Bu çalışma, öncelikle 1-R21-R44-ES019498 ve ES021116 kısmi desteği ile 5-UO1-ES016045 tarafından destek oldu. DMW Çevresel Toksikoloji T32-ES007020 yılında NIEHS Eğitim Grant tarafından desteklenmiştir. Ekipman Çevre Sağlığı Bilimleri P30-ES002109 için Merkezi tarafından sağlandı.

Chip 1. Hazırlık <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aşağı bir-iyi dikdörtgen plaka, jel film tarafı içine paketi ve yerden çip jel çıkarın. </li><li> Iki kez tekrar, 15 dakika boyunca PBS 1x 25 ml jel yıkayın. </li><li> Cam plaka ve buna göre jel etiket yönelimine ayarlayın jel. </li><li> Yavaşça jel üzerine ters çevrilmiş dipsiz 96 oyuklu plaka basın; Dibi olmayan plaka kuyuları her jelin alanı içinde olduğundan emin olun. </li><li> Cam ile kenetlenmesini sağlamak için, plakanın her yanında 1,5 &#39;bağlayıcı klipsler kullanılır. </li><li> Aşırı PBS kapalı aspire iyi her tampon. </li></ol> 2. Yükleme Hücreler <ol style="margin-left: 40px;"><li> Hücre süspansiyonlarının hazırlanması: <ol><li> Süspansiyon hücre hatları için, 10 ml / 5 -10 6 hücre bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere ortam içinde hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> , Yapışan hücre hatları için normal Ayırma / tripsinizasyon protokolleri takip ve d10 5 -10 6 hücre / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar ortam içinde müstakil hücreleri ilute. Hücrelerin toplam varsa, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre filtresi hücre süspansiyonu geçmektedir. </li></ol></li><li> 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 100 ul ilave edin. </li><li> Jel film ile kapak plakası ortam buharlaşmasını önlemek için. </li><li> Hücreler 37 ° C inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca yük sağlar. </li><li> Her kuyudan kuvöz ve aspire medya çipini çıkarın. </li><li> Bağlayıcı klipleri ve dipsiz 96-plaka çıkarın; bir açıda cam plaka ile çip tutarken agaroz üzerinde aşırı hücreleri çıkarmak için 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Bir 4X objektif lens ile parlak bir alan mikroskobu kullanılarak hücre yükleme kontrol edin. Yetersiz yükleme görülürse, adım 2.1 tekrarlayın. </li><li> Daha da yüzey (bench) yüklenen çipi yerleştirin. Bir% 1 düşük erime noktalı (LMP) agaroza bindirme çip 37 ° C&#39;de önceden ısıtıldı. Yaklaşık kullanın 2̵1 &#39;dir; LMP agaroz 3 ml her bir yonga için gereklidir. </li><li> Üst kaplama 3 dakika boyunca oda sıcaklığında ve daha sonra katılaşan önce tam katılaşma işlemi için 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir buzdolabı için hareket etmesine izin verir. </li></ol> 3. Dozaj ve Onarım NOT: bazal DNA hasarı seviyesini incelemek Adım 4 atlamak için. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dikkatli bir şekilde yeni bir 96 oyuklu dipsiz plakanın gözleri ile (önceki kenetlenmeden oluşturulan), çipin kuyu hizalayın. Re-pres bağlayıcı klipleri ile üst ve güvenli bağlama üzerinde dipsiz 96-plaka. </li><li> 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, istenen doz kimyasal 100 ul ilave et; Buz üzerinde ya da bir zaman istenen miktarda boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında olarak dozajlanması ve / tedavisidir. </li><li> Her iyi gelen, aspirat kimyasallar dozajlama ve 1x PBS kullanılarak kalıntı kimyasal uzaklıkta yıkayın sonra. Direkt hasar burada okudu ise, 4. Adıma geçin. </li><li> Olarak onarmak için çip hücreleri, onarım kinetiğini incelemek izin37 ° C&#39;de ortam. Lyse belirli zaman noktalarında (Adım 4 geçin). Not: tamir bağlı tabanı olmayan 96 oyuklu bir plaka ile çip-üstü gerçekleştirilebilir ya da çip Dibi olmayan 96 oyuklu bir plakanın ayrılmasından sonra, ayrı parçalar halinde kesilebilir. </li></ol> 4. Liziz <ol style="margin-left: 40px;"><li> Alkalin kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> % 1 Triton X-100 lizis stok çözelti (2.5 M NaCl, 100 mM Na-2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10), alkalin ekleyerek alkalin lisiz tamponu çalışma yapmak. Her çip için lizis tamponu çalışma yaklaşık 25 ml hazırlayın. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta alkalin lisiz tamponu çalışan ön soğutma. </li><li> Soğuk çalışma alkalin lisiz tampon maddesi içinde çip daldırın ve 4 ° C&#39;de lisis buzdolabında O / N yapmasına izin verin. </li></ol></li><li> Nötr kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> Nötr lizis stok çözeltisi (2.5 M NaCI, 100 mM Na-EDTA, 2 den 10 a kadar% 1 Triton X-100 ve% 10 DMSO ilave edilerek nötr bir liziz tamponu çalışma yapmakmM Tris,% 1 N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Her çip için lizis tamponu çalışan yaklaşık 25 ml hazırlayın. </li><li> 43 ° C&#39;de nötral lizis tamponu çalışma öncesi sıcak. </li><li> Sıcak çalışma nötr lizis tamponunda çip batığın ve parçalama 43 ° C inkübatör O / N gerçekleştirmek için izin verir. </li></ol></li></ol> 5. Elektroforez <ol style="margin-left: 40px;"><li> Alkalin kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> 1x PBS ile çip durulayın hızla lizis tamponu çıkarın ve. </li><li> Jel film tarafı çift taraflı bant kullanarak aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasında Güvenli çip. </li><li> 4 ° C soğuk oda odasına getirin. </li><li> Sadece jel kapsayan bir seviyeye kadar soğuk bir alkali elektroforez tamponu (0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) ile oda doldurun. </li><li> 40 dakika için alkalin gevşemek için izin ver. </li><li> 1 V / cm ve soğuk odada 30 dakika boyunca 300 mA&#39;da elektroforez çalıştırın. Cha elektroforez tampon seviyesini ayarlayınİstediğiniz çalışan akımı elde etmek mber. </li></ol></li><li> Nötr kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için: <ol><li> Liziz tamponunu çıkarın ve 2 x 15 dak, 4 ° C de nötr elektroforez tamponu (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borik asidin, pH 8.5) ile çip yıkayın. </li><li> Jel film tarafı çift taraflı bant kullanarak aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasında Güvenli çip. </li><li> 4 ° C soğuk oda odasına getirin. </li><li> Sadece jel kapsayan bir seviyeye kadar, soğuk nötral elektroforez tamponu ile hazne (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borik asidin, pH 8.5) doldurun. </li><li> Jel 60 dakika boyunca soğuk odada oturmak için izin. </li><li> 0,6 V / cm elektroforezi çalıştırın ve soğuk bir odada 60 dakika boyunca 6 mA. İstenilen çalışma akımı elde etmek odasında elektroforez tampon seviyesini ayarlayın. </li></ol></li></ol> 6. Floresan Görüntüleme <ol style="margin-left: 40px;"><li> Col Elektroforez odasından çipini çıkarınd oda. </li><li> 4 ° C&#39;de buzdolabında 2 x 15 dakika boyunca nötralizasyon tamponu (0.4 M Tris, pH 7.5) nötralize jeller. </li><li> Seçtiğiniz floresan DNA boyası ile çip Leke (yani, SYBR Altın, Etidyum Bromür) fabrika altında önerilen prosedürleri. Floresan mikroskopi kullanılarak. </li></ol> 7. Veri Analizi Böyle Komet 5.5 gibi standart kuyruklu yıldız tahlil yazılım tarafından kuyruklu Görüntüler analiz edin.

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles,+Applications,+and+Limitations.">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li><li>Olive, P. L., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+and+DNA+damage+analysis+using+microwell+arrays.">Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).</li><li>Weingeist, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+enables+high-throughput+evaluation+of+DNA+double-strand+breaks+and+DNA+repair+inhibitors.">Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors.</a> Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+toxicity+assessment:+employing+the+best+science+for+human+safety+evaluation+part+III:+the+comet+assay+as+an+alternative+to+in+vitro+clastogenicity+tests+for+early+drug+candidate+selection.">Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection.</a> Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>M&#248;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+environmental+agents+assessed+by+the+alkaline+comet+assay.">Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay.</a> Basic &amp; clinical pharmacology &amp; toxicology. 96, 1-42 (2005).</li><li>Dusinska, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+in+human+biomonitoring:+gene-environment+interactions.">The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions.</a> Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+the+comet+assay+in+the+clinical+management+of+cancer.">Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer.</a> Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+generated+damage+to+the+guanine+moiety+of+DNA:+mechanistic+aspects+and+formation+in+cells.">Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells.</a> Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).</li><li>Forchhammer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+measurement+of+DNA+damage+by+comet+assay+measured+by+the+ECVAG&#8224;+inter-laboratory+validation+trial.">Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG&#8224; inter-laboratory validation trial.</a> Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).</li><li>Olive, P. L., Wlodek, D., Ban&#225;th, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis.">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li><li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA.">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li><li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+(comet+assay).">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , (2010).</li><li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay.">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li><li>Collins, A. R., Dusinsk&#225;, M., Horsk&#225;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alkylation+damage+in+human+lymphocyte+DNA+with+the+comet+assay.">Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay.</a> Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).</li><li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic.">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li><li>Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+repair+capacity+in+human+populations.">A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations.</a> Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).</li><li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population.">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li></ol>

The CometChip has been licensed to Trevigen, Inc. based upon a patent submission that includes Wood, Weingeist, Bhatia and Engelward.

Çevre ve insan hücreler içinde her yerde Genotoksinlerin kaçınılmaz stres ve hücresel DNA hasar gösterirler. Aslında, kararlı durumda 18 insan hücrelerinde bulunan DNA lezyonları 1,000s olduğu tahmin edilmiştir. Insanlarda hasar yatkınlık ve onarım kinetik anlamadan sadece temel araştırma anlayış getiriyor, ama aynı zamanda ilaç geliştirme yararlanır. Ironik kanser teşvik etmek için, DNA hasarının yeteneğine rağmen, DNA&#39;ya hasar veren ajanlar, kanser tedavisi DNA hasarı hakkında bilgi alma ve kişiye özel ilaç ile ilgili tamir etmek için çok yüksek seviyelerde kullanılmaktadır. CometChip uzun var DNA hasarı tahlili devrim mikroimalat uygulamaları kullanan yeni araştırma cihazdır. Geleneksel kuyruklu testin aynı ilkeleri üzerine inşa çip önemli oranda daha yüksek ve daha iyi tekrarlanabilirlik sağlar. Biz burada bu çip kullanan yöntemleri açıklanmaktadır. Kendi programını ve sağlamlığı açıklığa kavuşturmak için, sağa sola sonuçlarını göstermekm çip birkaç farklı DNA hasar maddeleri ile hasarını değerlendirmek için kullanılmıştır ve bu DNA onarımını değerlendirmek için burada kullanıldığı pek çok deney. Birlikte, burada sunulan sonuçlar çip kullanan için yararlı bilgiler sağlar ve DNA hasarı ve onarımı üzerinde yapılan araştırmaya geniş uygulanabilirliğini göstermek. Bu protokolde en önemli adımlardan biri etkili bir hücre yükleme gerçekleştirmek. Birçok hücre hatları süspansiyonu ve yapışık hücreleri de kapsayan, bu sistem üzerinde test edilmiştir. Verimliliği yüklüyor, hücre tipi, hücre boyutu, yükleme konsantrasyon ve zaman gibi pek çok değişkene bağlıdır. Böyle lenfoblastoid hücreler gibi süspansiyon hücre hatları ile çalışmak için en kolay olanıdır. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 96, oyuk başına 10 Nisan - 10 Haziran hücrelerden değişebilir ve yükleme süresi 15-30 dakika içerisinde tamamlanır. Daha yüksek hücre yoğunluğu yüklenmesini kolaylaştırır ve mikro oyuk içine yerleşmek için hücreler için gerekli süreyi kısaltır. Yapışık hücreler için yükleme parametreleri süspansiyon hücreleri farklı olabilir. Bu Çin hamster yumurtalık (CHO) hücreleri, hem hücre çizgileri süspansiyon hücreleri olarak benzer yükleme verimliliğini (alttaki tripsinizasyon) olduğu ve bu nedenle benzer yükleme koşulları kullanarak saptandı. Bu kolayca süspansiyon hücre agregatları oluşturmaz tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri, ek bir işlem gerektirebilir. Süspansiyon, ortam, tripsin, tek bir hücre, hücre süspansiyonları bir filtreden geçen ekleme ve yükleme esnasında hücre kümelerinin oluşumunu bastırabilir. Son olarak, yükleme süresi bakımından, süre 20 dakika ile 1 saat arasında değişebilir mikroçukurlarda yapışık hücre çizgileri yakalamak için gereklidir. Sonuç olarak, kullanıcıların daha ileri tetkikler geçmeden önce en uygun yükleme koşulları belirlemek için pilot deneyler gerçekleştirmeniz tavsiye edilir. Yükleme etkinliği DAPI&#39;nin veya diğer DNA ile kapsüllü hücreler boyanarak daha doğru ortaya parlak bir alan mikroskobu altında görüntülendi veya olabilirfloresan mikroskop altında değerlendirme öncesinde lekeleri. Bu yöntemin ve çipin bir büyük avantajı esnekliktir. İlk olarak, aşırı hücreler yıkanır, çünkü araştırmacılar, belli çalışma hücre konsantrasyonu ile sınırlı değildir ve mikrodizi homojen kuyruklu yıldıza yoğunluğu sağlar. İkinci olarak, mikro-farklı boyutlarda hücre türlerine uyum sağlamak için, farklı boyutlarda yapılabilir. Birden fazla hücre tek MicroWell yakalanır koşullar altında, çok hücreli kuyruklu kendini kalibre ve verimi, tutarlı sonuçlar, tek bir hücre kuyruklu 6,7 kıyasla,. Mikroarreylerinin hücreleri desenlendirme bir diğer yararı tüm kuyrukluyıldızların nedeniyle odaklanmamış kuyruklu gürültüyü azaltmak ve otomatik görüntüleme ve analiz kolaylaştıran, sabit pozisyonları ile aynı odak düzlemi sonra olmasıdır. CometChip sağladığı verim ve hassasiyet açısından önemli gelişmeler büyük ölçekli çalışmalar için, tahlilin uygulanmasını sağlar. Birlikte ele alındığında, çip sağlamakaraştırmacılar, toksikoloji, klinisyenler ve epidemiyologların DNA hasarı değerlendirmesi için sa değerli bir araçtır. Kuyrukluyıldız tahlil DNA hasarının geniş bir saptamada mükemmel hassasiyet için bilinen iken, bu deney aynı zamanda düşük özgüllüğü muzdarip. Bu protokol kullanılarak büyük ölçüde tahlilin tekrarlanabilirliğini ve veri akışını arttırır ancak spesifitede bir ilerleme anlamına gelmez. Bununla birlikte, diğer yöntemlerle, tahlil daha yüksek bir kesinlik elde etkili olduğu bildirilmiştir multiplekslemesi. Bir örnek saflaştırılmış lezyon-spesifik enzimlerin dahil. Bu enzimler tespit iplikli kırılmalara ve abasic sitelerine 1,19-21 içine aksi saptanamayan baz lezyonları dönüştürebilirsiniz. Yaygın kullanılan bir örnek oksidatif DNA değişiklikleri 19,22 ortaya onarım endonükleaz formamidopyrimidine-DNA glikosilaz (APG), olduğunu. Enzim sindirimi aşaması, hücre lizizi sonrasında uygulanır için, sistem aynı şekilde tedavi edilebilir aprotokole değişiklikler olmadan sa geleneksel agaroz slayt. Ayrıntılı bir protokol burada tarif edilmemiş olsa da, bu yaklaşım geçmişte birçok geleneksel kuyrukluyıldız tahlil kullanıcılar tarafından adapte edilmiş ve protokolleri kolaylıkla bulunabilir. Bir önceki yayın, floresan ışık hasarını 22 tanımlamak için bu yöntem kullanılır. Bu yöntemin en büyük avantajı, daha önce neredeyse imkansız olan çalışmalara kapılarını açıyor sağladığı verim vardır. Aynı platform üzerinde 96 örnekleri işleyen yeteneği değil, sadece emek ve zamanı azaltır, aynı zamanda deneysel gürültüyü azaltır ve büyük ölçüde tekrarlanmasını arttırır. Inter örnek varyasyon bu çip 6,7 ile gözlenen varyasyon daha 2 kat yüksek olabilir geleneksel slayt-to-slayt varyasyon, önemli ölçüde daha düşüktür. Azaltılmış gürültü de örnekler arasında daha ince farklar ortaya çıkarılmasını sağlayacak, gelişmiş duyarlılık yol açar. Cihaz bir sta istihdam çünkündard 96-iyi biçimi, genel araştırma ekipmanları ile uyumlu ve teknolojileri HTS. Ortalama bir araştırmacı ~ birkaç gün boyunca 30 cam slaytlar işleyebilir olduğunu varsayarak, 100 numune değerlendirmesini gerektiren bir çalışma düşünün. Her bir örnek üç kez gerçekleştirilmesi gereken olduğu göz önüne alındığında, bu da kaçınılmaz olarak örnek varyasyonu için numune muzdarip olan böyle bir çalışma tamamlamak için yaklaşık bir ay sürer. Bunun aksine, bu çip ile işleme koşulları 100, her biri üçlü halde, sadece bir kaç tabak gerektirir ve üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Geçirilendeki Bu önemli gelişme, daha önce ulaşılamaz olan çalışmalara kapıyı açar. Burada sunulan protokol, standart kuyrukluyıldız tahlilini yapmak için temel prosedürleri ve CometChip platformu kullanmak için gerekli modifiye adımları anlatılmaktadır. Doğal DNA hasar seviyelerini ve sonraki onarım yanıtı hem ölçmek için yeteneği ile, tahlil son derece alakalıbiyolojik ve klinik uygulama çeşitliliği. Genom üzerinde belirli kimyasal maruziyetin etkisi hakkında bilgiler, hastalıkların önlenmesi ve tedaviyi kolaylaştırır. Ayrıca, DNA hasarı duyarlılık ve bireyler 23,24 arasında onarım kapasitesinde varyasyonları belirlemede önemli ilgi de var. Bu teknik, büyük ölçekli çalışmalar için gerekli verimi sağlar. Arası bireysel varyasyonlar hakkında bilgi duyarlı insanları tanımlamak için ve bireyselleştirilmiş tedaviler veya önlemler stratejileri tasarlamak için önemlidir. Burada sunulan teknoloji yakın gelecekte bir standart metodoloji olma potansiyeline sahip, yüksek verim, objektif ve kantitatif DNA hasarı analiz platformu sağlar, birlikte ele alındığında.

Tek hücre jel elektroforezi (kuyruklu yıldız tahlil aka) (SCGE) deneyi baz lezyonlar, abasic siteler, tek iplikli kırılmalara, çift iplikli kırılmalara, çapraz bağlardan ve hassas alkali içeren DNA lezyonlarının, geniş bir yelpazenin ölçümü için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir siteleri. Deneyin temel ilkesi, Hasarlı DNA hasar DNA&#39;dan daha nedeniyle parçalanma ve süpersarmal yapısı kaybına daha kolaylıkla göç olmasıdır. Göç ölçüde DNA hasarının miktarı ile orantılıdır, ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Görüntü yakalama ve bireysel kuyrukluyıldız şeklindeki DNA yoğunluğu profili analizi, daha sonra bir hücreye 1-4 içindeki DNA hasarının seviyesini ortaya çıkarmak için kuyruk böyle kuyruk uzunluğu, kuyruk an, ve% DNA gibi parametre ölçümleri sağlar. A) alkalin kuyruklu yıldız tahlil ve b) nötr kuyruklu yıldız tahlil: Şu anda kuyruklu testin yaygın olarak kullanılan iki sürümü vardır. Alkalin kuyruklu yıldız tahlil en yaygın olduğuBöylece elektroforezden önce DNA gevşemek için yüksek pH tamponu kullanır ve kullanılan versiyonu, iplikli kırılmalara ve alkali-duyarlı sitelerin her türlü algılar. Bu çift helisleri korumak ve sadece çift tutam kırılmaları 2,5 tespit etmek için nötr bir tampon kullandığından nötr kuyruklu deney, diğer taraftan, daha az uygulanmaktadır. DSBs neden fiziksel ve kimyasal maddeler için, SSB&#39;ler uyum içinde oluşturulur, ve çok daha yüksek düzeyde oluşturulur (örneğin, γIR kaynaklı SSB&#39;ler DSBs daha fazla ortak bir büyüklük sırası vardır). Çoğu DNA zarar pozlarda, DSBs çok daha az sıklıkla DNA hasarının diğer sınıflara göre daha vardır ve dolayısıyla tespit etmek zordur. Biz önceki yayınlarda hem sürümlerinin algılama penceresini göstermiştir. 6,7 Kuyrukluyıldız tahlil rutin DNA hasarı ve onarımı ve genotoksisite testinin 1,2,8-15 temel araştırma için kullanılıyor olmasına rağmen, tahlil, numune-sı kötü tekrarlanabilirlik sahip bildirilmiştirörnek, kişiden kişiye ve lab-to-laboratuarı değişkenliği. Görüntü elde etme ve veri analizi zahmetli edilir olduğundan, deney düşük akış kısmen,. Birlikte, bu sınırlamalar geniş ölçekli çalışmalarda nispeten düşük kabul katkıda bulunur. Mühendislik teknolojileri ve ilkeleri entegrasyonu sayesinde, CometChip geleneksel kuyruklu testte 6,7 ile ilişkili verim sorunlarına ve tutarsızlıklar bir çözüm getiriyor. Kısaca, çip oluşturmak için bir kalıp tek bir hücrenin bu kadar küçük çaplı microposts oluşturmak için fotolitografi kullanımıyla mikrofabrike edilir. Kalıp daha sonra jel katılaşmasından sonra mikro oyuk bir dizi ile sonuçlanan, erimiş agaroz üzerine eklemek için kullanılır. Cips farklı hücre tipleri ile uyumlu değişken boyutlu kuyuları ile araştırmacılara sunmak için geliştirilmektedir. Çip yüklemek için, ortam içinde hücreler, yerçekimi ile kuyu içine yerleşmek için izin verilir; fazla hücreler yıkanarak uzaklaştırılmıştır. Trapped hücreler daha sonra bizi kapsüllüdüşük erime noktasına sahip ince bir tabaka ing ve dipsiz 96 oyuklu bir plaka daha sonra, alt yüzeyi üzerinde mikro oyuk yüzlerce 96 macrowells, her birini yaratmak için jel yüzeyine kenetlenir. Bu protokol jel hazırlama, hücre yükleme, dozajlama ve onarım, hücre parçalanması, elektroforez ve floresan görüntüleme içeren bu yonga ile deneyler için genel prosedürler açıklanmaktadır. Biz alkali ve sırasıyla tahlil nötr sürümlerini kullanan, bilinen DNA zarar veren ajanlar maruz lenfoblast hücreleri ile doz tepki deneyleri iki örnek göstermektedir. İki onarım deneyleri de onarım tepki maruziyet sonrası sistemi kullanılarak değerlendirilebilir nasıl açıklamak için gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">UltraPure LMP Agarose (low melting point)</td>
			<td style="width:129px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16520</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td style="width:129px;">Gibco by life technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaCl</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7581-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Na2EDTA</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">4931-04</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (base)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline Tris (acid)</td>
			<td style="width:129px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:101px;">4106</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline N-lauroylsarcosine</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L9150</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">X100</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D4540</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Crystalline NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Macron Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">7708-06</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">BDH3871</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Crystalline boric acid</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B6768</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Name of Equipments</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:373px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">CometChip</td>
			<td style="width:129px;">Trevigen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1-well dish</td>
			<td style="width:129px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:101px;">73521-420</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Bottomless 96-wel plate</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">655000-06</td>
			<td style="width:373px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5&#8243; binder clips</td>
			<td style="width:129px;">Staples</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass plate</td>
			<td style="width:129px;">Tag Hardware</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:373px;">Customized to size of 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Owl Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">27372-131</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">164-5050</td>
			<td style="width:373px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cometchip: a high-throughput 96-well platform for measuring dna damage in microarrayed human cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

Bu birinci örnekte, H2O 2 kullanılarak oksidatif hasara maruz kaldıktan sonra, insan limfoblastoid hücrelerde DNA hasarına başlangıç ​​seviyelerinin ölçülmesi için yöntem anlatılmaktadır. H2O 2 ile indüklenen taban lezyonları ve tek kordonlu kırılmaları değerlendirmek amacıyla, alkali kuyruklu koşullar kullanılır. Yükleme tamamlandıktan ve hücreler agaroz kaplaması ile kapsüllenmiş sonra, tabanı olmayan 96 oyuklu bir plaka çip üzerinde 96-bölme oluşturmak için yüzey üzerine bastırılır. 96-deliklerin her biri farklı bir türü ya da kimyasalların konsantrasyonu ile dozlanabilir. Burada H2O 2 dört ayrı dozu kullanılmıştır ve 1 x PBS, negatif kontrol olarak kullanıldı. Dizilmiş kuyruklu temsili görüntüleri arıtılmamış Şekil 1A, (üst), 50 uM (orta) ve 100 uM (alt) H2O 2 -exposed örnekleri kuyruklu kuyrukları farklı seviyelerde ortaya gösterilmiştir. Kuyruklu görüntü analizi performan- edilebilirgenellikle her kuyrukluyıldız kuyruk toplam floresan yoğunluğu ve göç mesafeye göre hasar seviyelerini rakamlarla piyasada mevcut yazılımını kullanarak med. Ölçümler genel olarak hesaplanır 50-100 koşul başına kuyruklu ve medyan değeri (ya% kuyruk DNA ya da kuyruk uzunluğu) üzerinde gerçekleştirilir. Şekil 1B H dört farklı konsantrasyonlarına maruz TK6 lenfoblastoid hücre kuyruklu analiz yüzde kuyruk DNA yanıt eğrisini görüntülemektedir 2 O 2. Bağımsız deneyler arasındaki tutarlılık hücrelerinde kimyasal tedaviler çeşitli düzeylerde DNA hasarı yanıtını değerlendirirken bu yaklaşımın etkinliğini göstermektedir. (Macrowells arasında örneğin) ve aynı deney tekrarları arasında örnekleri arasındaki varyasyon hakkında bilgi edinmek için, inter-örnek ve inter-deneysel değişkenlik sırasıyla Şekil 2A ve 2B çizildi. 96-W her bir deney içinde, her bir gözeell çip farklı bir örneklem eşdeğerdir ve bu nedenle iyi-kuyu varyasyon cihazın arası örnek varyasyonunu göstermektedir. Burada, 96 oyuklu çip 12 kuyu yüklü hücreler TK6 H2O 2 aynı dozu ile muamele edilmiş ve tedaviden hemen sonra lize edildi. Diğer tüm adımlar deney paralel olarak gerçekleştirilmiş ve her bir macrowell en az 50 kuyruklu medians Şekil 2A&#39;da çizilmiştir. Standart sapma 3.99% olan ile medyan ortalama kuyruk 77.53% DNA. Bu verilere göre, örnekler arasında değişkenlik katsayısı Bu deneyde 6,16 geliştirilmiş sağlamlığı gösteren, geleneksel ölçümüne göre birkaç kat daha düşük olan% 5.2 olduğunu hesaplayabilir. Tahlil tekrarlanabilirliği hakkında bilgi edinmek için, 75 uM, H2O ile 2 parçası içinde TK6 hücrelerin maruz kalan ve DNA hasar anında seviyesinin analiz edilmesi. Bu deney, her deney altı kez F ve veri grafiği çizilmiştir tekrarlandıŞEKIL 2B. Aynı deneysel koşullar altında, biz şekildeki gri çubuklar olarak gösterilen, 57.87% 41.76% kadar uzanan sonuçlar elde. Altı tekrar ortalama sadece% 2.04 olan ortalama standart hata ile, 49.57% &#39;dir. Tekrarlar arasındaki varyasyonu düşük bu yeni aygıt üzerinde gerçekleştirilen kuyrukluyıldız deney yüksek tekrarlanabilir olduğunu ima eder. Onarım kinetiğini değerlendirmek için, hücreler tedaviden sonra taze medyada kendi DNA onarmak için izin verilir. Çeşitli zaman noktalarında macrowells yokedici zaman DNA hasarına değişikliği ortaya koymaktadır. Bir örneği Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu deneyde, hücreler ilk TK6, çip kapatıldığı 50 uM, H2O 2 ile muamele edilmiş ve 60 dakika sonraki maruz kalma kadar tamir edilmesine bırakılmıştır. Hücreler, sırasıyla 0, 20, 45 ve 60 dakikada parçalanmıştır. Farklı zaman noktalarında Örnek kuyruklu görsel Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir, ve zaman içinde, DNA hasarı seviyelerinde değişiklik, Şekil çizilmiştir3B. Bu veriler neredeyse tüm hasar 2 O 2 tedavisi 45 dakika sonrası H içinde tamir olduğunu ortaya koydu. Pek çok değişken hücre hattı ve ikinci kimyasal madde tipi de dahil olmak üzere, tamir hızını etkileyebilir. Bu nedenle araştırmacılar protokolü (yani, onarım süresini uzatmak) soruşturmalarında ek ihtiyaçlarını karşılamak için değişiklik yapabilir. Burada 7-metilguanin lezyonlar da dahil olmak üzere temel neden olduğu bilinen bir alkilasyon maddesi TK6 hücreler farklı genotoksik madde N-metil-N &#39;Nitro- K -Nitrosoguanidine (MNNG) ile tehdit burada çipi kullanılarak tamir deney başka bir örneği sağlamak ve 3-metiladenin. Bu lezyonlar kendiliğinden depürinasyon ile ya da DNA glikolazdan ile enzimatik olarak ayrılması ile ya da the abazik dönüştürülür. Elde edilen abazik bölgenin sokulmasını içerir alkalin koşullar altında ayrılır ve böylece çip üzerinde tespit edilebilir. Başlangıç ​​maruz uzunluğunda belirgin hasarına önemli bir artış neden olurhücreler onarım sırasında bütün DNA&#39;yı geri olarak kuyrukları ve zaman içinde bu kuyrukları azalır. Alkilasyon ve oksidatif hasar iki esas olarak baz eksizyon onarım yolağı ile tamir edilir, ancak oluşturulan lezyonların miktarı ve onarımında rol oynayan proteinlerin değişir. Bu varyasyonlar, the yanı sıra, elde edilen abazik sitelerinin tamir farklı oranlarda abazik dönüşüm farklı oranlarına yol açabilir. Şekil 4&#39;te, TK6 hücre onarım kinetiği 0.1, 1, maruz bırakılır ve MNNG 3 ug / ml gösterilmiştir. MNNG kaynaklı hasar uzun bir süre kalıcı görünür ve H 2 O 2 -kaynaklı hasar kıyasla daha yavaş bir hızda temizlenir çünkü bu deneyde, biz 2 saat sonrası maruz kalma deney süresini uzattı. Nötr koşullar kullanılarak DSBs analizi alkalin koşulları kullanılarak tek kordonlu lezyonların analizi için protokole benzer. Ilk hasar düzeylerini göstermek için, TK6 hücreler gir değişken seviyeleri maruz bırakıldı,<html> ve elde edilen hücreler lize edildi ve bir nötr pH değerine (Şekil 5A) ile elektroforez işlemine tabi tutuldu. Bu kuyruklu kuyrukları morfolojisi alkalin deney koşullarında farklı olması dikkat çekicidir. Bu yöntem kullanılarak gözlemlenebilir parçalanmış DNA&#39;nın elde edilmesi için, kullanılan IR dozu alkalin koşulları kullanılarak hasarı görmek için gerekli dozdan daha (0-100 Gy) önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, kuyruk uzunluğu nötr kuyruklu tahlil 7 kullanıldığında, DNA hasarının derecesini yansıtan en duyarlı bir parametre olduğunu bulmuşlardır. Analiz edilen doz-yanıt eğrisi, Şekil 5B&#39;de gösterilmektedir. Hücrelerde DNA çift iplik kırılmalarının tamiri de tespit edilebilir ve Weingeist ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. ark. 7. Birlikte ele alındığında, nötr CometChip DNA DSBs yüksek verimlilik analizi için değerli bir araç sunuyor. 1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Şekil 1. H2O 2 doz alkali kuyruklu deneyi kullanılarak TK6 hücre cevabı. (A) 50 uM (orta) ve 100 uM maruz işlenmemiş TK6 lenfoblastların (üst) ve TK6 hücreleri (alt) H2O 2&#39;den dizilmiş mikro kuyruklu 4 ° C&#39;de 20 dakika karıştırıldı. Ölçek çubuğu 100 mikron. (B) Y, H2O 2 çeşitli seviyesine maruz TK6 hücre 2 O 2 doz tepkisi. Her veri noktası, en az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA, her bir deneyde de elde edilmiştir, üç bağımsız deneyin, ortalamasıdır. Hata çubukları üç bağımsız deneyler ortalamanın standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Inter-Numune ve Inter-Deneysel Değişkenlik. (A) Örnek-to-Örnek varyasyon. TK6 insan lenfoblast hücreleri 96 oyuklu çip 12 kuyu içine yüklenmiştir. Her bir kuyucuk 50 uM H 100 ul maruz bırakılmıştır 2 O2 4 ° C&#39;de 20 dakika karıştırıldı. Hücre yok edilmekte ve hemen% Kuyruk DNA için analiz edilmiştir. Her çukurun veriler aşağıda gösterilmektedir. Her kutu medyan her kuyudan en az 50 bireysel kuyrukluyıldızların temsil eder. 12 kuyu ortalama ± standart sapma% 3.99 ve varyasyon katsayısı% 5.2 olduğu hesaplanır, 77.53% &#39;dir. (B) Deney-to-Deneyi varyasyon. TK6 insan lenfoblast hücreleri 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 75 uM H2O 2 100 ul maruz kalan, 96 oyuklu bir çip halinde yüklenmiştir. Hücre yok edilmekte ve hemen% Kuyruk DNA için analiz edilmiştir.Aynı deney, 6 kere tekrar edildi ve her bir tekrar veri gri bir çubuk olarak gösterilir. Her kutu, her tekrarında en az 100 bireysel kuyrukluyıldızların ortalama% kuyruk DNA temsil eder. 6 tekrarlarının ortalama burada tekrar bar olarak gösterilen, 49.57% &#39;dir. 6 tekrarlarının standart sapması% 4.99, ve ortalamanın standart hatası, şekil hata çubuğu olarak temsil edilen,% 2.04 olduğu hesaplanır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> TK6 lenfoblastlardaki Şekil 3. H tamiri 2 O 2 -kaynaklı hasar. (A) şematik temsili kuyruklu yıldız ile tamir çalışma. TK6 hücreleri hasar maddeleri ile muamele edildi ve liziz önce 37 ° C &#39;de ortam içinde onarmak için izin verilir. (B) 4 ve # 20 dakika boyunca 50 uM, H2O ile muamele edildikten sonra 2 TK6 hücre onarım kinetiği176 C. Her veri noktası, en az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA, her bir deneyde de elde edilmiştir, üç bağımsız deneyin, ortalamasıdır. Hata çubukları yinelenen deneylerden ortalamanın standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> TK6 lenfoblastlardaki MNNG kaynaklanan hasarı Şekil 4,. Tamiri. TK6 hücreler, 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 0.1, 1 ve 3 mg / ml MNNG ile muamele edilmiş ve 120 dakika mesaja kadar 37 ° C&#39;de ortam içinde onarmak için izin verilen maruz kalma. En az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA&#39;sının üç bağımsız deneyin her biri için elde edilmiştir. Hata çubukları, standart hatayı temsil ederÜç bağımsız deneyden ortalamanın. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> 40 Gy (orta) ve 80 Gy (alt) gama ışımasına maruz işlenmemiş TK6 lenfoblastların (üst) ve TK6 hücrelerden Şekil 5. Nötr kuyruklu deneyi kullanılarak TK6 hücre İR doz tepkisi. (A), bir mikro dizilmiş kuyruklu. Ölçek çubuğu 100 mikron. Işınlamanın çeşitli seviyesine maruz TK6 hücreleri (B), İR doz tepkisi. Her veri noktası çip üzerinde altı macrowells toplanan en az 300 kuyrukluyıldızların medyan kuyruk uzunluğu (um) temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells at JoVE.com

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K Görüntüleme.  Massachusetts Institute of Technology.  Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır. 

Video: CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Biyomühendislik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...