Bu çalışma ARRA NSF MRI Aracı Geliştirme hibe # 0923179 FMF için tarafından desteklenmektedir. Biz doku kesit ile yardım için Aqua Asberry, Biyomühendislik için Parker H. Petit Enstitüsü ve Biosciences Histoloji Core Lab Koordinatörü, teşekkür ederim.

1. Kesit Doku <ol><li> Mağaza kesit için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda flaş dondurulmuş, bütün doku. </li><li> Doku örneği (30 dakika) kesit önce cryomicrotome içinde sıcaklığına getirin. -30 ° C&#39;ye bıçak ve örnek sıcaklığı ayarlayın </li><li> Bir kez doku, cımbız ile numune işleme, sıcaklığa ulaşıldığında ne beynin bir kısmında (yani beynin ön birincil öneme sahip ise, beynin arka monte yeterli montaj yüzey ilgilendiren bağlı olarak beynin ön ya da arka azalttı Chuck üzerinde). <ol><li> Sertleşene kadar merkezinde ayna için ~ 0.5 ml Optimal Kesme Sıcaklık Bileşik (OCT, Doku-Tek, Sakura) uygulayın ve, cımbız kullanarak, OCT yerinde örnek tutun. Bir kez Ekim tamamen numune tutucuya monte ayna, dondurulur. </li><li> Örnek monte etmek için kullanılan bir OCT az miktarda (OKT bir blok olarak numune montaj aksine olarak yaygın diğer histolojik yapılır tercih edilirnumunenin kontaminasyonu en aza indirmek için mantıksal işlemleri). OCT ile örnek kirlenmesi DESI ve iyon bastırma nedeniyle görüntüleme işlemi için zararlıdır. </li></ol></li><li> Kalınlığında 12-18 mikron MS görüntüleme aralığı için gerekli tipik doku bölümleri. Önerilen aralık dahilinde istenilen kalınlıkta Bölüm doku. Hafifçe bölümünde bir oda sıcaklık mikroskop cam slayt dokunarak her kesitli doku çözülme monte. Örnek monte edildikten sonra bu kimyasal dağılımları ve kompozisyonlar değişecek gibi, doku bölümünde dokunmamaya dikkatli olun. </li></ol> Not: Biz bir optimizasyon için bölüm ve görüntüleme için başka kullanarak, slayt başına iki bölümden montaj tavsiye ederiz. Bölümleri bir slayt kutusunda ° C derin dondurucuda -80 kadar acil görüntüleme, mağaza slaytlar için analiz için hazır değildir. Ise <ol start="5"><li> Saklanan bölümleri analiz ise, dondurucu slayt kaldırmak, hemen vakum desikatörde transfer ve izin ~ 15-20çözülme min. Uzun desikatörde numune bırakmak örnek kuru ve DESI etkinliğini azaltacaktır. O zaman çıkarına, ancak çözülmüş sonra DESI iyon kaynağının optimizasyonu doku örneği ile yapılacaktır, örnek çözme edildiği sırasında dönemin ekipman başlatma için ideal bir zaman olarak hizmet vermektedir. <ol><li> Çözücü desi olarak% 1 asetik asit ile asetonitril kullanarak, 5 ul / dakika &#39;lık bir akış oranı ile bir şırınga pompası açın. Daha düşük akış hızı DESI sprey ve etkin piksel boyutu etkisini nokta yan azaltır, ancak daha yüksek bir akış hızı yeterli duyarlılığı için gerekli olabilir. Bu nedenle akış oranı (tipik olarak 1-5 ul / dak) her bir uygulama ve istenen duyarlılık ve çözünürlüğü için optimize edilmelidir. Şırınga verilen akış hızında tam optimizasyon ve görüntüleme için yeterli solvent içerdiğinden emin olun. </li><li> Çözücü kaynak ucu dışarı damlayan göründüğünde, Gerilim ile azot nebulizing gazı açın160 psi örn. </li><li> 3.600 uygulayarak iyon kaynağına bağlı yüksek gerilim güç kaynağı açın V. </li></ol></li><li> Hareket sahnede slayt monte ve iyon kaynağı ve MS optimizasyonu başlar </li></ol> 2. DESI Optimizasyon <ol><li> Desi sistem kaynağı prob (bkz. Şekil 2), bir şırınga pompası ve bir çözücü ya da alternatif dağıtım sistemi, sıkıştırılmış azot, çeviri örnek sahne ve bağlama oluşur. Kütle spektrometresi uygun kütle aralığı ve ilgi analitler için ayarlanmış bir kez DESI kaynak optimizasyonu ile devam edin. <ol><li> Kaynak bileşenleri henüz açık değil varsa, yön bölümleri 1.5.1-3 bakın. </li><li> Bu bölümlerde ele değişkenler biyolojik dokuların görüntüleme için tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu değişkenler doku veya örneğin farklı tipleri için optimize edilmelidir. Alternatif çözücüler, akış hızı, nebulizing gaz basınçları ve gerilimleri Hü için bildirilmiştirBiyolojik dokuların ng. 16-18 </li></ol></li><li> Başlangıçta DESI kaynak cam slayt dokunmadan değil, ve doku bölümün herhangi bir parçası yönelik olmadığından emin olun. Bu prob ilk optimizasyon sürecinde zarar görmemesi ve doku örneği ile temas tarafından ayarlanan herhangi bir kısmını kirletmeyin sağlayacaktır. <ol><li> İyi bir başlangıç ​​pozisyonu 55 arasında bir açıda, prob ile ucu örnek yüzeyden 3 mm ve MS kılcal giriş ila 5 mm arasında, ° numune yüzeyi ile ilgili ile. DESI prob iç kılcal dış kılcal ötesinde ~ 1 mm uzanmalıdır. Bütün bu parametreler optimize edilecektir. </li></ol></li><li> Kılcal MS arayüzü iyonların uygun transferini numune yüzeyi ile ilgili olarak ~ 15 ° &#39;lik bir toplama açıda olmalıdır. Kılcal mümkün olduğunca yakın, yüzeyden &lt;1 mm olmalıdır; numune yüzeyi üzerinde MS kılcal gezinen böylece sahne yüksekliğini ayarlayındokunmadan. </li><li> Doğrudan doğrultusunda böylece MS kılcal giriş ile ilgili olarak x boyutta DESI prob aynı hizaya getirin. </li><li> Ekstra doku bölümünü kullanarak optimum hassasiyet için DESI kaynağının y ve z konumları ayarlayın. DESI prob bir örnek alan yönelik olarak, sonunda dezorbe ve bu ortaya çıkar gibi o bölgede ve sinyal analitlerin tüm giderek azalacak iyonize unutmayın. Bu adım olarak kısa sürede yapılması önemlidir. <ol><li> Bu nedenle, optimizasyon işlemi boyunca, örneğin taze numune sinyalindeki değişiklikler kaynak optimizasyonu değil, örnek tükenmesi nedeniyle olduğu analiz edilirken sağlamak için sprey kafası altında hareket ettirilmesi gereklidir. Ancak, doku farklı bölgelerin çeşitli kimyasal bileşimi, tüm doku kesiti iyon yoğunluğu doğrudan bir karşılaştırma tamamen doğru olmadığını düşünüyor. Beynin talamus ile oldukça büyük boyutlu alanı sağlardaha tutarlı kimyasal bileşimi, ama yine de mükemmel bir üniforma değil. Alternatif olarak, boya rodamin içeren kırmızı Sharpie, işaretleme 6G ([M] +, m / z 443), uzak örnek bir cam slayt DESI ile güçlü MS yanıtı sağlar ve aynı zamanda optimizasyonu için kullanılabilir, ancak Farklı örnek form ve analit verilen, bu koşullar hala biyolojik dokular için set-up ideal için ilişkili olmayabilir. </li><li> Kaynak ucu ve kılcal girişi arasındaki Önerilen y ayırma: ~ 4 mm, uç ve örnek yüzeyi arasındaki tavsiye z ayırma: ~ 1.5 mm. Bu parametrelerin her deneysel set-up için biraz daha farklı olacak olsa. </li><li> Probun geometrisi ve açısı göz önüne alındığında, y ve z-boyut pozisyonları solvent ve analit içeren damlacıkların etkin iletim göre birbiriyle ilişkili olduğunu göz önünde. Tek değişkenli bir değişiklik aynı çarpma etkisi konumunu korumak ve diğer bir sonraki değişiklik gerektirecektirkendi iletim açılar. </li></ol></li><li> Mesafe maksimum hassasiyet ve minimal etkisi spot büyüklüğü için kaynak dış kılcal gelen iç kılcal extrudes ayarlayın. Dikkat: Bu ayarı yaparken yüksek gerilim KAPALI olduğundan emin olun. </li><li> Maksimum sinyal gözlenir, kaynak geometri uygun kabul edilecektir. <ol><li> Bölümlerde 2.5-2.6 optimize değişkenleri birbiri ile ilişkilidir, bu nedenle birinin ayarlama doğal olarak diğerinin yeniden ayar bölümde ele gerekli kaynak-örnek-giriş geometrisi, ya da koşulların ayarlama 1.5.1 korumak için gerektirir 3. </li></ol></li><li> Ayrıca, kütle spektrometresi ile kılcal transfer çevreleyen bir ısıtma elemanı iyonizasyon işlemi sırasında üretilen şarj analit damlacıkları desolvation kolaylaştırarak duyarlılığını artırmak olabilir. Burada bir ip ısıtıcı kullanmak transferi etrafında sarılmış 100 ° C ayarlı kılcal </li></ol> 3. TissuE Görüntüleme <ol><li> Görüntüleme işlemi sırasında, örnek aşamasında kılcal desi prob ve MS girişi altındaki numune hareket eder ve diğer tüm bileşenler sabit kalır. Sahnenin hareket parametreleri DESI etkisi tüy boyutu ve optimal duyarlılık dayalı seçilmelidir. <ol><li> Daha büyük bir etki tüy ancak görüntüleme için, aynı zamanda daha büyük bir piksel boyutu ve böylece kötü bir görüntü çözünürlüğü neden olur, daha fazla örnek desorbe olan göz önüne alındığında, daha yüksek bir iyon yoğunluğu ile sonuçlanacaktır. </li></ol></li><li> Bu deneyde kullanılan çeviri aşamasında olan ev inşa edilmiş ve verilen boyutları bir görüntü için hız ve satır aralığı rastering kontrolü için izin veren bir LabView programı tarafından kontrol. Bu deneyde kullanılan sahne hareket kontrolü VI omnispect.bme.gatech.edu mevcuttur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen DESI kaynağı ve aşama, Prosolia Inc 2B otomatik Omni Sprey kaynağı (Indianapolis, ABD) olarak kullanılabilir. <ol><li> Beyin dokuları için birTipik bir görüntü boyutu 10 x 15 mm ve kullanılan sahne hareketi parametreleri göz önüne alındığında, görüntü yaklaşık 3 saat sürer. <ol><li> Program LabView VI veya istenen görüntüleme koşulları için eşdeğer kontrol yazılımı, bir sahne tarama 80 mikron hızı / sn ve 200 mikron sıraları arasında satır aralığı kullanarak. Omni Sprey kaynak kullanırken, hareket parametreleri 100-200 mm / sn tarama hızı ve 200 mikron bir satır aralığı için ayarlanmalıdır. Bu hareketi parametreleri her boyut ve gerekli hassasiyeti istenen piksel sayısına bağlı olarak değiştirilebilir unutmayın. <ol><li> Daha küçük bir satır aralığı tarama hızı etkisi daha az olan ile, görüntü kalitesini artırmak için gösterilmiştir. 25 Ancak, bu mutlaka işaret ve gelişmiş görüntü çözünürlüğü değildir dikkat etmek önemlidir bu kadar etkisi noktada güçlü bağlıdır boyutu. Daha yavaş bir tarama hızı ve daha küçük satır aralığı önemli ölçüde analiz süresi artacak ve bu nedenle optimizasyon olmalıdırdoku ya da örneğin her türü için zed. </li></ol></li><li> Satır aralığı y boyutta piksel boyutunu belirler ise MS spektral satın alma 1 set ile tarama / sn ve 1 piksel / tarama olarak oluşturulan görüntü, sahne hızı, x boyutta piksel boyutunu tanımlar. Resmin gerçek bir piksel boyutuna yayılan püskürtülmesi nedeniyle daha büyük olmasına rağmen, daha yavaş hareket desorpsiyon ve analitlerin saptanması için daha fazla zaman sağlar. </li></ol></li><li> Dizin yolunu ve LabView VI içindeki görüntüleri sırasında kaydedilecek konum ve zaman dosyalar için dosya adı verin. </li></ol></li><li> Kütle spektral veri toplama için hazırlık, görüntüleme için gereken toplam zamanı hesaplamak. Grubumuz tarafından kullanılan Labview programı otomatik olarak bu değer sağlar, ama alternatif katı kontrolü kullanılırsa, bu hesaplama MS veri toplama ayarları için gereklidir. <ol><li> Bir Omni Sprey otomatik kaynak ve sahne kullanırken, resmin her satırı olarak elde edilirMünferit çalışır. Zaman-başına-line ve verilen görüntüleme boyutları için gerekli satır sayısı kütle spektrometresi yazılımı içine girilmesi için Omni Sprey kontrol yazılımı kullanılarak hesaplanmıştır. </li></ol></li><li> Kütle spektrometresi tarama hızı 1 spektrumu / sn olduğundan emin olun, ve hesaplanan toplam süre maç için araç satın alma saati ayarlayın. <ol><li> Spektral tarama hızı 1 spektrum / sn olarak ayarlayın. </li><li> PROFİLİ modunda veri kazanmak ve m / z aralığı ilgi türler için uygun olduğundan emin olun. Bu DESI da ESI olduğu gibi, çarpma ücret analitleri üretir unutmayın. </li><li> LabView tarafından verilen toplam resim zaman maç için satın alma saati ayarlayın. </li></ol></li><li> Görüntülü alanın üst sol çarpma etkisi nokta yerleştirin. </li><li> Aynı anda MS veri ve sahne hareket satın başlayın. </li><li> Veri toplama sonucu üzerine STANDBY moduna kütle spektrometresi dönmek. </li><li> DESI kaynağının yüksek gerilim kapatın. </li><li> O çevirinff azot gazı. </li><li> Şırınga pompası kapatın. </li></ol> 4. Görüntü İşleme <ol><li> Toplu spektral veri, evre süresi ve LabView ile metin dosyaları olarak kaydedilir konum verileri ile birlikte gelen spektrumları ile piksel koordinatları ilişkilendirerek bir 2D görüntü içine &quot;katlanmış&quot; olmalıdır. Omnispect.bme.gatech.edu: Burada sunulan görüntüleri serbestçe kullanılabilir Matlab tabanlı yazılım kullanılarak işlendi. Veri Omni Sprey kaynak kullanılarak elde edilir ise, Firefly veri dönüştürme yazılımı BioMAP (www.maldi-msi.org) görüntü görselleştirme için veri küp oluşturmak için kullanılır. </li><li> Jeol AccuTOF kütle spektrometresi ile elde edilen veriler için, kaydedilen kromatogram daha fazla analiz için. ED formatında ihraç edilmelidir. <ol><li> MassCenter içinde Data Manager kullanarak, ilk centroided veri (Araçlar → Geometrik için Toplama Veri dönüştürme) için elde verileri dönüştürmek. Daha sonra klavye kombinasyonu Ctrl + Shift + E fol kullanarak. ED biçimde veri ihracatAraçlar → İhracat ile onun ardından. </li></ol></li><li> OmniSpect web sitesine ham. ED kütle spektral veri ve iki metin dosyaları, konum ve zaman, yükleyin. Firefly işlenmiş görüntüleme verileri BioMAP olarak görüntülenebilir. <ol><li> Sigara Negatif Matrix çarpanlara tarafından istatistiksel analiz de dahil olmak üzere ya da ilgi tek bir iyon komplo verilerin işlenmesi doğrudan web sitesinde yapılabilir. </li><li> Alternatif olarak, ham veri küp Matlab analiz için ihraç edilebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Biological+Samples:+Localization+of+Peptides+and+Proteins+Using+MALDI-TOF+MS.">Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Pacholski, M. L., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+Mass+Spectrometry.">Imaging with Mass Spectrometry.</a> Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).</li><li>Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Imaging+at+Atmospheric+Pressure+Using+Desorption+Electrospray+Ionization+(DESI)+Mass+Spectrometry.">Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).</li><li>Nemes, P., Laser Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure,+in+Vivo,+and+Imaging+Mass+Spectrometry.">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric-pressure+Molecular+Imaging+of+Biological+Tissues+and+Biofilms+by+LAESI+Mass+Spectrometry.">Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).</li><li>Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -. N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+microjunction+surface+sampling+probe+electrospray+mass+spectrometry+for+detection+of+drugs+and+metabolites+in+thin+tissue+sections.">Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections.</a> J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).</li><li>Tak&#225;ts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Sampling+Under+Ambient+Conditions+with+Desorption+Electrospray+Ionization.">Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization.</a> Science. 306, 471-473 (2004).</li><li>Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Dynamics+and+Ionization+Mechanisms+in+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).</li><li>Costa, A. B., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+atmospheric+transport+and+droplet-thin+film+collisions+in+desorption+electrospray+ionization.">Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization.</a> Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).</li><li>Costa, A. B., Graham Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+splashes:+Elucidating+the+mechanism+of+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).</li><li>Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+Mechanism+of+Electrospray+Ionization.">Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization.</a> Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).</li><li>Kebarle, P., Verkerk, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray:+From+ions+in+solution+to+ions+in+the+gas+phase,+what+we+know+now.">Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now.</a> Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).</li><li>Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+electrospray+solvent+composition+on+desorption+electrospray+ionisation+(DESI)+efficiency+and+spatial+resolution.">The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution.</a> Analyst. 135, 731-737 (2010).</li><li>Van Berkel, G. J., Kertesz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Sampling+and+Imaging+of+Analytes+Separated+on+Thin-Layer+Chromatography+Plates+Using+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).</li><li>Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+and+other+ambient+ionization+methods:+current+progress+and+preview.">Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview.</a> Analyst. 135, 669-681 (2010).</li><li>Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+for+lipid+characterization+and+biological+tissue+imaging.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).</li><li>Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+adrenal+gland+by+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 28-32 (2010).</li><li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry:+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).</li><li>Eberlin, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classifying+Human+Brain+Tumors+by+Lipid+Imaging+with+Mass+Spectrometry.">Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry.</a> Cancer Res. 72, 645-654 (2012).</li><li>Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+by+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).</li><li>Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-Layer+Chromatography+and+Mass+Spectrometry+Coupled+Using+Desorption+Electrospray+Ionization.">Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization.</a> Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).</li><li>Lane, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+reveals+surface-mediated+antifungal+chemical+defense+of+a+tropical+seaweed.">Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).</li><li>Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+and+Surface+Alignment+Considerations+in+Chemical+Imaging+with+Desorption+Electrospray+Mass+Spectrometry.">Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).</li><li>Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+imaging+resolution+in+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).</li><li>Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spatial+resolution+in+the+imaging+of+biological+tissue+using+desorption+electrospray+ionization.">Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).</li><li>Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level,+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry.">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).</li><li>Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+quality+in+tissue+analysis+using+desorption+electrospray+ionization.">Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).</li><li>Jackson, S. N., Wang, H. -. Y. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Profiling+of+Lipid+Distribution+in+Brain+Tissue+Using+MALDI-TOFMS.">Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS.</a> Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).</li><li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ion+mobility-TOFMS+imaging+of+lipids+in+rat+brain+tissue.">MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue.</a> J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).</li><li>Wang, H. -. Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimalist+approach+to+MALDI+imaging+of+glycerophospholipids+and+sphingolipids+in+rat+brain+sections.">A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections.</a> Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).</li><li>Wu, B., Becker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+elements+and+molecules+in+biological+tissues+and+cells+in+the+low-micrometer+and+nanometer+range.">Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range.</a> Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).</li><li>Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Vizualization+of+Mouse+Brain+by+Lipid+Analysis+Using+Ambient+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).</li><li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Imaging+by+Mass+Spectrometry:+A+New+Frontier.">3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier.</a> Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Pulfer, M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+mass+spectrometry+of+phospholipids.">Electrospray mass spectrometry of phospholipids.</a> Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).</li><li>Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalogen+deficiency+in+early+Alzheimer's+disease+subjects+and+in+animal+models:+molecular+characterization+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).</li><li>Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+levels+are+altered+in+down+syndrome+brain.">Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain.</a> Brain Res. 867, 9-18 (2000).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Myocardial+Cardiolipin+Content+and+Composition+Occur+at+the+Very+Earliest+Stages+of+Diabetes:+A+Shotgun+Lipidomics+Study.">Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study.</a> Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

DESI kaynak geometri optimizasyonu başarılı MSI deneyler için önemlidir. Sistemin uyum katkıda birden çok değişken doğrudan hassasiyet ve görüntü çözünürlüğü etkiler. Optimizasyon sırasında, deneyci sinyal elde zorluklar varsa, bir kriter olarak slayt çizilmiş kırmızı Sharpie nokta kullanmanızı öneririz, boya, rodamin 6G, m / z 443, pozitif iyon modunda güçlü bir sinyal üretir ve kullanılabilir ilk optimizasyon. Analit iletim ve iyonizasyon oluşan ince bir film haline yüzeyinden anal...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50575" target="_parent">Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry</a>. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:
Rachel V. Bennett
instead of:
Rachel V. Bennet

Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Kütle spektrometresi tarafından hedefsiz görüntüleme keşif ve hipotez üreten uygulamalar için kimyasal bilgi edinimi kolaylaştırır. Öte yandan, bir ilgi, bilinen kimyasal hedeflenen görüntüleme, özel yöntem geliştirilmesi yoluyla artan bir hassasiyet ve seçiciliğin kolaylaştırabilir. Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) en çok MALDI, 1 sekonder iyon kütle spektrometresi (SIMS), 2 ve desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI), 3 lazerle-elektrosprey iyonizasyon (LAESI), 4 de dahil olmak üzere, ortam iyonizasyon teknikleri kullanarak dokular üzerinde gerçekleştirilir 5 ve MALDI ve SIMS sıvı mikro-kavşak-yüzey ölçüm probu (LMJ-SSP). 6, örnekleri fiziksel olarak numune kaldırılacak var ve yüksek vakum altında analiz olarak, düz ve ince olmak zorunda. MALDI örnek hazırlama için ek ve hantal bir adım ekleyerek, bir radyasyon emici bir matris olan numunenin kaplama gerektirir. SIMSen yüksek yanal çözünürlüğe sahip, ama son derece enerjik parçacıklar ile bombardımanı kapsamlı moleküler parçalanma neden olur. Minimum numune hazırlama ile yumuşak analizi istendiği Bu nedenle, ortam yöntemlerle MSI bir niş doldurun. Ancak, bugüne kadar, tüm yöntemleri hala düz örnek yüzeylerin ihtiyacı ile sınırlıdır. DESI analit dezorbe ve iyonize için örnek yüzeyinde yönelik bir pnömatik destekli ücret çözücü sprey kullanır. 7 DESI tarafından desorpsiyon ve sonraki iyonlaşma için çalışma modeli &quot;pick-up modeli damlacık&quot; olarak bilinir. 8-10 ücret birincil damlacıkları desi prob tarafından üretilen ıslatma ve analit, bir katı-sıvı mikroekstraksiyonu mekanizması ile yüzeyden çıkarılan malzeme içeren ikincil damlacıklarının momentum transferi ve kalkış 8 sonraki damlacık çarpışma sonucu çözünmüş olduğu ince bir film oluşturucu, yüzey ile çarpışır . 9,10 Sonuçta, gazfaz iyonları ancak DESI en hassas iyon oluşum sürecini deneysel kanıtlanmış olması henüz iyon buharlaşma, ücret kalıntı modelleri ya da diğer modelleri, 11 sonrasında ESI benzeri süreçlerle üretilen olduğuna inanılmaktadır. 12 DESI duyarlılık çözünürlüğüne bağlı güçlü bağlıdır Sprey çözücü içinde, analit, desorpsiyon olarak lokalize microextractiondur dayanır. 13 Bir yazılım kontrollü numune aşamasında birlikte kullanıldığında, örnek şeritli DESI iyonizasyon probu altında adım ile tek yönlü taranır, ve zaman tanım ile, m / z bilgi kimyasal türlerin mekansal dağılımı (Şekil 1) ile ilişkilidir. 2006 yılında Van Berkel ve Kertesz tarafından bildirilen ilke DESI-MSI deney ilk kanıtı bu yana, 14 teknik lipid analizi, 3,16 ilaç metabolitleri, 17,18 disea rapor uygulamaları ile, önemli ölçüde 15 olgunlaştıse biyolojik, 19 beyin dokusu, 3,18,20 akciğer dokusu, 18 böbrek doku, 18 testis dokusu, 18 böbreküstü bezleri, 17 ince tabaka kromatografisi plakalar, 21 ve yosun yüzeyler. DESI-MSI ile elde edilen görüntülerin 22 rutin çözünürlük sonuçta sprey tarafından çıkarılan etkin yüzey alanı tarafından belirlenir, ancak 40 mikron gibi düşük çözünürlüklerde bildirilmiştir 100-200 mikron,. 23-25 ​​Bu kararname ve analiz kolaylığı hızlı ve basit bir analiz için uygun DESI-MSI yapar değerli mekansal bilgi edinimi daha iyi biyolojik süreçleri 26 anlamanıza olanak 0.5-5 cm 2 aralığında yüzey alanları ile biyolojik doku örneklerinin. Burada, tipik bir DESI-MSI uygulama örneği olarak, biz sıçan beyin dokularında lipid görüntüleme içeren başarılı bir deney yapma usul ayrıntıları gözden geçirin. Protokolde iki en kritik adımlar vardırAşağıda tarif edildiği gibi doku hazırlanması 27 ve desi iyonu kaynağı optimizasyonu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura-Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td><a href="http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48" target="_blank">http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0156-6</td>
			<td>OmniSolv, LC-MS Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092-500 ml</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CryoStar* NX70</td>
			<td>Any available microtome can be used for tissue sectioning <a href=" http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar" target="_blank"> http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Omni Spray;DESI Spray Head</td>
			<td>Prosolia Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment <a href=" http://www.prosolia.com/sources.php" target="_blank"> http://www.prosolia.com/sources.php</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>High Voltage Power Supply</td>
			<td>Stanford Research Systems, Inc.</td>
			<td>PS350/5000V-25W</td>
			<td><a href="http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm" target="_blank">http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rope heater, RTD, controller</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters" target="_blank">http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Version 7.1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Translational stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Optiscan II</td>
			<td><a href="http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html" target="_blank">http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AccuTOF Mass Spectrometer</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JMS-T100LC</td>
			<td>Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging of biological tissues by desorption electrospray ionization mass spectrometry

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) mikron ölçekli onlarca yüzlerce biyolojik dokular araştırmak için en yüksek özgüllük ve uzaysal çözünürlüğü ile hedefsiz moleküler bilgi sağlar. Ortam koşulları altında yapıldığında, numune ön muamele edilen bilgileri ve yüksek kaliteyi korurken bu nedenle protokol basitleştirilmesi, gereksiz hale gelir. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI) bile, in vivo olarak, açık havada yüzeylerin direkt örnekleme için izin veren bir püskürtme tabanlı bir ortam MSI tekniktir. Bir yazılım kontrollü numune aşamasında birlikte kullanıldığında, örnek DESI iyonizasyon probu altında rastered edilir ve zaman alanı ile, m / z bilgi kimyasal türlerin mekansal dağılımı ile ilişkilidir. Desi MSI çıkış aslına numune yüzeyi ve kütle spektrometresi girişi ile ilgili olarak kaynak yönlendirme ve konumlandırma bağlıdır. Bu yazıda, ben DESI için doku bölümleri hazırlamak için nasıl gözdenmaging ve doğrudan görüntü kalitesini etkileyen ek deneysel koşullar. Özellikle, DESI-MSI tarafından sıçan beyin dokusu bölümden görüntüleme için protokol açıklar.

Şekil 3, tedavi edilmemiş bir sıçan beyin bölümünden elde edilen temsili bir spektrumunu göstermektedir. Olumlu modunda, kütle spektrumu yüksek iyonizasyon verimliliği (pozitif yüklü dörtlü amonyum gruba atfedilen) nedeniyle fosfatidilkolinler hakimdir. Doku kesiti toplam iyon görüntü aynı zamanda tüm beyin kesiti boyunca bol sinyali gösteren, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Tespit Anahtar lipidler edebiyat karşılaştırmalar ile Tablo 1&#39;de açıkla...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry at JoVE.com

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (DESI-MS) biyolojik dokular dahil olmak üzere örnekler, minimum numune hazırlama ile görüntülenebilir hangi bir ortam yöntemdir. Iyonizasyon probu aşağıdaki örnek rastering tarafından, bu sprey tabanlı teknik doku bölümleri içinde ilgi moleküler özellikleri ayırt etmek yeterli uzaysal çözünürlüğü sağlar.

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

imaging-biological-tissues-desorption-electrospray-ionization-mass

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.4K Görüntüleme.  Georgia Institute of Technology. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (DESI-MS) biyolojik dokular dahil olmak üzere örnekler, minimum numune hazırlama ile görüntülenebilir hangi bir ortam yöntemdir. Iyonizasyon probu aşağıdaki örnek rastering tarafından, bu sprey tabanlı teknik doku bölümleri içinde ilgi moleküler özellikleri ayırt etmek yeterli uzaysal çözünürlüğü sağlar.

Video: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

İkincil Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Sesi-MS) ile karakterize Bakteriyel uçucu

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Biyomühendislik

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3D Hücre Kültürü Modelleri Kütle Spektrometre Görüntüleme Hazırlık Stratejileri Numune

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Zaman-of-flight Kütle Spektrometre ile 2D Gaz Kromatografisi Kullanarak Alg Hidrotermal Sıvılaşma gelen Sulu Kesir Nitel Karakterizasyonu

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Kızılötesi Matriks destekli lazer desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon tarafından tüm vücut Kütle Spektrometre Görüntüleme (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi