD25-lenfosit Th17 farklılaşma hücre kaderi plastisite anlamamıza katkıda bulunabilir.

Bu Th17 farklılaşma protokol dalak kaldırılması ve aksiller, brakiyal, mezenterik, servikal ve kasık lenf düğümleri ile başlar. Her yerlerinin bir gösterimi, Şekil 2 ve 3 de bulunabilir. Şekiller 1 ve 5 de bu protokolde tarif edilen yöntemlere görsel bir gösterimini sağlar. Bu Th17 protokol CD4 + CD25-T lenfosit nüfus farklılaşma üzerinde duruluyor. Bu autoMACS Pro Hücre ayırma havuza alınan toplam le...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Th17 Differentiation of NaÃ¯ve CD4 T Lymphocytes at JoVE.com

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

34.3K Görüntüleme.  The University of Florida.  Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar. 

Video: Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct functional subsets based on the cytokines they secreted: for example, IFN-&#947; for CD4 T helper 1 cells, IL-4 and IL-13 for CD4 T helper 2 cells, IL-21 for CD4 T follicular helper cells, and IL-17 for CD4 T helper 17 cells. Analysis of hepatitis B virus (HBV)-specific CD4 T cells based on cytokine secretion after HBV-derived peptides stimulation could provide information not only about the magnitude of HBV-specific CD4 T-cell response but also about the functional subsets of HBV-specific CD4 T cells. Novel approaches, such as transcriptomics and metabolomics analysis, could provide more detailed functional information about HBV-specific CD4 T cells. These approaches usually require isolation of viable HBV-specific CD4 T cells based on peptide-major histocompatibility complex-II multimers, while currently the information about HBV-specific CD4 T-cell epitopes is limited. Based on an HBV-derived peptide matrix, a method has been developed to evaluate HBV-specific CD4 T-cell responses and identify HBV-specific CD4 T-cell epitopes simultaneously using peripheral blood mononuclear cells samples from chronic HBV infection patients.

Based on a hepatitis B virus (HBV)-derived peptide matrix, HBV-specific CD4 T-cell responses could be evaluated in parallel with identification of HBV-specific CD4 T-cell epitopes.

Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

Akut LCMV Enfeksiyonunda Erken Foliküler Yardımcı T-Hücre Taahhüdünün Deşifre Edilmesi

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Yazar Gündemi: Akut LCMV Zorluklarında TFH Hücre Farklılaşmasının Yollarının Aydınlatılması

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Akut LCMV ile Enfekte Farelerde Virüse Özgü Foliküler Yardımcı CD4+ T Hücresinin Erken Farklılaşmasına Erişim

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

Methods Article

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma