Name: the tomato/gfp-flp/frt method for live imaging of mosaic adult drosophila photoreceptor cells
Uploaded: 2013-09-20T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells at JoVE.com

Fransa UMS3444 Biosciences, Lyon, ve PLATIM ve Droso-Tools tesisleri. Barlar ücretsiz araştırma Fondation hibe tarafından desteklenmiştir CNRS (ATIP) dan la Recherche Médicale dökün ve ANR-12-BSV1-0019-01&#39;dir. PD Retina Fransa dernek ve Lyon Ecole Normale Supérieure (Fransa) tarafından desteklenmiştir. CL La Ligue Nationale contre le Kanser derneği tarafından desteklenmiştir.

1.. Domates / GFP-FLP / FRT Hatları ile Geçişi Mutant klon taşıyan sinekler nesil bir FRT-taşıyan mutant hattı ve ilgili Domates / GFP-FLP / FRT hat sinek arasında tek bir çapraz gerektirir. Bu çalışma FRT-recombined mutasyonların BruinFly koleksiyonu (kullanılmaktadır <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">http://www.bruinfly.ucla.edu</a> ). Dört Domates / GFP-FLP / FRT hatları flipase kaynağı (ey-FLP) ve tüm dış PR &#39;(RH1-Gal4 UAS GFP ekspresyonu ile birlikte, her biri 2 kolları ve 3 kromozomlar üzerine FRT RH1-tdtomatoninaC taşıma kullanılabilir -GFP) 20: - 2L kol: çizgi # 43345, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 40A; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3 - 2R kol: çizgi # 43346, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} [*] w 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2; P {ry [t7.2 +] = neoFRT} 42D P{W [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 3 - 3L kol: çizgi # 43347, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2; P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, Tb [1] - 3R kol: çizgi # 43348, P {ry [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ry [+ t7.2] = ey-FLP.N} 2, w [*]; P {w [+ mC] = UAS-GFP-ninaC} 2; P {ry [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {w [+ mC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, Tb [1] Bu dört hat Bloomington Drosophila stok merkezi mevcuttur. Bunlar, mitotik klon 21 jenerasyonu için gelişmekte olan göz FLP kaynağı sağladı. Yabani-tip kromozom bir FRT sekansını taşıyan ve bir RH1-tdTomato ninaC vahşi tip ve heterozigot dış PR &#39;için bir işaretleyici olarak, kırmızı floresan proteini şifreleyen yapı tdTomato. Bu yapıda, ninaC en P174 izoformu, son 41 amino asitler (inaktivasyon veya aktivasyon de C) geni ap idiin-çerçeve tdTomato sekansının C-terminaline pended. P174 ninaC izoformun C-terminal kuyruk rhabdomeral proteinin 22 lokalizasyonu ve izinlerin kornea nötralizasyon tekniği kullanılarak kırmızı floresan PRs daha iyi canlı görselleştirme sorumludur. RH1 organizatörü az 234 bp (-152 +82) RH1 destekleyicisidir. Yeşil fluoresan işaretleyici GFP nedeniyle RH1-Gal4 (3kb promoter) ve UAS-GFP ninaC konstruktlarının varlığına bağlı olarak, tüm dış PRs ile ifade edilir. RH1-Gal4, ey-FLP: FRT kromozom (FRT-x) ve domates / GFP-FLP / FRT hatlarında bir mutasyon taşıyan bir uçucu x stok kırmasına aşağıdaki genotipe (2L mutasyonun örnek olarak verilmiştir) olan bir döl verimleri , FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x, UAS-GFP ninaC. Bu sinekler olarak, homozigoz mutant hücrelerin gelişmekte olan göz diski mitotik rekombinasyon tarafından üretilen ve homozigoz mutant PRs bir klon (Şekil 2A) oluşturmak için bölme vardır. Homoçevredeki vahşi tip ve heterozigot hücre tdTomato ve GFP (Şekil 2B ve B &quot;), her ikisi de ifade oysa bunlar, yeşil floresan proteini (GFP) için ifade zygous mutant hücreleri belirlenebilir. 2. Fotoreseptör Görselleştirme Drosophila hazırlanıyor Kornea nötrleştirme tekniği ile PR görselleştirme için, agaroz plakalar üzerine sinekler hareketsiz. <ol><li> 4 ° C damıtık su ile dolu bir yıkama şişesi hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Bir mikrodalga içinde ısıtılarak su içinde düzenli olarak agaroz (100 ml su içinde% 1.2-1.5 agaroz) çözülür. 55 ° C&#39;de bir su banyosu içinde şişeyi yerleştirin ve agaroz çözelti, bu sıcaklıkta soğumaya bırakın. Kullanılana kadar 55 ° C &#39;de agaroz tutun. </li><li> En az 1 dakika için CO2 ile sinekler anestezisi. </li><li> Bir Petri kutusu (35 x 10 mm, 1.37 x 0.39) içine (55 ° C) sıcak agaroz çözeltisi dökün ve derhal yerrilmesi agaroz Drosophila anestezi uygulandı. Yeni başlayanlar için, Petri tabağında başına 10 sinekler ile başlayan makul. Daha büyük Petri kabı (60 x 15 mm, içinde 2,362 x 0.59) da kullanılabilir. </li><li> Bir mikroskop altında, forseps ile yan Drosophila yönlendirmek agaroz içine bir itme kanat, vücut kanat ve yarım agaroz (Şekiller 3A-3A &quot;&quot;) gömülü şekildedir. Agaroz yüzeyi üzerine, diğer kanat sopa. Not: sinekler agaroz yeterince derin gömülü değilse, sinek PR görüntüleme sırasında kafasını taşımak için ücretsiz olacak ve bu bulanık görüntüye neden olur. Gözün yönü de rahatsız olacaktır. Bu nedeniyle agaroz konsantrasyonu ya da sıcaklık ya da için, agaroz içine Drosophila atılmak için zor olabilir. Bu, daha konsantre bir agaroz sinekler gömmek için daha kolaydır, fakat agaroz çok konsantre edilir ise, sinek batabilir. Agaroz çok soğuk ise, di olabilirsinek gömmek için fficult, ancak çok yüksek bir sıcaklıkta korneaya zarar verebilir. </li><li> Buz üzerinde Petri kabı koyun ve agaroz katılaşmaya izin. </li><li> Forseps ile bir göz batırma objektifi maruz kalan ve bu şekilde, kafa (Şekil 3A &#39;ve 3A &quot;&quot;) yönlendirmek. Genel olarak, göz (siyah nokta olarak görüntülenmiştir) pseudopupil gözün ortasında olduğunda de tahlil mikroskobu altında yönlendirilmiş olarak kabul edilebilir. Gözün optimum yönlendirme PR odaklı edildiği ommatidial alanının genişliğini en üst düzeye çıkarır. Yönlendirme aşamasının amacı, genellikle gözün merkezinde, odaklanmış PRs en geniş alanı ile gözün bölge bulmaktır. Bu aşama, aynı zamanda herhangi bir bacaklar kaldırılması için ya da göz kapsayan ve görselleştirme önlenmesi aristae yararlıdır. </li><li> Buz soğukluğunda su ile sinek örtün ve görselleştirme kadar buz üzerinde Petri kabı bırakın. Buz soğuk su anestezi sinekler tutar. </li></ol> 3. GörselleştirmeMikroskop altında Fotoreseptörler Korneadan PRs görüntülenmesi için, bu protokol, uzun bir çalışma mesafesi (W N-Achroplan 40X/0.75) ile suda objektif ile donatılmış dik bir mikroskop kullanılır. <ol><li> Mikroskop sahnede bir cam slayt üzerinde buz gibi soğuk su ile kaplı Petri yerleştirin (3 M.Ö. Şekiller). Petri kutusu mümkün mikrometre vida ile ilgili düzgün hareket yapma, cam slayta yapıştırılmış olabilir. </li><li> Petri kabı (Şekiller 3B&#39;-3C &#39;) ne sahip suya daldırma objektif daldırın. (Örneğin, GFP filtresi ile başlar) uyarma kirişin altında sineğin baş yerleştirin. Işın göze yakınsar kadar aşağı ve yukarı sahneye taşımak. Göz doğru düzeyde olduğu zaman, bu uyarım ışık yansıtır. </li><li> Floresan için mercek aracılığıyla bakmak. Göz görüş alanının merkezinde konumlandırıldığında, aşağıdaki odakfloresan fotoreseptörlere görselleştirmek için kornea. </li></ol> Not 1: göz merceği ile bakıldığında, örneğin, sinek, özellikle karın distalini ve başın vücut parçaları ayırmak için huzursuz olabilir. Böyle durumlarda, Drosophila yeniden konumlandırmak için aşamada doğrudan bakmak gerekir. Not 2: Klasik floresan veya konfokal mikroskopi kullanılabilir. Mikroskopisi klasik mikroskopi daha az arka plan ve odaklanmış PRs daha geniş bir alan ile görüntü verir. Bir örnek set-up 40X su amacı ile bir LSM510 konfokal mikroskop (Zeiss) &#39;dir. Daha iyi sonuçlar genellikle amaç için önerilir daha geniş konfokal mikroskop iğne deliği açılmasıyla elde edilebilir. Örneğin, oldukça iğne deliği açıklığı için varsayılan 98&#39;den, 204 bir değerini kullanın. Not 3: gözün w + pigmentasyon yüksek düzeyde arka floresan azaltır. </p&gt; 4. Fotoreseptör hücrelerinin zaman ders Görselleştirme Bir süre içinde aynı göz içinde tek bir PR kaderini aşağıdaki zaman bakım gereklidir. <ol><li> Drosophila hayatta en üst düzeye çıkarmak için, 45 ° C agaroz sıcaklığını azaltır. Agaroz bu sıcaklıkta çok hızlı bir şekilde katılaşır. Sadece bir Drosophila sinekler gözlem sırasında karışık emin olmak için, Petri tabağı başına kullanılmalıdır. </li><li> Sistematik olarak aynı göz görüntüleme için, aynı tarafta sinekler yerleştirin. Bu bir kanat tarafından şişesinden, anestezi uygulanmış sinek alarak ve agaroz üzerinde Drosophila yerleştirerek elde edilebilir. Her zaman kolay önce görülmüşlerdir PR klonlar bulmak için yapım, aynı şekilde mümkünse de göz yönlendirin. </li><li> Konfokal mikroskop altında şekli temelinde klonları tanımlamak. Görüş alanı genellikle ilgi klonu yanında yer almaktadır. SÜ&#39;dech durumlarda, göz gözün polarite (Şekil 4) bağlı olarak, ilgi konusu klonu üzerinde görüş alanını merkezi, su altında yeniden şekillendirilmelidir. </li></ol> 5. Görselleştirme sonra Sinekler kurtarma <ol><li> Petri kabı su çıkarın. </li><li> Forseps ile yavaşça agaroz dışarı Drosophila çekin. </li><li> Doku üzerine Drosophila kurutun. </li><li> Bu gıda sıkışmış almaz sağlanması, bir şişeye Drosophila dönün. Sinek 25 ° C&#39;de yuvarlak gelmek için izin </li></ol>

<ol>
	<li>Hardie, R. C., Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sensory physiology 5. 5, 1-79 (1985).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+normal+and+rough+eye+mutants+of+Drosophila.">Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila.</a> Development. 113, 825-839 (1991).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+ectopic+eyes+by+targeted+expression+of+the+eyeless+gene+in+Drosophila.">Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila.</a> Science. 267, 1788-1792 (1995).</li><li>Mollereau, B., Domingos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+differentiation+in+Drosophila:+from+immature+neurons+to+functional+photoreceptors.">Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors.</a> Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).</li><li>Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+what+can+we+learn+from+flies?+Editorial+for+the+special+review+issue+on+Drosophila+apoptosis.">Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis.</a> Apoptosis. 14, 929-934 (2009).</li><li>Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+in+focus:+a+comparison+of+lens+development+in+Drosophila+and+vertebrates.">The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates.</a> Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+visual+transduction.">Drosophila visual transduction.</a> Trends Neurosci. 35, 356-363 (2012).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery-based+science+education:+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers.">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59 (2005).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+protects+from+retinal+degeneration.">ER stress protects from retinal degeneration.</a> Embo J. 28, 1296-1307 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+adult+Drosophila+eyes+for+thin+sectioning+and+microscopic+analysis.">Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Mollereau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+process+for+photoreceptor+formation+in+Drosophila.">Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila.</a> Nature. 412, 911-913 (2001).</li><li>Domingos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+transcription+factors+are+required+for+R3/R4+specification+and+establishment+of+planar+cell+polarity+in+the+Drosophila+eye.">Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye.</a> Development. 131, 5695-5702 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c-d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).</li><li>Domingos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+R7+and+R8+differentiation+by+the+spalt+genes.">Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes.</a> Dev Biol. 273, 121-133 (2004).</li><li>Mollereau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+green+fluorescent+protein+enhancer+trap+screen+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells.</a> Mech Dev. 93, 151-160 (2000).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128, 815-826 (2001).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-134 (2011).</li><li>Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination+between+homologous+chromosomes+in+Drosophila.">Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila.</a> Science. 252, 958-961 (1991).</li><li>Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localizations+of+and+requirements+for+the+two+Drosophila+ninaC+kinase/myosins+in+photoreceptor+cells.">Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).</li><li>Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+crumbs+is+required+to+inhibit+light-induced+photoreceptor+degeneration.">Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration.</a> Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).</li><li>Dourlen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fatty+acid+transport+protein+regulates+rhodopsin-1+metabolism+and+is+required+for+photoreceptor+neuron+survival.">Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival.</a> PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).</li><li>Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+seven-up+gene,+a+member+of+the+steroid+receptor+gene+superfamily,+controls+photoreceptor+cell+fates.">The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates.</a> Cell. 60, 211-224 (1990).</li><li>Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ras+targets+using+a+genetic+approach.">Identification of ras targets using a genetic approach.</a> Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).</li><li>Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ras+signaling+pathway+in+Drosophila.">The Ras signaling pathway in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).</li><li>Janody, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosaic+genetic+screen+reveals+distinct+roles+for+trithorax+and+polycomb+group+genes+in+Drosophila+eye+development.">A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development.</a> Genetics. 166, 187-200 (2004).</li><li>Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+for+X-linked+mutations+affecting+Drosophila+photoreceptor+differentiation+identifies+Casein+kinase+1alpha+as+an+essential+negative+regulator+of+wingless+signaling.">A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling.</a> Genetics. 190, 601-616 (2012).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Berger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+genes+that+regulate+neuronal+wiring+in+the+Drosophila+visual+system.">Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system.</a> PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).</li><li>Bayat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+mitochondrial+methionyl-tRNA+synthetase+cause+a+neurodegenerative+phenotype+in+flies+and+a+recessive+ataxia+(ARSAL)+in+humans.">Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans.</a> PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Drosophila göz yaygın olarak geliştirilmesi, proliferasyonu ve hayatta kalma düzenleyen sinyal yolları deşifre etmek için kullanılmıştır. 1990&#39;ların başında, genetik ekranlar çok sayıda PR gelişme 25-27 başlangıç ​​aşamalarında gerekli yolları belirlemek için yapılmıştır. Genetik ekranlar verimliliği mümkün mozaik klonlar 21 kayıp fonksiyon-mutasyon test yapar mitotik rekombinasyon tekniği ile büyük ölçüde artmıştır. Bu nedenle, embriyonik öldürücü mutasyonların rolü sistematik olarak, aksi heterozigot sinekler gözünde homozigoz mutant klonlar test edilebilir. Çoğu mozaik gösterimleri erken PR işe alım, farklılaşma, aksonal projeksiyon ya da gelişmekte olan larva veya pupa 10,25-31 meydana gelen morfolojilerinden odaklanmıştır. Bugüne kadar, sadece tek bir mozaik ekran electroretin aracılığıyla görsel tepkisini izleyerek, yetişkin PR işlevi düzenleyen mekanizmaları araştırılmıştırPROGRAM ÇA Ğ RISI 32 Kayıtlar. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ve mutant hayvanlar yaşayan zamanlı ders analizi gerçekleştirme imkanı ile, biz yetişkin PR canlılığını düzenleyen faktörlerin belirlenmesi için yeni bir yöntem tasarlanmış ve 20,24 işlev var. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi reçine-gömülü gözleri klasik histolojik kesit üzerinde birçok önemli avantajı vardır. İlk olarak, bu yöntem çok daha hızlı, ucuz ve histolojik yöntemi gerçekleştirmek için daha kolay, uygun bir suda daldırma objektif ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu (Reaktifler ve Teçhizat Tablo) kullanılabilir sağlanmıştır. İkinci olarak, domates / GFP-FLP / FRT yöntem mini beyaz bir transgeni taşıyan, örneğin (W + UAS,) P ifadesi olarak, transgen ekspresyonu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Domates / GFP-FLP / FRT sistemi, P w + klonal saptanması için kullanıldığı histolojik bölümlerde, aksine (UAS, W +) klonal d müdahale etmezDomates floresan protein göre etection. P Kullanma (UAS-fatp, + w) transgenik sinekler, biz fatp mutant PRs kurtarılmasının (Şekil 7) görselleştirmek için başardık. Üçüncüsü, Domates / GFP-FLP / FRT dayalı, kayıp PRs genotipinin belirsizlik olduğunu da dahil olmak üzere klonal analiz her türlü, önemli bir hatadır. Gerçekten de, bir PR için spesifik bir gen fonksiyon eksikliği nedeniyle ya da özellikle de mutant klonu sınırında bir hücre otonom-olmayan, etkisinin mevcut olup olmadığı açık olabilir. Domates / GFP-FLP / FRT metodu, birkaç haftalık dönemler boyunca aynı hayvanda vahşi tip ve mutant PRs takip yaparak dejenerasyon bu soruna alır. Biz kinetik bireysel PRs kaderini farklı fatp mutant sinekler üzerinde analizler (Şekil 6) takip başardık. Aynı klon için çevredeki vahşi tip klonların tam şekli, farklı zamanlarda, belirli bir hayvanda tespit edilebilir. Biz kesin göstermek başardıkTüm eksik PRs PRs içinde fatp mutantların rolü hücre özerk olduğunu gösteren, fatp için mutant olduğunu ly. Bu durumda, bir kinetik analizi PR &#39;kaybını izleyerek, yetişkin başlangıçlı dejenerasyonu modellerinde PRs genotipini belirlemek mümkündür. Son olarak, domates / GFP-FLP / FRT yöntem PCP 20 kurulmasını düzenleyen faktörlerin tanımlanması için çok güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Bölümler için gerek kalmadan bir kutup fenotipi için mozaik ommatidia çok sayıda puanlama olasılığı, PCP kurulması için PR ihtiyacının hızlı bir şekilde belirlenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, PR bütünlüğü ince analiz faz kontrast veya elektronik mikroskop ardından geleneksel bölümlendirilmeleri gerektirir. Sonuç olarak, Domates / GFP-FLP / FRT yöntem, vis gibi PR gelişimsel süreçlerini ve yetişkin PR fonksiyonlarını düzenleyen faktörleri belirlemek için verimli mozaik tarama için yeni olanaklar açarual tepki ve canlılığı.

Drosophila retina polarite açık bir şekilde tanımlanmış bir eksen (Şekil 1 B) ile tam olarak düzenlenir yaklaşık 800 ommatidial birimi (Şekil 1A), oluşmaktadır. Sekiz fotoreseptör hücreleri (PR) ve koni hücreler, pigment hücreleri ve hücreler 1,2 kıl dahil 12 aksesuar hücreleri: Her ünite 20 hücreleri içerir. PR iki sınıflarının ifade rodopsin türüne (Rh) temelinde ayırt edilir. Altı dış PR (R1-6) RH1 ifade etmek ve bir trapezoid desen (Şekil 1C) düzenlenmiştir. Yamuk merkezinde, iki iç PRs (R7/R8) rodopsin dört olası türleri (RH3, RH4, RH5 veya RH6) ifade ve R7 R8 3 üstüne yatıyor şekilde düzenlenmektedir. 2500&#39;den fazla genler de dahil olmak üzere, göz deve süreçlerinin geniş bir paneli, çalışmaları için çok güçlü bir modeli olduğunu kanıtlamıştır Drosophila göz 4, morfogenezindeki katılıyormizde, PR işe alım, farklılaşma, düzlemsel hücre polarite, morfogenez, hayatta kalma, apoptoz ve görsel iletimi 5-9. Drosophila göz üzerinde çalışan araştırmacılar, uzun yıllar boyunca, retina görüntüleme ve sistematik genetik ekranları yürütülmesi için teknikler geliştirdik. Görüntünün en kolay yolu, yetişkin retina hareketsizleştirilmiş bir hayvan (Şekil 1A) korneanın bakmaktır. Korneanın yapı taramalı elektron mikroskobu ile tam olarak görselleştirilebilir ve URCFG konsorsiyum tarafından büyük çaplı bir genetik ekran kullanılmıştır ( <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">http://www.bruinfly.ucla.edu</a> ) 10. Bu genellikle gelişme ya da hücre canlılığı erken adımları kontrol eden genlerin mutasyon tarafından uyarılan bu tür göz pürüzler veya parlaklık gibi kornea yapısında küresel morfolojik değişiklikler, görselleştirmek için çok etkili bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, kornea genel görüntüleme su değilPR rhabdomere morfonogenezi veya yetişkin PR canlılığını ve işlevini düzenleyen faktörleri belirlemek için fficient. Bu tür analizler retina 11-13 teğet yarı-ince reçine kesitlerin faz-kontrast mikroskobu dayalı PR bütünlüğü daha kapsamlı bir soruşturma gerektirir. Bu teknik, mutant PR kırmızı pigment 14,15 onların eksikliği tarafından tespit edilebileceği mozaik analizler için uygundur. Mozaik mutant klonlar da floresan mikroskobu 16,17 yeşil floresan proteininin (GFP) sinyal onların eksikliği temelinde, pupa veya ergin retinanın tüm montaj disseksiyonlarında görülebilir. Bu iki teknik, çok kullanışlıdır, ancak her ikisi de emek ve zaman alıcıdır ve bu nedenle de büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Biz ve diğerleri hızlı PR analizleri kolaylaştırmak için, floresan proteinleri 18,19 üreten PRs ve görüntüleme için kornea nötralizasyon tekniklerinin kullanımını geliştirdik. Bu teknik, mutant ileklon mozaik yetişkin Drosophila klonlarda kırmızı (+ a) pigment otoflüoresanla temelinde tespit edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre özerklik gidermek için gerekli olan tek hücreli bir çözünürlük 19 verir sağlamaz. Biz mitotik rekombinasyon 20 ile kornea nötralize edilerek floresan proteinlerin görüntüleme birleştiren Domates / GFP-FLP / FRT yöntemini geliştirerek bu sorunun üstesinden geldi. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte, yüksek verim, mozaik klonlar mutant PRs hızlı ve net bir şekilde tanımlanmasını, (sağlar <a href="http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/" target="_blank">http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/</a> ). Bu Drosophila yaşayan haftalık bir süre boyunca tek PRs aşağıdaki için, kinetik analizlerde kullanım için uygundur. Biz mozaik gözleri basit, kinetik analizlerde kullanımı için burada Domates / GFP-FLP / FRT yöntem ve ipuçlarını anlatabilir.

<table><tbody><tr><td> &amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td> &lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> Agarose</td><td>Euromedex</td><td>D5-E</td><td> Regular agarose is used to immobilize the flies</td></tr><tr><td> Petri dish</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td> 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch</td></tr><tr><td> Cold-ice water</td><td></td><td></td><td> To maintain the flies anesthetized</td></tr><tr><td> &amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td> &lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> Dissecting microscope</td><td>Dutcher</td><td>SMZ645</td><td> &amp;nbsp;</td></tr><tr><td> Water Bath</td><td>Julabo</td><td>9550102</td><td> To keep the agarose solution at warm temperature</td></tr><tr><td> 40X Water objective</td><td>Zeiss</td><td>420967-9900-000</td><td> Water dipping objective for the confocal microscope</td></tr></tbody></table>

the tomato/gfp-flp/frt method for live imaging of mosaic adult drosophila photoreceptor cells

Drosophila göz çok geliştirme ve nöronal dejenerasyonun çalışmalar için bir model olarak kullanılır. Güçlü bir mitotik rekombinasyon tekniği ile, klon analizine dayalı zarif bir genetik ekranları göz gelişimi ve larva aşamalarında fotoreseptör (PR) farklılaşma dahil sinyal yollarının tanımlanmasına yol açmıştır. Burada yetişkin Drosophila yaşayan gözünde hızlı klonal analizi için kullanılabilir Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi tarif etmektedir. Floresan fotoreseptör hücreleri flipase aracılı rekombinasyon tarafından oluşturulan mozaik klonları ile retina üzerinde, kornea nötrleştirme tekniği ile görüntülü. Bu yöntem, retina klasik histolojik kısımlara göre büyük avantajlara sahiptir: yüksek miktarda madde taraması için kullanılabilir ve PR hayatta kalmasını ve fonksiyonunu düzenleyen faktörlerinin tanımlanması için etkili bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Aynı oturma Deriden PR dejenerasyon kinetik analizi için kullanılabilirdiğerleri birkaç hafta içinde, yetişkin sinek PR hayatta kalma ya da fonksiyon için spesifik genler için gereksinimi göstermek için. Bu yöntem, aynı zamanda düzlemsel bir hücre polarite kurulması etkilenir edildiği gibi gelişimsel mutantlar, hücre özerklik sorunları ele almak için yararlıdır.

Domates / GFP-FLP / FRT yöntem olup, Drosophila retinada PRs gelişimi ve hayatta kalması üzerinde bir mutasyon ya da ektopik ifade etkisini incelemek için kullanılabilir. Son zamanlarda 20 gösterildiği gibi, tarama amaçları için idealdir, hızlıdır. Mutant PRs varlığı yanında aynı gözde yabani tip PRs için mutant PRs ile ilişkili kusurları tespit etmek ve hücre özerklik sorunu gidermek için kolaylaştırır. Bizim analizde gözlenen gelişim kusurları PR alımları morfolojilerinden ve düzlemsel hücre polarite (PCP) kurulması (Şekil 5) de dahil olmak üzere çeşitli işlemler, etkilenen. Gıyaben yedi özellikle R7 iç PR biri için, PR alımı için gereklidir. İç PR kaybı ve bazı dış PRs (Şekil 5A) Gıyabi sonuçlarında Yediler kaybı. Grainy kafa (grh) PCP kurulması katılır ve bazı gözcüklerinin inv vardırgrh mutant klonların (Şekil 5B) erted. Bu yöntem sayesinde, gen PCP doğru elde edilmesi için gerekli olduğu PRs tanımlanmasını kolaylaştırmak, mozaik ommatidia mutant PRs belirlemek için yapar. O grh R3 öncüler 20 PCP doğru kazanılması için gerekli olduğunu göstermiştir. Gerçekten, ters ommatidia olarak, R3 öncüden kaynaklanan anormal R4, her mutant olduğu, olduğu görülmektedir. Kırıntısı (Crbs) rhabdomere morfolojilerinden 23 için gerekli bir apikal membran proteindir. Düzensiz, daha büyük veya daha küçük PR &#39;(Şekil 5C) en Crbs 11A22 mutant sonuçlarında Crbs kaybı. Bu yöntem, aynı zamanda yetişkinlikte sırasında bir PR &#39;kaderini (Şekil 6) takip etmek için kullanılabilir. Homozigoz mutant PRs bir grup görüntülenebilir ve aynı grup aynı göz bulunabilir, çünkü, nörodejeneratif hastalıklar çalışmaları için idealdirAynı gün veya hafta bir süre üzerinden uçmak. Her bir klon, göz floresan mikroskop altında konumlandırıldığında kabul edilebilir benzersiz bir şekli vardır, çünkü PR hayatta ve ölüme mahkumdur hangi belirlemek mümkündür. Retina polarize olduğu gibi, şekli temelinde, yine aynı klonu bulmak için retina yönlendirmek mümkündür. Biz fatp k10307 mutasyon erişkinlikte progresif PR dejenerasyon (Şekil 6, 24) neden olduğunu göstermek için bu yöntem kullanılır. Bu görselleştirme yöntemi, aynı zamanda, hücre özerklik analiz etmek için kullanılabilir. Fatp k10307 mozaik retinasında, PR zarar vahşi tip PR etkilenmemiştir, mutant PRs fatp sınırlıydı. PR canlılığı için fatp gereksinimi nedenle hücre özerktir. Biz de bir RH1-Gal4 sürücü ve bir UAS-fatp yapı (Şekil 7) ile vahşi tip fatp reexpressing tarafından fatp mutant PR kurtarmak için başardık.Bu tür kurtarma deneylerin gerçekleştirilmesi olasılığı reçineye gömülü retina histolojik bölümlerde göre klonal analizi üzerindeki Domates / GFP-FLP / FRT yönteminin avantajlarından biridir. Gerçekten de, domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile klonal algılama P kullanımı ile etkilenmez (UAS, w +) transjenik yapıları, (W +) mini-beyaz bir gen ile ilişkili kırmızı pigment kırmızı pigment ile göz kapakları oysa , histolojik bölümlerde mozaik klonları maskeleme. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig1.jpg" /> Şekil 1. Drosophila göz organizasyonu. (A) bir stereomikroskop ile alınmış bir Drosophila göz fotoğrafı. Drosophila göz, yaklaşık 800 ommatidia oluşmaktadır. Gözün ortasında 64 ommatidia bir alanın (B) şematik diyagramı. Her ommatidium altı dış fotoreseptör nöronlar (PR),yeşil gösterilir, gözün en yakın kutupları işaret eden bir basmakalıp yamuk halinde düzenlenmiştir. Bunlar sonuç olarak ekvator olarak adlandırılır, iki parça arasındaki sınır göre ayna görüntüsü ventral ve gözün arka kısmına zıt yönlerde etmektedir ve vardır. Bir ommatidium (C) şematik diyagramı. Her ommatidium sekiz PRs içerir. Yeşil gösterilir R6 PR R1, dış PR bulunmaktadır. Onlar ışığa molekülü rhodopsin1 (RH1) ifade ve memeli çubuk hücrelerinin eşdeğerdir. İç PR, R7 ve R8, (burada R7, R8 üstüne oturur) gri gösterilmiştir. İç PR rodopsin 3, 4, 5 ya da 6 ve memeli ifade koni hücrelerinin eşdeğerdir. Basitlik için, sadece rhabdomere, PR ışığa duyarlı bölümü, her bir PR için gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <imgalt = &quot;Şekil 2&quot; fo: İçerik-width = &quot;4.25in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50610/50610fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. Yaratma ve Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile Drosophila göz mozaik PR klonları görüntülenmesi. Domates / GFP-FLP / FRT yöntem mozaik klonların nesil (A) şematik diyagramı. Mozaik klon nedeniyle göz gelişimi ve FRT dizileri sırasında (eyeless promoterinin kontrolü altında) flipase ekspresyonuna, mitotik rekombinasyon ile oluşturulur. FRT sırası ve hücre bölünmesi, homozigoz mutant, vahşi tip homozigot ve heterozigot hücre rekombinasyon bir heterozigot hücreden oluşturulabilir sonra. Bu hücreler yetişkin göz PRs mozaik klonlar oluşturmak için tekrar bölme. Mutant hücrelerin tanımlanması vahşi tip ve heterozigot hücreleri etiketlemek için, vahşi tip kromozom içine kırmızı floresan protein tdTomato ifade eden bir yapı sokulması ile kolaylaştırılır. T mozaik PR klonlarının (B-B&#39;&#39;) Görselleştirmeo Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi. Domates / GFP-FLP / FRT yöntem mitotik rekombinasyon, kornea nötralizasyon ve konfokal mikroskopi birleştirir. Tüm PRs kornea nötralizasyon ve konfokal mikroskopi (B) kullanarak PRs görselleştirme kolaylaştırmak yeşil floresan protein, GFP ifade. PR tek hücre düzeyinde görselleştirilebilir. Mutant mozaik klonlar mitotik rekombinasyon tarafından oluşturulan ve kırmızı floresan protein tdTomato (B &#39;)&#39; nin yokluğu ile tanımlanabilir. Vahşi-tip ve heterozigot PRs (B&#39;&#39;) sarı iken Sonuç olarak, birleştirilmiş görüntülerde, homozigot PRs, yeşil görünür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig3.jpg" /> Şekil 3,. Visualizat için Drosophila ayarlamakornea nötralizasyonu ile iyon. Agaroz ile dolu bir plaka üzerinde hareketsiz kılınmış bir Drosophila (A-A&#39;&#39;&#39;&#39;) fotoğraflar. Panel A&#39;&#39;&#39;&#39;, sinek içeren agaroz bir parça bir profil fotoğrafı çekmek için kesilmiştir. Drosophila agaroz içinde sağ kanat, agaroz yarı gömülü ve sol kanat agaroz yüzeyi (A, A&#39;&#39; A&#39;&#39;&#39;&#39;) sıkışmış. Drosophila agaroz gömülü olduğu, onun merkez sıklıkla zayıf göz (A, A &#39;) görüntülenmesi için konumlandırılmıştır. Kafa bu nedenle göz orta (A&#39;&#39;, A&#39;&#39; &#39;) yukarı doğru dönük olduğu gibi forseps ile reorientated gerekir. (B-B&#39;), bir Drosophila gösteren şematik bir agaroz plaka ve konumlandırma üzerinde hareketsiz mikroskop hedefi altında Drosophila sahnede Drosophila ayarı. (C-C &#39;) Fotoğraflarhedefine altında mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig4.jpg" /> Şekil 4. Zaman ders analizi için göz Oryantasyon. Şekil şematik diyagramlar olarak temsil kornea nötrleştirilmesiyle izlendi iki farklı yönelimleri ve ommatidia ilgili alanlara, bir Drosophila kafa fotoğraflarını gösterir. Ilk gözlemi sırasında (A), göz yerleştirilir örneğin (sarı) heterozigoz ya da vahşi tip PR &#39;bir klon ekvator (kırmızı çizgi) seviyesinde, alanın ortasında görülüyor ki. (B), ikinci gözlem sırasında göz tam genellikle değil Aynı oryantasyon. Böylece, PRs aynı grup tekrar bulunabilir, ancak görmek mümkün değildir(solda) aynı alan. Göz tekrar görülebilmesini aynı alan için Nokia&#39;nın gerekir. Ekvator konumu bir rehber olarak kullanılabilir. Bu örnekte, gözlemlenen alanı çok ventral ve göz bu nedenle ilk gözlem olarak, yine gözlenen alanın ortasında ekvator yerleştirmek için ventral açık olması gerektiğini biliyoruz. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig5.jpg" /> Şekil 5,. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile tespit PR geliştirme bozukluklar arasında şunlar. İç PRs kaybını gösteren mozaik sina [BG02648] mutant PRs (A) Görselleştirme. Mutant ommatidia olarak, dış PR nedeniyle iç PR R7&#39;nin olmaması için bir araya toplanmıştır. Nitekim, sina iç PR alımı için gerekli olduğu bilinmektedir. Mozaik grh (B) Görselleştirme [s2140] kutupluluk kusurlarını gösteren mutant PRs. Mozaik mutant gözcüklerinin, surrbir daire ile ounded, bir ön-ventral inversiyon gösteren vahşi tip ommatidia zıt yöne işaret. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile detaylı bir çalışma grh ommatidium kutupluluk 20 doğru edinimi için R3 öncü gerekli olduğunu gösterdi. Mozaik crb [j1B5] mutant PRs (C) görselleştirilmesi, deforme homozigot mutant PRs gösteren. CRB rhabdomere morfolojilerinden için gerekli olduğu bilinmektedir. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig6.jpg" /> Şekil 6,. Mozaik fatp zaman ders analizi [k10307] Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile mutant PRs, 14 gün boyunca. Bir mozaik fatp [k10307] mutant retina günde 1 (A, A &#39;) üzerinde gözlenen, günde 4 ( B, B &#39;), 8. gün, (C, C&#39;) ve yumurtadan çıktıktan sonra bir gün 14 (D, D &#39;). Mozaik PRs aynı grup foun olabilirHer bir zaman noktasında d, gözlenen alanına (beyaz dikdörtgen, A, B, C, D). Heterozigoz ve homozigoz vahşi tip PR sarı etiketlenmektedir ise PR &#39;(A&#39;, B &#39;, C&#39;, D &#39;)&#39; in, bu alanda, homozigoz mutant PR, yeşil olarak etiketlenmiştir. Günde 4 (B &#39;) itibaren itibaren, homozigot mutant PRs fatp [k10307] mutasyon bu PRs bir ilerici dejenerasyonu neden olduğunu belirten, kaybolmaya başlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig6large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig7.jpg" /> Şekil 7. Mozaik kontrol mini-beyaz-taşıyan fatp-ifade oluşturmak. Mozaik PRs 15-günlük-eski sinekler Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ile görüntülendi. (A) Görselleştirme ile fatp kurtarma [k10307] mutant PRs PRs. (B) Vmutant PRs kaybını mozaik. (C) Görselleştirme gösteren mozaik fatp mutant PRs arasında isualization fatp dış PR (RH1&gt; fatp) bir sinek reexpressing fatp mutant PRs. Mutant PRs kurtarıldı. Bir beyaz mini-gen ve RH1 de bağlantılı kırmızı göz pigmentasyon varlığı&gt; fatp koşulları Domates veya GFP floresan veya klonal algılamayı değiştirmez.

Watch this Scientific Journal Video about The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells at JoVE.com

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Domates / GFP-FLP / FRT yöntem Drosophila canlı mozaik fotoreseptör hücreleri görselleştirme içerir. Bu, gün veya hafta içinde retinada fotoreseptör hücre tek kaderlerini takip etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, retinal dejenerasyonu ve nörodejeneratif hastalıklar, fotoreseptör hücre geliştirme çalışmaları için idealdir.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

the-tomatogfp-flpfrt-method-for-live-imaging-mosaic-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

18.0K Görüntüleme.  Ecole Normale Supérieure de Lyon.  Domates / GFP-FLP / FRT yöntem Drosophila canlı mozaik fotoreseptör hücreleri görselleştirme içerir. Bu, gün veya hafta içinde retinada fotoreseptör hücre tek kaderlerini takip etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, retinal dejenerasyonu ve nörodejeneratif hastalıklar, fotoreseptör hücre geliştirme çalışmaları için idealdir. 

Video: The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biyomühendislik

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biyoloji

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Immunofluorescence Staining of Drosophila Brains for the Single-Cell Imaging of Glial Cells

Source: Batelli, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56177">Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the immunofluorescence staining of a transgenic Drosophila brain for single-cell imaging of glial cells. The brain expresses membrane-targeted proteins fused with different combinations of antigenic epitopes under the control of a glial-specific recombinase system. The isolated and fixed brains are stained with primary antibodies specific to the antigenic epitopes, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. This labeling enables the simultaneous imaging of different glial cell subpopulations across various brain regions.

Source: Batelli, S., et al. Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in ...

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma

Uzun süreli Canlı Görüntüleme

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Immunofluorescence Staining of Drosophila Brains for the Single-Cell Imaging of Glial Cells