Adım Dr. Shankari Nair ve NRF, iThemba LABS Nükleer Tıp Bölümü Radyasyon Biyofizik Bölümü'nde doktora sonrası araştırmacıyım. Bu videoda, toplu simetri uygulamalarında kullanımı için insan periferik kan lenfositleri üzerinde otomatik gama H2AX odak tahlilinin kullanımını göstereceğiz. Personel için radyasyon riskleri kesinlikle kontrol edilir.
İyonlaştırıcı radyasyon, DNA kırılmalarını indükleyerek DNA'nın yapısını doğrudan etkiler. Özellikle çift iplikçik kopuyor. DNA çift iplikçik kırılma tanıma sürecindeki en erken adımlardan biri, histone varyantı H2AX'ın fosforilizasyonu ve onarım proteinlerinin işe alınmasıdır.
Bu video, floresan mikroskobu entegre eden otomatik bir slayt tarama sistemi ve analiz platformu kullanarak Gama-H2AX odak reci ren-nucleus sayısını puanlamak için mikroskopi kullanımını özetleyecektir. Lenfositler tam kandan izole edilir. PBS ile tüm kanı bire bir oranında seyreltin, ardından seyreltilmiş kanı bir yoğunluk gradyan ortamı hacmine hafifçe yatırın.
Tüpü 45 derecede tutarak kanı yavaş yavaş katmanlayın. Süspansiyonu bir santrifüje aktarın ve oda sıcaklığında 900 G'de 20 dakika döndürün.Merkezlemeden sonra dört katman oluşacaktır. Lenfositleri içeren bulutlu tabakayı yeni bir steril konik tüpe dikkatlice aktarın.
Lenfositleri PBS ile yıkayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Toplam lenfosit sayısı belirlendikten sonra, lenfosit ve süspansiyonu bir mililitrelik tam RPMI'de yaklaşık 800.000 lenfosit konsantrasyonuna seyreltin. Örnekler ve radyasyonumuz için hazırlar.
Lenfositler kobalt 60 kaynağından gama ışınları ile ışınlanır ve daha sonra nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırılır. Her ışınlama durumu veya tüpü için üç slayt hazırlanır. Slaytı klips tutucusuna, ardından filtre kartına ve son olarak huniye yerleştirin.
Slayt kliplerini sabitleyin ve sito-santrifüje yerleştirin. Her huni üzerine 250 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve beş dakika boyunca 30 G döndürün. Sito-santrifüj kullanımı, slayt otomasyonunda standartlaştırılmış koşullar elde etmek için gereklidir.
Döndükten sonra, slaytları klipsten çıkarın ve ardından hidrofobik kalemi kullanarak hücrelerin bulunduğu noktanın etrafına bir daire çizin. Slaytlar yapıldığına göre, hücrelerin slayta sabitlenebilmesi gerekir, böylece immünoresan lekeleme meydana gelebilir. Hücreler %3 paraformaldehit veya PFA ve 20 dakika boyunca PBS çözeltisi kullanılarak sabitlenir.
Fiksasyondan sonra, PBS'li bir Coplin kavanozunda slaytları beş dakika boyunca yıkayın. Ardından, permeabilizasyona izin vermek için hücreleri Triton X ile örtün. Permeabilizasyon adımı, antikorların hücre çekirdeğinin içine girmesine izin vermek için daha fazla hücresel zar lipidini temizler.
Bundan sonra, potansiyel spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için slaytları yıkamak için PBS'de%1 BSA'dan yapılmış bir engelleme çözümü kullanıyoruz. %1 BSA ve PBS ile 10 dakikalık üç yıkama adımından sonra, slaytlar oda sıcaklığında bir ila 500 birincil gama önleyici H2AX antikoru ile nemlendirici haznede bir saat boyunca inkübe edilir ve dikdörtgen slayt saklama kutusunun tabanına ıslak kağıt eklenerek kolayca gerçekleştirilir. Birincil antikor ile inkübasyondan sonra, sıvıyı ucun ve slaytları tekrar% 1 BSA çözeltisinde yıkayın.
Nemlendirici haznede bir saat boyunca bir ila bin seyreltilmiş ikincil eşek anti-fare TRITC antikoru ile slaytları kuluçkaya bırakın. PBS'de üç, 10 dakikalık yıkamalar yapmadan önce antikorun çıkarılmasını bekleyin. Yıkama adımları süresince ışığa maruz kalmayı önlemek için Coplin kavanozu alüminyum folyo ile örtün.
Slaytları çıkarın ve hidrofobik dairenin dışındaki fazla PBS'yi tozsuz kağıt mendille silin. Son olarak, bir ila iki damla DAPI ekleyin, bu da kabul montaj ortamına neden oldu ve slaytları kapak kaymasıyla hafifçe örtün. Sıkışmış hava kabarcıkları olmadığından emin olun ve ardından numuneleri gece boyunca dört derecelik karanlık bir yerde saklayın.
Slaytları %70 etanol ile hafifçe silin ve slaytları otomatik tarama platformuna veya zite eksenel görüntüler ZED-2 mikroskobuna bağlı slayt aşamasına yerleştirin. Sınıflandırıcıyı düzenlemek için MetaSit sekmesinin altındaki sınıflandırma kurulumını seçin. Seçilen sınıflandırıcı, slaytları taramak ve puanlamak için sistem tarafından kullanılacaktır ve sistemin hücreleri nasıl seçtiğini ve odakları nasıl puanladığını belirleyecek önceden tanımlanmış bir dizi parametreyi temel almaktadır.
Sınıflandırıcı, önceden sınıflandırılmış bir dizi görüntü alanına göre optimize edilebilir ve eğitilebilir. Mikroskop büyütmeye, boyama için kullanılan antikorların türüne ve antikorlarına bağlı olarak, farklı bir sınıflandırıcı optimize edilebilir. Bu nedenle sınıflandırıcılar genellikle laboratuvardan laboratuvara değişir, ancak bir sınıflandırıcı kurulumunun ayarlanması gerektiğinde dikkate alınması gereken en temel adımlara genel bir bakış vereceğiz.
Yakalama'sekmesi altında, en fazla 1,04 saniyelik entegrasyon süresiyle dapi ve TRITC'de kullanılacak filtreyi bulabilirsiniz. İkincisi, şirket tarafından sağlanan ve daha sonra bu spesifik hücre tipinde, yani lenfositlerde antikor yoğunluğu ve arka plan gama H2AX veya TRITC sinyali için ayarlanan orijinal sınıflandırıcıya dayanmaktadır. Pozlama'sekmesi altında, en az tümleştirme süresi tanımlanır.
Sınıflandırıcı her zaman slaydın aşırı veya az pozlanmasını önleyen minimum ve maksimum tümleştirme süresi içinde kalır. Hücre Seçimi'sekmesi altında, en küçük ve en fazla nesne alanları, analiz edilen hücrelerin boyutuna ve şekline göre tanımlanmıştır. Örneğin, önceden belirlenmiş konsavite değeri ve en boy oranı, genellikle yuvarlak şekillere sahip lenfositler için spesifiktir.
Özellikler'sekmesi altında, galeri ve histogram görünümünü değiştirebilir ve mikroskobun puanlamak için neye ihtiyacı olduğunu belirleyebilirsiniz. Sistem, kullanıcının seçtiği özelliklere bağlı olarak çok sayıda öğe puanlayabilir. Bir örnek, yazılımın tek tek nesneleri nasıl puanlatılacağının eşiğidir.
Uygun bir sınıflandırıcı belirlendikten sonra, kenar çubuğundaki kurulumu seçin ve her slayda benzersiz bir ad verin ve ardından uygun sınıflandırıcının seçimi. En Fazla Hücre Sayısı'nı seçin ve taranmak için gereken en fazla hücre sayısını ekleyin. Seçilen arama penceresi henüz tam olarak taranmamış olsa bile, maksimum hücre sayısına ulaşılır ulaşılmaz arama sonlandırılır.
Biyo-dissimetri uygulamaları için, kan örneği başına üç slayt hazırlandığı düşünüldüğünde, slayt başına 1000 hücrenin otomatik puanlaması yeterlidir. Ayarları onaylamak için Tamam'ı tıklatın. Slaytları taramak için kenar çubuğunda Ara'yı seçin.
Slayt kurulumunda El ile Arama Penceresi' ayarı seçilmişse, tarama alanının belirlenmesi için bir iletişim kutusu bir satır açar. 10 kez amaç kullanılarak, slayttaki dikdörtgen arama alanı, arama alanının iki köşesini farenin sol tıklatmasıyla sabitlenerek etkileşimli olarak seçilir. Bu, Ok'butonu ile onaylanabilir.
Odak başlangıç konumunu ayarlayın. Yazılım, her slayt için 40 kez hedefi kullanarak bir odak isteyecek ve bir referans çekirdeğini ortalayacak ve ayarları Tamam ile onaylayacaktır. Sistem otomatik olarak her tarafa sırayla hareket edecektir. Gerekirse, bu adım için Canlı Görüntü Kurulumu'nu ve Tümleştirme Süresi'ni ayarlayın.
Tüm mikroskop ayarlarını kontrol edin. Mikroskop tüpünün kolunun tüm ışığı kameraya yönlendiren bir konumda olduğundan emin olun ve sistem istemini Tamam ile onaylayın. Sistem, kılavuz otomatik netlemeyi referans alanına en yakın ızgara konumunda başlatır. Alanı normal ızgaraya odaklamaya devam eder, arama penceresinin önüne ve arkasına doğru bir menderes halinde hareket eder.
Tarama, ızgara otomatik odaklama tamamlandığında başlar. Aşama, verileri yakalamak için alandan sonra bir menderes deseni alanında taşınır. Bir hücre algılandığında, konumlanır ve galeri görüntüsü ekranda depolanır ve görüntülenir ve hücre sayısı güncelleştirilir.
Aramanın tamamı taranmışsa, en fazla hücre sayısına ulaşılmışsa veya arama iptal edilmişse arama sonlandırılır. Tarama tamamlandığında, alttaki çubuğu sağ tıklatın ve bir örnek açın. Algılanan hücrelerin küçük görüntülerinden oluşan galeriyi gözden geçirin.
Bu pencerede, açılır menüden seçilecek ölçüt aracılığıyla galeride depolanan hücreleri belirtebilirsiniz. Hücreler genellikle algılandıkları sırayla görüntülenir. Tespit edilen hücrelerin dağılımını, araçları ve puanlanan odakların standart sapmasını vermek için Kalite Histogram'veya Özellik Değer Diyagramı'nı tıklayın.
Burada sıfır gri ile 1,5 gri örneği karşılaştırıyoruz. Bu genellikle, hücrenin ışınlanmamış olduğu, hücre başına ortalama değeri 0,124 odak olan bir denetim slaydıdır. Biyo-dissimetri bağlamında, bu bir kişinin yüksek doz radyasyona maruz kalmadığını gösterir.
Grafikte, hücrelerin çoğunluğunun hücre başına neredeyse sıfır odak noktasına sahip olduğunu ve normal dağılımın bir tarafı olmadığını görebiliriz. Bunu 1,5 gri dozla karşılaştırdığımızda, bunun ışınlanmış bir örnek olduğu açıkça görülebilir. Biyo-dissimetri bağlamında, bu normal dağılım, numunenin radyasyona maruz kaldığının açık bir işaretidir.
Otomatik tarama, odakların düşük dozlarda neden olduğunu tespit edecek kadar hassastır. Sonuçlar, doz ile hücre başına odak sayısının net bir doğrusal artışını göstermektedir. DNA çift iplikçik kırma algılamanın otomatik yöntemi, hızlı ve yüksek verimli biyolojik dissimetri uygulamaları için yararlıdır.
İzlediğiniz için teşekkür ederim.
