Yazarlar platformu finansman ve destek için Genom Kanada ve Genom British Columbia kabul etmek istiyorum. Biz de el yazması ve düzenleme yardım eleştiri Dr Carol E. Parker teşekkür ederim. CHL de destek için teşekkür British Columbia Proteomiks Ağı.

1.. Doku Bölünmesi <ol><li> , Sıvı azot kullanılarak, bir kez hasat sorunu örnekleri, flaş dondurma (nakliye gerekiyorsa) kuru buz üzerinde gemi ve doku kesit kadar -80 ° C&#39;de saklayın. (Ticari numuneler kullanıldığında, numuneler Bu şekilde hazırlanan olduğundan emin olun.) </li><li> MALDI hedef sığdırmak için yönetilebilir bir boyutta organları kesilmiş. Organın istenmeyen kısımlarını keserek. Burada tarif edilen bu çalışma için, buzağı lensler doku kesit önce, daha önce tarif edilen prosedür kullanılarak 35 decapsulated edilmiştir. </li><li> -80 ° C dondurucu bütün organları çıkarın ve bir kriyojenik doku kesme sahneye onları düzeltmek. Bir buzağı lens düzeltmek için, bir kriyostat doku kesme aşamasında su, bir ya da iki damla yerleştirin. Katılaşana önce hızlı bir şekilde suda lens yerleştirin. Seçenek olarak ise, en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşikleri, aynı zamanda kesme aşamasında üzerine bir doku düzeltmek için kullanılabilir. Ekim bileşiklerin kullanılması halinde, miniOCT mal miktarı uygulanmalı ve bakım kesim doku bölümleri iyonizasyon ve Analitlerin 5,36,37 tespiti engelleyebilir Ekim bileşikler ile kontamine olmayacak sağlamak için alınmalıdır. </li><li> Kriyostat içindeki sıcaklık -18 ° C&#39;ye denge sağlaması için izin Daha soğuk ya da sıcak sıcaklıkları sırasıyla daha yumuşak veya daha sert dokular için kullanılabilir. Sonra ekvatorial 20 mikron kalınlığında dilimler halinde doku kesti. Çoğu dokular için 10-15 mikron kalınlığında dilimler kullanın, çünkü sığır lens dokusunun kırılgan yapısı nedeniyle, bununla birlikte, 20 um kalınlığında kesitler kullanılmıştır. Sığır lens dokusu, ilk doku bölümleri atmak ve sadece ekvator düzlemine yakın ya da dilim kullanın. </li><li> Oküler bir lens doku görüntülü ise, bir indiyum kalay oksit (İTO) kaplı cam slayt, yüzey ön ıslatılmış formik asit (% 98 saflıkta, LC-MS dereceli), 1.5 ul kullanın. </li><li> Dikkatlice İTO-co yüzeyine doku bölümleri aktarmakkriostada içinde oluşturulacağı cam mikroskopik slayt. Doku bölümü hızla çözülme ve slayt yüzeye sıkıca tutturulmuş olacaktır. Genellikle, çok sayıda doku bölümleri, bu şekilde aynı İTO kaplı slayt üzerine monte edilebilir. </li><li> MALDI matris uygulama öncesi 15 dakika için slayt liyofilize edilir. </li><li> Matris testi için, uygun çözücüler içerisinde bireysel matrisler çözülür. El doku bölümü üzerine, her matris solüsyon içerisinde 1 ul nokta. Buna ek olarak, MALDI duyarlılık doğrulanması için doku üzerine küçük moleküllü kalibrasyon standardı nokta. </li><li> Bir düzeltme-sıvı kalem ile ITO kaplı cam slayt yalıtkan yüzeyinde yazarak ITO kaplı cam slayt üç öğretim işaretleri ekleyin. Masaüstü bir tarayıcı kullanarak doku slayt bir optik görüntü almak ve bu tür TIFF veya jpg gibi uygun bir formatta kaydedebilirsiniz. </li></ol> 2. Matrix Kaplama 2.1. Otomatik Matrix Kaplama <ol><li> Apotomatik olarak bir Bruker ImagePrep veya benzer bir elektronik matris spreyleyicisi kullanarak doku bölümlerinin yüzeylerine çözücü olarak asetonitril veya karışık asetonitril / su içeren katlı matris çözümleri,. </li><li> Matris kat sürgünün kenarları kalmaması bant ile İTO kaplı bir cam slayt ön yüzeyinin kenarlarını örtün. Bu karşı yüzeyi üzerinde öğretim işaretleri dokusu lamı hizalama için kullanılabileceğini garanti eder. Onlar ITO kaplı slayt elektrik iletkenliğini korumak için temas noktaları olarak kullanılır gibi matris ile slayt kenarlarını örtmeyin. </li><li> Coat kaplama matris (2-sek sprey, 30-sek inkübasyon ve her devir için 60 saniye, kuruma süresi) yirmi döngüleri kullanılarak cam slayt. </li></ol> 2.2. Manuel Matrix Kaplama <ol><li> Elektronik matris püskürtücünün üretim malzemeleri ile uyumlu olmayan organik çözücüler (örneğin kloroform ve etil asetat) ise requikırmızı, matrisi uygulamak için bir pnömatik destekli airbrush püskürtücü kullanabilirsiniz. Airbrush tabancasının çözücü haznesine hazırlanan matris solüsyonu eklenir ve asal gazı için basınçlı azot gazı hafif bir akış uygulanır. </li><li> Matris kat sürgünün kenarları kalmaması bant ile İTO kaplı cam lam ön yüzeyinin kenarlarını örtün. Bu karşı yüzeyi üzerinde öğretim işaretleri dokusu lamı hizalama için kullanılabileceğini garanti eder. Onlar ITO kaplı slayt elektrik iletkenliğini korumak için temas noktaları olarak kullanılır gibi matris ile slayt kenarlarını örtmeyin. </li><li> Kararlı ve iyi spreyler gözlenmiştir sonra el matris sprey tamamen kaplar ve böylece doku bölümü. Ancak mümkün analit delokalizasyonu önlemek için her devir süresince yüzeyi ıslatmak için gereken matris solüsyon en az miktarda uygulanır. Genel olarak, kaplamak için matris sprey, yaklaşık 10 döngü, bir doku bölümü kullanmak, döngü sayısıdoku tipi ve matris bileşimine bağlıdır. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Su (son karışım içerisinde% 0.1 formik asit ihtiva eder): 60:40 izopropanol 1:200 bir faktör ile &quot;ES ayarlama Mix&quot; standart çözelti seyreltilerek bir kütle kalibrasyon çözelti hazırlayın. </li><li> 2 ul / çift modlu elektrosprey iyonizasyon (ESI) ESI taraftan FTICR kütle spektrometresinde / MALDI iyon kaynağı, seyreltilmiş &quot;ES ayarlama Mix&quot; çözeltisi min tanıtılması. </li><li> Geniş bant algılama ve 1.024 kb / sn &#39;lik bir veri toplama boyutu ile, pozitif iyon ESI modunda FTICR alet çalıştırılır. Tipik ESI parametreler kılcal elektrospray gerilim, 3,900 V vardır, kalkan gerilimi, 3.600 V sprey; nebulizatör gazı (N2) akış, 2 L / dk; kuru gaz (N2) akış ve sıcaklık, 4 L / dk ve 200 ° C; 1 gerilimini, 15 V skimmer, uçuş (TOF) süresi, 0.009 saniye; çarpışma gaz (Ar) akış, 0,4 L / s; kaynak iyon birikimi zaman, 0,1 sn;ve çarpışma hücre iyon birikimi zaman, 0,2 sn. Iyi bir zaman-domain serbest indüksiyon çürüme (FID) sinyalleri muhafaza ederken, m / z 200 1400, kütle aralığı üzerinde analitik hassasiyet en üst düzeye çıkarmak amacıyla Ayarlama FTICR işlem parametreleri. Tipik olarak, ICR operasyon parametreleri sidekick gerilimi, 8 V olan, ofset gerilimi, 8 V sidekick; 10 uyarım güçlendirilmesi; uyarım darbe zamanı, 0,01-,015 sn; ön tuzak plaka gerilimi 1,5 V; geri tuzak plaka gerilimi, 1.6 V ve analiz giriş gerilimi, -4 FTICR işlem parametreleri bir dizi belirlenmiştir sonra V., ESI kütle spektrumu elde etmek ve &quot;ES ayarlama Mix&quot; çözelti içinde standart bileşiklerin referans kitleleri kullanarak aleti kalibre edin. </li><li> Ayarlamak için MALDI çalışması için, gösterge, 1 uM, her bir konsantrasyonda çözelti içinde matris karma terfenadin ve reserpin standart solüsyon birkaç 1 ul alikotları çözülür ve doğrudan Tissu&#39;nun birinin üzerine bu çözümleri noktaE kesitler ITO kaplı slayt üzerine monte edilmiş (yani bir test doku bölüm). Bir doku slayt adaptörü (yani özel bir MALDI hedef) içine ITO kaplı slayt yerleştirin ve çift ESI / MALDI iyon kaynağına MALDI taraftan adaptörünü yükleyin. Her kitle tarama için MALDI sinyal birikimi, vb için lazer gücü ve lazer çekim sayısı için uygun MALDI işletim parametrelerini optimize Tipik MALDI operasyon parametreler şunlardır: lazer çekim, 50 ve 300 V bir MALDI anot gerilimi </li><li> Ayarlamadan sonra, kalibre ve MALDI-MSI deneyler için aracı optimize görüntüleme yazılımı dahilinde kaydedilen optik görüntü ile görüntülü bir doku bölümün fiziksel konumunu hizalamak. Üç nokta nirengi yöntemini kullanarak bu uyum için önceden ITO kaplı slayt yüzeyinin ters tarafına (adım 1.9) koymak olmuştu üç &quot;düzeltme-sıvı&quot; işaretleri, kullanın. </li><li> Eşzamanlı ESI ve MAL gerçekleştirinDI işlemi, her bir kütle spektrumu alım sonrası iç kütle kalibrasyonları için &quot;ES Tuning Mix&quot; çözümün referans kütlesi tepeleri içerir böylece. Bu MALDI MS boyunca en doğru kütle ölçüm neden olur. Bunu yapmak için, önce ESI kalibrant sinyaller iç kütle kalibrasyonları için hala yeterince yüksek iken MALDI sinyalleri tayfını hakim kadar kılcal gerilimini azaltarak ESI sinyalini zayıflatmak. </li><li> Sonraki, lazer ışınları için bir otomatik rasterleme yöntemini kurmak. Yansıması için doku bölgeleri tanımlamak ve uygun lazer tarama adım boyutunu ayarlayın. Küçük raster adım boyutları yüksek çözünürlüklü doku görüntüleri sağlayabilir unutmayın, ama önemli ölçüde daha uzun kütle spektral edinimi süresi ve daha fazla veri depolama alanı gerektirir. Görüntü piksel sayısı kurmak için lazer tarama adım boyutu ve doku büyüklüğüne bağlıdır. 1 cm2 doku boyutuna sahip, tipik bir sığır lens, bir doku görüntü tipik haliyle yaklaşık oluşmaktadır. </em&gt; 5.000 piksel 200 mikron bir lazer tarama adım boyutu bir FTICR alet kullanılır eğer. Bu deney sırasında nedeniyle kademeli sinyal zayıflaması konum tabanlı önyargı engeller gibi, bir &quot;tesadüfi&quot; analizi kullanın. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> İlk karşılaştırma için dahili kalibrasyonunu kullanarak MALDI kütle spektrumları kalibre ve MS / MS için doruklarına seçin. De-izotop ve özelleştirilmiş bir VBA komut 38 kullanılarak, daha önce tarif edildiği gibi monoizotopik tepe seçin. </li><li> İhracat monoizotopik zirve listeleri ve METLIN 39 ve / veya kütüphane girişleri ile kitle eşleştirme için HMDB 40 metabolome veritabanlarına girdi ölçülen m / z değerleri sonuçlanır. ± 1 ppm kabul edilebilir bir toplu hata ile, veritabanı arama sırasında (M + H) +, (M + Na) + ve (M + K) + iyonları göz önünde bulundurun. </li><li> Imag kullanarak tüm doku kesiti tespit lipid tüm varlıkların için MALDI görüntüleri oluşturmaktepe tepe 1 ppm&#39;lik bir kitle filtre genişliğe sahip e-analiz yazılımı,. </li><li> Görüntüler veritabanı girdileri eşleşen tüm m / z değerleri oluşturulduktan sonra, daha sonra araştırılmalıdır benzersiz dağıtım desenleri aramak için yanı sıra diğer tüm zirveleri için görüntüleri oluşturabilirsiniz. </li></ol> 5. Imaged Lipidlerinin Kimliklerin Onayı <ol><li> MALDI-MS/MS ile FTICR aleti (fosfolipidler örneğin 184,073) kullanılarak tespit edilebilen karakteristik bir fragman iyonu sahip yüksek bolluk lipidler, kimliklerini teyit edin. Doğrudan doku üzerinde çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanılarak MALDI-MS/MS yapın. </li><li> Doğrudan MALDI-MS/MS tarafından teyit edilemeyen lipid türler için, bir q-TOF kütle spektrometresi 34 birleştirilmiş UPLC sistemi kullanın. <ol><li> El ilgilenilen türleri lokalize alan bir doku ~ 10 mg içeren alikotları keser. 2 içine bu doku hacimde yerleştirinml santrifüj tüpleri. </li><li> Iki 5 mm paslanmaz çelik metal toplar ile bir mikser değirmeni kullanılarak, su, 250 ul bir kısım, her doku homojenize. </li><li> Kloroform-metanol çözeltisi (01:03, v / v) ve girdap boruları 1 ml ilave edilir. Daha sonra, 10 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de bir mikro santrifüj kullanılarak santrifüj tüpleri. </li><li> Süpernatantlar toplayın ve Devir-vakumlu konsantratörü onları kurutun. </li><li> Su: 30:70 izopropanol 100 ul artıkları çözülür. Gradyan elüsyonu kullanılarak ayrılması için UPLC kolonuna 10 ul kısım enjekte edilir. </li><li> 34, daha önce yayınlanmıştır on-line lipid LC-MS/MS için kromatografik şartlar kullanın. </li><li> Oluşturmak ekstre iyon akımı (XIC) teorik kitleler etrafında ± 50 ppm&#39;lik bir pencere ile, teorik m / z değerleri kullanılarak kromatogramları. </li><li> Bu lipidler için özgün bileşikler varsa, karşılık olanlar ile otantik bileşiklerin tutma süreleri eşleşendoku örneklerinden XIC tepe kesilmelidir. Bileşikler, aynı ise, tutma süreleri ve MS / MS spektrumları ile eşleşmelidir. </li></ol></li><li> Otantik bir bileşik mevcut değilse, bu tür METLIN veya HMDB gibi bir metabolome veritabanından bir standart MS / MS spektrum maç için saptanan lipid parçalanma desen kullanın. Lipid için olası bir yapısını belirlemek için de novo kütle spektrum yorumu kullanın. </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Başarılı MALDI MSI için en önemli hususlar vardır: 1) doku hazırlanması; 2) matris seçim; 3) matris uygulaması ve 4) veri yorumlama ve analizi. Numune ve matris uygun şekilde hazırlandığı zaman, MS verileri elde etme otomatiktir. Deneyin bu tür veri analizi oldukça emek yoğundur. Uygun doku hazırlanması başarılı MALDI MSI deneyler için çok önemlidir. Doku kaynağı ve işleme son analizde üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Numuneler bir metabolitler ° C. ...

Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) bir doku bölümü 1,2 yüzeyinde bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu ve dağıtım modellerini belirlemek için bir analitik tekniktir. Peptitler ve proteinlerin analizi için matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) MSI bir on yıl için kullanılır olmuştur ve numune hazırlama, algılama hassasiyeti, uzaysal çözünürlüğü, tekrarlanabilirlik ve veri işleme 3,4 yöntemleri büyük gelişmeler olmuştur. Histolojik boyanan kesitler ve MSI deneylerden bilgileri birleştirerek, patologlar patafizyolojik ilginç özellikleri 5 spesifik bileşiklerin dağılımları ilişkilendirmek mümkün. Eksojen uyuşturucu 6,7 ve metabolitleri 8-10 gibi küçük moleküllerin dağılımları da MALDI-MS doku görüntüleme 11 tarafından sorguya edilmiştir. Lipidler belki de en çok çalışılan cla vardırMS 12-17 ve MS / MS 18 modlarında MALDI görüntüleme ile bileşiklerin ss. Küçük molekül görüntüleme için MALDI MSI kullanılması çeşitli faktörler tarafından kısıtlı olmuştur: 1) MALDI matrislerin kendileri bol iyon sinyalleri üretmek küçük moleküller (tipik m / z &lt;500) vardır. Bu bol sinyaller küçük moleküllü analitlerin iyonizasyonu bastırmak ve algılama ,19,20 engelleyebilir. Solvent içermeyen kaplama matris 21, matrix süblime 22 ve MALDI MS 23 önceden kaplanmış matris, diğerleri arasında, küçük moleküllerin MSI geliştirmek için geliştirilmiştir. Düşük MW bileşiklerin analizini artırabilir yeni matrisler küçük molekül MSI büyük ilgi vardır. Bu matrisler azalma matris sinyalleri ile artan bir analit sinyaller sağlamalıdır. Pozitif iyon modunda, 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA) MSI 24 için yaygın olarak kullanılan iki MALDI MS matrisleridir </sup&gt;. Analitlerin uzamsal lokalizasyonu korumak üzere ideal bir matris, küçük kristaller oluşturmak olacaktır. DHB nedenle süblimasyon ile matris kısmen bu sorunun üstesinden gelmek için geliştirilmiştir ve fosfolipid 22,25 hassas görüntüleme için bu matrisin kullanımı sağladı uygulanması daha büyük kristaller oluşturma eğilimindedir. 9-aminoakridin&#39;in pozitif-iyon modunda 26 ve negatif iyon modunda 26-29 nükleotid ve fosfolipid protik analitlerin MSI için kullanılmıştır. 2-merkaptobenzotiazol lipid 30 verimli MALDI algılama vermek bulunmuştur ve fare beyin görüntüleme 31, gangliosidler için kullanılmıştır. Fourier, ultra yüksek çözünürlüklü iyonsiklotron rezonans (FTICR) dönüşümü kütle spektrometre biraz matris sinyallerine 32 analit sinyalleri çözerek bu sorunu hafifletmek olabilir. FTICR-MS kullanımının bir başka avantajı, metastabil öbeklerden yoğunluğu azaltma olmasıdırAyrıca, bu parazitlerin 27 azaltır ed 33. Ditranol kullanılması (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) doku görüntüleme için bir MALDI matris 34, daha önce rapor edildiği gibi. Bu mevcut çalışmaları olarak, ayrıntılı bir protokol pozitif-iyon modunda, sığır lens doku bölümlerinin yüzeylerine endojen lipidlerin MSI DT kullanımı için sağlanır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) esas olarak MALDI (matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon) dayalı analitik teknikler kullanılarak, bir doku bölümü yüzeyinde bileşiklerin uzamsal lokalizasyonu ve dağılım özellikleri tespit eder. Düşük moleküler ağırlıklı (MW) bileşiklerinin analizini geliştirmek küçük moleküllü MSI için yeni matrisler, ihtiyaç vardır. MALDI arka plan sinyallerini düşürürken Bu matrisler artan analit sinyalleri vermelidir. Ayrıca, Fourier gibi ultra yüksek çözünürlüklü araçların kullanımı iyonsiklotron rezonans (FTICR) kütle spektrometre, dönüşümü matris sinyallerinden analit sinyallerini çözmek için yeteneğine sahiptir, ve bu kısmen plan MALDI kaynaklanan ile ilgili birçok sorunları aşabiliriz matrisi. FTICR MS ile metastabl öbeklerden yoğunluklarındaki azalma da diğer araçlar ile ilgili matris zirveleri ile ilgili etkileşimler bazılarının üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Yüksek çözünürlüklühala kimyasal tespitlerle güven sağlarken aynı anda birçok bileşiklerin dağılımı desen üretebilir gibi FTICR kütle spektrometre gibi enstrümanlar avantajlıdır. Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on), daha önce doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir. Bu çalışmada, pozitif-iyon MALDI-MS ile memeli doku bölümlerinin yüzeylerinden endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için, DT kullanımı için bir protokol, bir ultra yüksek çözünürlüklü bir hibrid bir dört kat üzerinde FTICR araç temin edilmiştir.

<html> ITO kaplı cam slaytlar üzerine kesitli ve çözülme monte edilmiş doku örnekleri görünür yırtılma olmadan, sağlam olmalıdır. Birçok doku için, bir ITO kaplı cam slayt üzerine monte doğrudan doku çözülme kabul edilebilir. Doğrudan montaj çözülme (Şekil 1a) kullanıldığı zaman, örneğin sığır lens gibi bazı spesifik dokular için, doku geniş yırtılma sık görülür. Etanol veya formik asit ile İTO cam slayt ön kaplamaya tabi tutulması (Şekil 1b),</st...

Watch this Scientific Journal Video about Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer at JoVE.com

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) daha küçük moleküllerin doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir; üzerinde endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için DT kullanımı için protokoller Bir ultra çözünürlüklü kuadrupol-FTICR alet üzerinde pozitif iyon MALDI-MS tarafından doku kesitlerinin yüzey burada verilmektedir.

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Görüntüleme.  University of Victoria.  Ditranol (DT, 1,8-dihidroksi-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) daha küçük moleküllerin doku görüntüleme için bir MALDI matris olarak bildirilmiştir; üzerinde endojen lipidlerin MALDI görüntüleme için DT kullanımı için protokoller Bir ultra çözünürlüklü kuadrupol-FTICR alet üzerinde pozitif iyon MALDI-MS tarafından doku kesitlerinin yüzey burada verilmektedir. 

Video: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanarak Karışım miktarının

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

MRM Microcoil Performans Kalibrasyonu ve Kullanımı Medicago truncatula Köklerinde 22 T'de GösterilmiştiR

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme Kullanarak Drosophila Beyinde Hızlı Lipid Analizi için Örnek Hazırlama