Yazarlar, bu çalışmanın, ABD Enerji Departmanı (DEFG02-01ER15129) Hibe No 0.719.232 altında ABD Ulusal Bilim Vakfı tarafından finansal destek için minnettarız ve Protea Biosciences, Inc (Morgantown, WV). Yazarlar ayrıca, protokol videoya sırasında ona yardım Jessica A. Stolee teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) deneyi en önemli adımları açıklar ve hayvan ve bitki doku örnekleri için lateral ve üç boyutlu (3B) görüntüleme için temsilcisi örnekler sunar. Ek deneysel ve teknik detayları başka bir yerden temin edilebilir. 1-6 1. Doku Hazırlık ve Montaj <ol><li> Kesit gerekiyorsa, doku -20 -10 10-100 mikron kalınlığında dilimler halinde bölümüne cryomicrotome kullanmak ° C aksi takdirde belirli bir doku tipi için önerilir sürece. </li><li> Bölümleri kimyasal değiştiriciler olmadan doğrudan düz bir yüzeye (örneğin, kimyasal olarak önceden temizlenmiş cam slayt) üzerine monte edin. Kesitli dokular için, çözülme montaj, her zaman dondurulmuş doku analizi sırasında tutmak için üzerine bölümlerde çözülme-montaj ve hemen Peltier soğutma aşamasında numune tutucu güvenli. Bu adım bölümünde moleküler göçü en aza indirmek / önlemek için gereklidir. </li><li> Gerekirse, doku dondurulmuş korumak için Peltier aşamalı ısı kaldırılmasını kolaylaştırmak için düşük bir güç fan ile donatılmış bir ısı emici kullanın. </li><li> Süre (1-2 saat) uzun bir süre nemli bir ortamda, su veya doku yüzeyinin buz yoğuşma için kontrol edin. Doku üzerinde su yoğuşması detrimentally LAESI deneyler, görüntüleme performansını etkiler. 1 </li><li> Gerekirse, bir oda nem alıcı veya yoğuşmayı önlemek için, bir inert gaz (örneğin, kuru azot gazı) ile dolu bir çevre odasında soğutmalı örnek bir yer. 1 </li></ol> 2. LAESI İyon Kaynak optimizasyonu LAESI iyon kaynağı, orta-kızılötesi lazer, ışık direksiyon optik elemanlar bir dizi ve odaklama yanı sıra ek örnek sahipleri, soğutma bileşenler, çeviri aşamaları ve çözücü bir dağıtım sistemi oluşur. Şekil 1, bu unsurların, bir kütle spektrometre atmosferik basınçlı iyon kaynağı girişinde açısından tipik bir düzenleme göstermektedir. <ol><li> Şekil 1, konumu, kütle spektrometresi örnekleme konisi (d OR-FP) orifis aşağıdaki örnek 15-20 mm gösterildiği gibi . </li><li> 2.94 mikron dalga boyu ve 10 Hz tekrarlama oranı orta-kızılötesi lazer çalıştırın. ~ 100 μJ / pulse enerji lazer çıktı zayıflatır. </li><li> Çift, normal insidansı numunenin içine lazer darbe enerjisi (örnek yüzeyine göre doğru insidansı açısını görmek için lazer dalga boyu (örneğin, bir yüzü düz diğeri dışbükey CaF 2 veya ZnSe lens) saydam altın aynalar ve odaklama lens kombinasyonunu kullanın Şekil 1). </li><li> Kütle spektrometresi örnekleme koni delikli ön orta-kızılötesi ışın ekseni 5-8 mm yerleştirin. </li><li> Odaklı lens pozisyonu ve odak noktası doku çıkarılması elde etmek için lazer ışınının darbe enerji ayarlayın. Ablasyon hacim ölçüleri görüntüleme uygulaması için (ya da üç boyutlu görüntüleme voksel) piksel boyutunu belirlemek. </li><li> Nanospray yayıcı bir kütle spektrometresi giriş ekseni doğrultusunda ve yaklaşık 10 mm&#39;lik bir delik-emiter ucu mesafesi (bkz. Şekil 1) yerleştirin. </li><li> Elektrosprey için, sırasıyla,% 0.1 asetik asit veya% 0.1 pozitif ya da negatif iyon modu için amonyum asetat katkı,% 50 metanol çözeltisi hazırlamak. Asetonitril, isopropanol, vb gibi diğer organik çözücüler, örnek bağlı olarak, analitik bir görev için uygun konsantrasyonlarda metanol yerini alabilir. Elektrosprey istikrar başarılı görüntüleme için çok önemlidir. Solvent seçimi bağlı olarak, akış hızı ve püskürtme voltaj istikrarlı sprey ulaşmak için ayarlanması gerekir. </li><li> Reaktif LAESI 6 için görüntüleme uygulamaları, electrosprayed çözüm reaktanları içerebilir. </li><li> ~ 300 nL / dak akış hızında elektrosprey yayıcı ile elektrosprey çözüm sunmak için bir şırınga pompası kullanın. </li><li> Eğer kütle spektrometresi orifis düşük voltaj (&lt;500 V zemin karşı ölçülen) tutulur, yüksek voltaj uygulayarak elektrosprey emitör (örneğin, 3000 V) doğrudan ya da metal bir sendika aracılığıyla elektrosprey oluşturur. Aksi takdirde, elektrosprey kurmak için doğrudan elektrosprey yayıcı veya metal sendikası aracılığıyla zemin. </li><li> Koni jet elektrosprey kaynak LAESI tarafından en verimli iyon üretimi için püskürtme modunda çalıştırın. Kütle spektrumları püskürtme modları ve etkileri işletim değişkenlerin etkisi, başka yerde tartışmalar görüyorum. 5,7,8 </li><li> Dikkatle LAESI iyon verim için optimize etmek için, lazer ışını, yayıcı ve delik eksenleri aynı düzlemde tutarken LAESI kurulum izafi mesafeleri ayarlayın. Başka bir yerde ayrıntılı talimatlar bulabilirsiniz. 5 </li><li> Optik bir mikroskop ile, örnek ablasyon kraterin lateral boyutlarını belirlemek. </li><li> LAESI üç boyutlu görüntüleme deneyleri için, bireysel darbeleri ile ablasyon gerçekleştirmek ve örneğin kullanarak voksel derinliğini belirler, optik mikroskop z yığın modu 3 </li></ol> 3. Moleküler Görüntüleme ve Veri Analizi Görüntüleme deneyde, doku örneği lazer ablasyon spot boyutları eşit veya daha büyük adım boyutları ile X ve Y yönlerinde odak düzlemli taşınır. Mekansal çözünürlükte olay lazer ışını odaklanarak sınırlıdır. <ol><li> Numune yüzeyinden ilgi alanı seçin ve (X, Y) ilgili sınırların koordinatları elde edilir. </li><li> Görüntülenecek alana her pikselin bekleme süresi seçilen örnek yüzey tarama ile gridding algoritma (örneğin, adaptif ızgara, seçili bölgeyi görüntüleme, dikdörtgen bir ızgara, spiral desen, Z tarama, vb.) Seçti. </li><li> Üç eksenli bir çeviri aşamasında ve önceden belirlenmiş ızgaraya göre örnek rastering yeteneğine sahip bir yazılım kullanın. </li><li> Görüntüleme için gerekli olan toplam süreyi hesaplayın. </li><li> Kütle spektrometresi veri toplama zaman sınırı devre dışı bırakın. Bu mümkün değilse, veri toplama zaman sınırı hesaplanan görüntüleme zaman değeri ayarlayın. </li><li> LAESI lateral görüntüleme deney gerçekleştirmek için her piksel, bekleme süresi içinde kütle spektrumu yeterli sinyal-gürültü oranı üretmek için uygun bir tekrarlama oranı orta-kızılötesi lazer kaynağı başlayın. 3 boyutlu moleküler görüntüleme için, başarılı bir şekilde tek bir lazer darbe içinde üretilen iyonlar kütlelerine analiz etmek için lazer kaynağı tekrarlama oranı daha yüksek bir spektrum alma hızı kullanın. Ablasyon dizisi başlatmak için START sinyali bekleyin. </li><li> Elektrosprey kaynağı açın. Görüntüleme için gerekli olan tam zamanlı için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun. </li><li> Aynı zamanda kitle spektrumlarının satın alma, orta-IR lazer ablasyon, ve yüzey tarama BAŞLAT. </li><li> Görüntüleme çalışması tamamlandığında, STOP yüzey tarama, orta-IR lazer uygulaması ve veri toplama. </li><li> Lazer kaynağı devre dışı bırakın. </li><li> Yüksek gerilim kapatın. </li><li> Şırınga pompası kapatın. </li><li> STANDBY kütle spektrometresi ayarlayın. </li><li> Peltier soğutma elektroniği kapatın. </li><li> Kullanılan inert gaz akışı kapatın. </li><li> Ilgili spektrumları ile 3D analiz lateral görüntüleme veya vokseller piksel mutlak koordinatları ilişkilendirmek için bir yazılım kullanın. </li><li> Lateral ve 3 boyutlu moleküler görüntüler elde etmek için analiz mutlak koordinatları karşı seçilen m / z değeri için iyon yoğunluğu sinyal çizilir . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2, bazı önemli doku tipleri ve görüntüleme yöntemleri için temsili sonuçlar verir. Panel A, deney sırasında su kaybını önlemek için dondurulmuş hayvan doku bölümü için bir durumda gösteriyor. Buna ek olarak 1, örnek numune yüzeyinden yoğuşmasız ortam su buharları önlemek için kuru azot gazı ortamında yer oldu . Sıçan beyin 100 mikron kalınlığında koronal bölümünde (Rattus norvegicus) yanal LAESI ile görüntülendi. Anatomik bölgelerde (beyin panelinde optik görüntü A) moleküler plasmalogens PC için elde edilen görüntü (O-33: 3) ile iyi bir korelasyon gösterir ve / veya PE (O-36: 3) m / z 728,559 . B Paneli Zebra bitki (Aphelandra squarrosa) yaprak doku 3D LAESI görüntüleme gösterir. Yaprakları dehidratasyon karşı doğal bir savunma mekanizmasına sahip oldukları için, örnek ortamda sorgulanabilir. 3 elde edilen 3 boyutlu moleküler görüntüleri, birincil ve ikincil metabolitleri bir dağıtım desen çeşitliliği ortaya . Diğerlerinin arasında, m / z 285,076 acacetin diğerleri homojen bir dağılım ile ikinci ve üçüncü katlar sarı sektörlerde yüksek iyon sayıları tespit edildi. Bu dağılım deseni ile optik görüntü görülen renklilikte kabul etti. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. LAESI sistemi şematik (ES, elektrosprey emiter ucu; OR, kütle spektrometresi örnekleme koni orifis; FL, objektif odaklama, FP, odak noktası; P, Peltier soğutma aşamasında; HS, soğutucu). Örnek moleküller ve iyonlar (yeşil noktalar) numaralı seribaşı yüklü damlacıklar verim elektrosprey ile orta-IR ablasyon (kırmızı nokta) pekişen sırasında sınırdışı partikül madde bir kısmı. Bu damlacıklar serbest iyonlar kütle spektrometresi ile analiz edilir ve kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Lateral ve 3D hayal gücüyle Temsilcisi sonuçlarya da PE (O-36 ve / ng LAESI kütle spektrometresi ile (A) üst panelde sıçan beyin (Rattus norvegicus) koronal bölümünde ve plasmalogens PC için elde edilen moleküler görüntü optik görüntü gösteriyor (3 O-33) : 3) m / z 728,559. 1 mm beyaz ölçek çubuğu için karşılık gelir. (Referans 1) izni ile uyarlanmıştır. Copyright 2010 American Chemical Society. (B) alt panel, rengârenk Zebra bitki (Aphelandra squarrosa) bir yaprak 3D görüntüleme gösterir . M / z 285,076 Acacetin diğerleri homojen bir dağılım ile ikinci ve üçüncü katlar sarı sektörlerde yüksek iyon sayıları tespit edildi. (Referans 3) izni ile yayımlanmaktadır. Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol>
	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

Farklı doku tiplerinin bu etkileri azaltmak için, sırayla, numunelerin ablasyon özellikleri etkileyebilir su içeriği ve çekme gücü, 9 farklı sergi, lazer akıcılık, numune işleme ve analiz protokolleri arasında değişen yaparken revize edilmesi istenen büyük doku tiplerinin. 10 seçili hücrelerin doku yakınlığı içinde, fiber ucunun konumlandırma, tek bir hücre ya da daha yüksek çözünürlüklü incelemeler için, orta-kızılötesi ışık yerine odaklama lens ucu sivriltilmiş bir fiber optik içine birleştiğinde olabilir. LAESI analiz yapılabilir . bir tek hücre düzeyinde. Ortam iyonizasyon kütle spektrometresi için bir etiket-iyon kaynağı olarak, 11 LAESI dokularda biyokimyasal süreçlerin incelenmesi için büyük bir potansiyel göstermiştir. LAESI katma faydaları ile doğrudan analizi, yan ve 3D görüntüleme, profil yanı sıra görüntüleme uygulamaları için gelişmekte olan bir biyoanalitik araçtır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

Kütle spektrometresi Ortam iyonizasyon yöntemleri analitik incelemeler anadili gibi deneysel koşullar altında bir doku ya da biyofilm doğrudan yapılmasına izin verir. Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) böyle bir gelişme ve özellikle su içeren örneklerin soruşturma için çok uygundur. LAESI numune su moleküllerini harekete geçirerek bir orta-kızılötesi lazer ışını (2.94 mikron dalga boyu) kullanır. Ablasyon fluens eşik aşıldığında, örnek malzeme, partiküler madde şeklinde ihraç ve bu mermiler milimetre onlarca örnek yüzey üzerinde yolculuk. LAESI, bu ablasyon tüy çıkarılır örnek malzemenin bir kısmını yakalama ve gaz faz iyonları içine kimyasal maddelerin dönüştürmek için yüksek ücret damlacıkları tarafından durdurulur. Atmosferik bir iyon kaynağı arayüzü ile donatılmış bir kütle spektrometresi örnek probed alanı (piksel) kaynaklanan serbest iyonların kompozisyon analiz ve kayıt için kullanılmaktadır. Piksel bir dizi üzerinden sistematik bir sorgulama mikroprobu analiz modunda moleküler görüntüleme için bir yol açılır. LAESI kitle spektrometrik görüntüleme benzersiz bir yönü, lateral görüntüleme ile birlikte, üç boyutlu (3D) moleküler görüntüleme sağlayan, derinlik profil. ~ 100 mikron ve sırasıyla ~ 40 mm, lateral ve derinlik kararları, LAESI kitle spektrometrik görüntüleme, moleküler biyolojik dokuların yapısını keşfetmek için yardımcı olur. Burada, bir LAESI sistemin en önemli unsurları gözden geçirmek ve başarılı bir görüntüleme deney için yönergeler sağlamak.

Watch this Scientific Journal Video about Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry at JoVE.com

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi bir atmosferik basınçlı iyon kaynağı. Görüntüleme modunda, orta-kızılötesi lazer probları bir doku bölüm veya bir biyofilm boyunca moleküllerin dağılımları. Bu teknik, doğal deneysel koşullar altında yürütülen çeşitli biyoanalitik çalışmalar için yeni bir yaklaşım sunuyor.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Görüntüleme.  George Washington University. Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi bir atmosferik basınçlı iyon kaynağı. Görüntüleme modunda, orta-kızılötesi lazer probları bir doku bölüm veya bir biyofilm boyunca moleküllerin dağılımları. Bu teknik, doğal deneysel koşullar altında yürütülen çeşitli biyoanalitik çalışmalar için yeni bir yaklaşım sunuyor.

Video: Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...