The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

Şekil 3 deney prosedürünün bir özetini gösterir. 1. Doku Hazırlanması <ol><li> C iki kez aşağıdaki çapraz kurmak ilgi konusu bir genin değiştirilmiş ekspresyon sonuçlarını, tespit etmek ve 25 ° C&#39;de korumak için: UAS transgen (erkek) X, GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (bakire kadın) NOT: Kontrol doku çapraz UAS-lacZ edinmek için GMR-GAL4&#39;e erkekler; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP kadın. β-galaktosidaz retina hücre davranışında kusurları yaratır. </li><li> RNAi transgenlerin etkinliğini artırmak için, çapraz UAS RNAi GMR-GAL4, UAS-DCR-2 erkek; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b bakire kadın. Not: ektopik DCR-2 gözlenmiştir ifade retinae hücre davranışında sıra kusurları (veriler gösterilmemiştir). Teyakkuz Bu yaklaşım kullanarak, eğer tavsiye edilir. </li><li> S1.5 ml mikrosantrifüj tüpler seçilen beyaz uygun genotiplerin ön-pupa ve yer. Pupa DCR-2 ifade ederse, erkek veya kadın pupa seçin: UAS-DCR-2, X kromozomu üzerinde bir ekleme, ifadesi erkeklerde güçlüdür. Pupa pupa halinde pigmentasyonu önce 0 saat APF de cinsiyetli olmalıdır - erkek gonadlar pupa (posterior yaklaşık üçte biri) yan tarafta büyük saydam küreler gibi görünür. </li><li> 25 ° C&#39;de temiz bir plastik ucu-kutusunda, pupa içeren mikrosantrifüj tüpleri inkübe. Pupa yer ucu kutu içine damıtılmış su içinde ıslatılmış bir doku, 10 cm 2 parça, kurumayı önlemek için. NOT: ucu-kutusunda nem çok yüksek olursa pupa durum daha sonraki adımlarda incelemek için hantal ve zor olabilir. </li><li> Uygun bir süre için inkübe edilir. Yaklaşık 17 saat APF, 20 saat APF veya 24 saat AP de görüntüleme için pupa hazırlamak, göz desenlendirme ile ilişkili hücre davranışlarını yakalamak içinF. spesifik hücre davranışları en iyi şekilde gözlenen ne zaman daha fazla tartışma için Temsilcisi Sonuçları gör. </li><li> Siyah sylgard diseksiyon çanak üzerine taze çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Çift taraflı bant (Şekil 1A) yapıştırılmış pupa başkanı ile, kadar pupa, dorsal yüzü yerleştirin .try çift taraflı bant pupa toraks ve batın bölgeleri bağlı değil. Forseps ile dikkatlice kaldırın ve pupa kafa maruz kapakçık çıkarın. Bir göz çevresini maruz pupa halinde kenarı boyunca gözyaşı. </li><li> Yavaşça yapışkan bant pupa çıkarın. Pupa yapışık kalırsa, yapışma zayıflatmak için pupa halinde ve bant arasındaki kavşak distile su küçük bir hacim uygulayın. </li></ol> 2. Montaj <ol><li> Kurutma kağıdından küçük 15 mm2 çerçeve inşa ve middlethat bir delik çapı 5,5 mm (Şekil 1B) &#39;dir. Damıtılmış su ve yer daldırınBir mikroskop lamı merkezi. Vazelin düzgün bir halka sıkmak, 30 cc şırınga kullanarak kurutma kağıdı çerçevesini çevreleyen. Vazelin halka pupa genişliğinden daha ve halka çapı bir kapak kayma genişliğinden daha marjinal az olduğunu marjinal yüksek olduğundan emin olun. </li><li> Vazelin boncuk (Şekil 1D) tarafından desteklenen yüzü üzerinde, .Carefully pupa düzenlemek kurutma kağıdı (Şekil 1C) içine sokulur deliğe doğrudan slayt üzerine vazelin küçük bir boncuk ekleyin. </li><li> Vazelin halkasının üstüne bir lamel yerleştirin temas göz neuroepithelium (Şekil 1D) Yukarıdaki epitel böylece. Yavaşça vazelin karşı lamel mühür ve pupa göz bölgesi ve kapak arasında bir küçük düz temas yüzeyi oluşturmak için hazırlık sıkıştırmak. </li></ol> 3. Floresans Görüntüleme <ol><li> Image kullanarak pupa hazırlıkfloresan mikroskop. Her 7 dk yakalama adherens kavşak bölgesinde göz neuroepithelium apikal etki yoluyla seri bölümleri. NOT: a) Uygun bir seri kesitler genellikle 4-5 0.2 mikron z-adımlardan oluşur z-yığını başına bulunmaktadır. b) hafif darbelere ve kıvrımlar dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler, doku büyük bölgelerin içinde odak görüntüleri elde etmek için bu zorlu hale getirebilir. Görüntüleme yaparken, bir odakta olması için ilgi alanı bölümünü bulabilirsiniz, ve bir komşu bölge dışı odak olmak. Pupa göz ve lamel arasında distile su küçük bir damlacık da dahil olmak üzere pupa göz morfolojilerinden erken aşamalarında hafif düzensiz topoloji karakteristiği bazı akut doku kat değil ortadan kaldırabilir. Bu durumlarda odakta dilimleri tüm alan için edinilen kadar z-yığını uzatarak doku oversample. c) Her 7 dk önemli Redu olmadan 3 saat 4 için canlı görüntüleme etkinleştirmeniz gerekir seri bölümleri yakalamagörüntü kalitesini bozabilir GFP floresan yoğunluğu ction. Daha kısa zaman aralıkları-görüntüleme toplam süresini azaltabilir. </li><li> 3-4 saat için görüntüleme devam edin. Pupa büyüme ve hemolimf pompalama retina ve konumunu taşır yana birçok floresan mikroskoplar geçerli bir otomatik odaklama ve zaman işlevini kullanmak etmeyin uyanık yeniden odaklama her 14-21 dakikada gereklidir. Yavaş veya göz morfojenezini durak olabilir 4 saat ötesinde görüntüleme NOT. </li><li> Arka plan azaltmak ve seri bölüm resimlerin kontrastını artırmak için uygun Dekonvolüsyonun yazılımını kullanın. Her z-yığın dosyası için, (Malzeme Tablo) LAS AF yazılımında aşağıdakileri gerçekleştirin: Araçlar paneline gidin, 3D Dekonvolüsyon seçin ve Uygula&#39;yı tıklatın. </li><li> Her deconvoluted yığın dosyası için maksimum projeksiyon (MP) görüntü oluşturun: Araçlar paneline gidin, 3D Projeksiyon seçin ve Uygula&#39;yı tıklatın. NOT: Maksimum Projeksiyon algoritması üniforma oluşturmak için başarısız olabiliroversampled olan doku ly odakta görüntü. Out-of-odak bölgelerini bileme için bir tekniktir adım 5.2&#39;de özetlenmiştir. </li></ol> 4. Pupa Rescue and Fenotip Doğrulaması sonrası görüntüleme <ol><li> Forseps lamel kaldırmak ve gıda temiz bir şişeye aktarın pupa kullanarak: eserler tanıtıldı veya görüntüleme sırasında zarar pupa, dikkatli görüntüleme teçhizat gelen pupa kaldırmak olup olmadığını ele almak. Oda sıcaklığında saklayın veya 25 ° C yetişkin sinek çıkıncaya kadar. </li><li> Dikkatle yetişkin göz fenotip incelemek ve özgün sinek çapraz çıkan erişkin sinek gözlerine karşılaştırın. </li></ol> 5. Görüntü İşleme <ol><li> Otomatik Görüntü Ayarı: NOT: Canlı Drosophila doku vardiya ve görüntüleme süreci boyunca büyüyecek. Sonuç olarak, görüntülerin merkezleri Drosophila dokusunda aynı noktaya uygun olmayabilir ardışık zaman noktalarında toplandı. Ek olarakTüm retina disk ~ 21 ve 23 saat APF arasında yaklaşık 30 ° döner. Bireysel hücre davranışlarını vurgulamak ve organizma büyüme nedeniyle dağıtıcı unsurları azaltmak, bu elle yapılabilir, her milletvekili image.While, burada kullanılan resim düzenleme yazılımı hizalamak için süreci hızlandırmak yerleşik algoritmaları vardır (Malzeme Tablo). <ol><li> Stack içine ana menüde, açık Scripts basıp Yük Dosyaları Dosya sekmesinde. </li><li> Yük Katmanlar paneline MP görüntü dosyalarını içe ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun. NOT: Bu seçenek seçilirse, yazılım görüntü verilerini bozan bir hizalama algoritması kullanabilirsiniz. </li><li> Tüm MP dosyaları Katmanlar bölmesine yüklenen sonra, tüm görüntüler erken zaman noktası katman yığınının üstünde olacak şekilde kronolojik sırayla olduğundan emin olun. Katmanlar, doğru düzen, sürükle değildir ve onlar sipariş kadar onları bırakın Eğerdoğru. </li><li> Ana menüde Düzenle sekmesinden Otomatik Hizala Katmanlar seçin. Konumlandırmak seçin ve Tamam &#39;ı tıklatın. </li><li> Otomatik Hizala algoritması ilgili bir odak noktasına çerçeveleri yönlendirmek için başarısız olursa, Taşı aracını kullanarak küçük ayarlamalar yapmak. </li></ol></li><li> Kompozit Bileme: NOT: Bir başlangıç ​​milletvekili görüntünün Out-of-odak bölgeleri &#39;kırpma&#39; LAS AF yazılım gelen deconvoluted yığını ile bilenmiş edilebilir. Bir yığın dosyası Kırpma bir el Maksimum Projeksiyon algoritması tabi z-yığını aralığını sınırlamak için olanak sağlar. <ol><li> (Süreç sekmesi altında) Araçlar panelinde Kırpma işlevi bulun. Elle onlar başlangıçta out-of-odak bölgesi içinde sadece yapışma kemer kapsayan şekilde ilk ve son dilim kısıtlamak. Bu bölge için optimize edilmiş yeni bir yığın dosyası oluşturmak için Uygula&#39;yı tıklatın. </li><li> TIFF dosyası olarak yerel optimize yığını ve ihracat için yeni bir Maksimum Projeksiyon oluşturun. </li><li> The resim düzenleme yazılımı (Malzeme Tablo), Stack içine (ana menüde Dosya sekmesinde bulunur) açık Script seçin ve Dosyaları Yükle. </li><li> Yük Katmanlar paneline belirli bir zaman noktası için başlangıç ​​MP görüntü dosyası ve yerel optimize MP dosyasını alma ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun. </li><li> Katmanlar bölmesinde iki katmanı seçin ve ardından bir muntazam retina alanı içinde odak veren, otomatik iki görüntü uygun bölgeleri maskelemek için (ana menüde Düzenle sekmesinde bulunur) Otomatik Karıştır Katmanlar seçin. TIFF dosyası olarak bu kompozit görüntü kaydetme. </li><li> Tekrar tüm bırakıyorsa MP görüntüler için 5.2.5 ile 5.2.1 adımları. </li></ol></li><li> Ek Ayarlar: Döndürme, kırpma ve ayarlama Film Katmanlar Düzeyleri: <ol><li> Tüm katmanları seçili retinanın dorsal-ventral eksen hizalanmış böylece, görüntüleri döndürmek için Transform aracı (Edit&gt; Free Transform) kullanınFilm çerçevesinin y-eksenine. </li><li> Gerekirse, istenen boyut ve şekline görüş alanını azaltmak için Kırpma aracını kullanın. </li><li> Hücre zarı ve hücre gövdesi arasındaki kontrastı artırmaya yardımcı olmak için (bireysel kare) seviyesi ayarını kullanın. </li><li> Üslup amaçlar için ve her çerçevenin ilgi noktaları vurgulamak için yanlış renk tanıtmak, belirli bir hücre davranışlarını vurgulamak için. </li></ol></li><li> Animasyon: Bir Film içine Görüntüler dönüştürün: <ol><li> Ana menüde Windows sekmesinden Animasyon bölmesini açın. Animasyon bölmesinin sağ üst köşesinde bulunan menüden Katmanlar Kareleri yapın seçin. </li><li> Tabakalar yığının altından başlayarak sırayla animasyon bölmesine eklenir unutmayın. İlk kare, tüm seçin ve ardından Animasyon bölmesi menüsünden Kareleri Ters seçin, kare sırasını tersine çevirmek için. </li><li> Çerçeve başparmak altındaki açılır menüyü kullanarak her kare için bir çerçeve gecikme süresini seçinTırnak. Not: 1 Bu yazıda sunulan 4 Filmler çerçeve gecikmesi 0.8 sn. </li><li> Ve ana menüye, açık İhracat Dosya sekmesinde video Render seçin. Dosya Seçenekleri altında QuickTime Dışa seçin ve istenen video biçimini seçin. Seçenekler Özel olarak Frame Rate set Render altında, 15 bir kare hızı girin ve Render tıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

yabani tip geliştirme (yukarıda) açıklaması RNAi desenleme olayları veya aşırı ekspresyonu genotip karşılaştırmalar için temel oluşturur. Hücre davranışları ilgi protein tarafından düzenlenir hangi kesin belirlerken canlı doku gelişiminin Karşılaştırmalar paha biçilmezdir. Bundan başka, burada tarif edilmeyen, canlı hücre görüntüleme bir desen göz olaylarda ilgi konusu bir genin rol kalitatif ve / veya kantitatif tanımlama yapmak mümkün kılar. 30-32 saat APF en pigment hücreleri istikrarlı pozisyonları elde etmiş ve apoptoz retina alanında aşırı hücreleri budanır etti. 1 ° nin kurnazca genişletmek gibi komşu dikdörtgen 2 ° hücrelerinin genişliğini azaltır, 3 ° altıgen hale s ve: Bunu takiben, sadece ince değişiklikler pigment hücreleri kendi karakteristik şekiller kabul olarak görülmektedir. Pigment ve lens malzemesinin sonraki nesil muhtemel adherens kavşak başarılı görüntüleme engellemektedir. Bir val rağmenCanlı pupa göz görüntüleme sırasında uable strateji, çeşitli tuzaklar akılda olmalıdır. İlk olarak, ön pupa davayı kaldırarak montaj ve görüntüleme sırasında dehidrasyon, aşırı ısınma ve yaralanma hayvan özellikle savunmasız hale getirir. Bu gibi hakaretler inceleme altında genotipi ile ilgili değildir atipik doku gelişimini uyararak verileri etkilemesi. İkincisi, burada açıklanan protokol cam lamel pupa kafa epitel ile doğrudan temas gerektirir. Biz göze karşı lamel iterek aşırı basınç uygulanırsa retina gelişimi tezgahları olduğunu gözlemledik. Gerçekten de eksojen mekanik kuvvetlerin doku yapısının 19,20 içeren gelişim süreçleri etkilemeye diğer sistemlerde gösterilmiştir. Bu nedenlerle çok nazikçe göz karşı lamel yerleştirmek önemlidir. Ayrıca, görüntülü pupa görüntüleme teçhizat kurtarıldı ve yetişkinler olarak ortaya izin verilmelidir: eserler görüntüleme sırasında tanıtıldı olabilirgenellikle orijinal çapraz yaştaki sinekler gözleri bu yetişkinlerin görüntülü göz karşılaştırarak tespit. Ayrıca, birden fazla görüntüleme oturumları veri hücre davranışlarını doğrulamak için karşılaştırılması gerekir. Son olarak, standart immunofluoresence evre uyumlu dokuda düzenleme, boyutu ve hücre sayısı aynı olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Ektopik DCR-2 sık RNAi etkinliğini arttırmak için kullanılır. Bununla birlikte, dış DCR-2 IC interkalasyonu, 3 ° niş ve apoptoz stabilizasyonu mevcudiyetinde zaman (veriler gösterilmemiştir) bozuldu. Böylece DCR-2 ifadesi dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Etiket kavşakları adherens ve pupa göz pigment hücrelerinin morfojenezini değerlendirmek için burada açıklanan protokol GFP kullanır. Bu strateji, kolayca (örneğin, fotoreseptör morfojenezini değerlendirmek için) başka amaçlar için modifiye edilebilir. Bir çift-etiketleme yaklaşımı için, ek UAOlmayan GFP etiketleri ile diğer hücresel ilgi bileşenlerini (örneğin sekreter veziküller, endoplazmik retikulum, çekirdek) etiketlemek S transgenleri dahil edilebilir. Bu transgenler yoğunluğu ve uzun ömürlü bir değerlendirme gerektirir Bununla birlikte: RFP, DsRed ve mCherry, örneğin, Pigment hücresi modelli yakalamak için gereken uzun süre pupa göz görüntüleme zayıf etiketler olduğu kanıtlanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Hızlı hücre davranışlarını (örneğin salgı) soruşturma varsa burada açıklanan protokol kolayca uygun floresan proteinleri konfokal mikroskopi için modifiye edilebilir.

Bileşik Drosophila göz aksesuar pigment hücrelerinin 4,5 olan bir petek-kafes ile ayrılmış olan ~ 750 ommatidia kalıplaşmış düzenleme ile karakterizedir. Yerel hücre hareketleri, hücre büyümesinin, hücre şeklinde değişikliklere, ve apoptoz: Bu pigment hücreleri etkinlikleri koordine kombinasyonu ile desenli. Bu epitel Canlı görselleştirme biri bir fizyolojik ilgili ve soğukkanlı üç boyutlu bağlamda bu olayları destekleyen moleküler mekanizmaları çalışma sağlar. Daha önceki protokollarda 6,7 tersine, burada anlatılan teknik görüntüleme işlemi çıkartılabilir olamaz yabancı doku hareketini stabilize edilmesi için etkili bir yöntem içermektedir. Görüntüleme boyunca, büyür dönen bir doku ve vardiya - Bu yöntem gelişmekte Drosophila pupa göz epitel hücre davranış çalışmaları geliştirir. Ayrıca hareket istikrar tekniği de içindeBurada tarif yabancı hareket meydana başka bağlamlarda hücreleri üzerinde çalışmak için yararlı olacaktır. Göz özgü sürücü GMR-GAL4 1-3 kontrolü altında GFP: GFP yanı sıra UAS-α-katenin: Drosophila retina alanında hücre sınırlarını görselleştirmek için, transgenik sinek hatları ubi-DE-Kadherin ifade oluşturulur edildi. İki GFP-etiketli membran belirteçlerin kullanımı düşük yoğunlukta ışık hücre sınırlarının görselleştirme sağlar. Bu yüksek enerjili dalga boylarına tekrarlanan maruz kalma, artan sağlayan kare hızı ve film süresine doku hasarı ve photobleaching en aza indirir. UAS DCR-2, aynı zamanda, ikinci bir uçucu hattı 8 dahil edildi RNAi transgenlerinin etkinliğini geliştirmek için. Önceki protokollerden üçüncü güncellemesinde, kolayca en laboratuarlarda monte basit bir görüntüleme teçhizat açıklanmıştır. Bu cihaz özel bir görüntüleme r olması gerektiğini ortadan kaldırırig bir üniversitenin &#39;makine dükkanı&#39; veya benzer hizmeti tarafından oluşturulan. Bu görüntüleme kulesi görüntü diğer pupa dokulara 9,10 için kullanılan benzer. Doğrudan 17-42 saat puparium oluşumu (hr APF) sonra ~ den göz dokusuna katkıda morfogenetik olayları değerlendirmek için kullanılabilecek basit bir canlı hücre görüntüleme protokolü burada sundu. Spesifik olarak, bu protokol, pupa gelişimi esnasında gen ekspresyonunu modifiye sonuçlarını belirlemek için bir olanak sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

Drosophila pupa gelişme doğasında süreçleri vardiya ve canlı hücre görüntüleme sırasında izlemek için bireysel hücre davranışı zorlaştıran şekilde göz epitel bozabilir. Bu süreçler şunları içerir: Retina döndürme, hücre büyümesini ve organizma hareketinin. Pupa zorlu bir tek odak düzlemi birkaç ommatidia fazla in-odak görüntüleri elde etmek için yapmak, görüntüleme için hazırlanan Ek olarak, ince darbelere ve dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler genellikle tanıtıldı kıvrımlar. iş akışı Drosophila pupa göz gelişimi sırasında hücresel süreçlerin kolay analizini sağlayan, Çareleri burada bu konuları sıraladı. Bu duruma uygun şekilde kademeli pupa kolayca en laboratuvarlarda monte edilebilir bir görüntüleme teçhizat düzenlenmiş Ubikuitin DE-kaderin:., GFP ve GMR-GAL4 -sürümlü UAS-α-katenin GFP göz epitel 1 hücre sınırlarını görselleştirmek için kullanılır -3. Dekonvolüsyon sonraBirden fazla odak düzlemleri yakalanan floresan görüntülere uygulanan maksimum projeksiyon görüntüleri her zaman noktası için oluşturulan ve görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak geliştirilmiştir. Hizalama algoritmaları izlemek için tek tek hücre davranışı kolaylaştıran, hızlı bir şekilde gereksiz hareket stabilize etmek için kullanılırlar.

Pupa göz Canlı görüntüleme neuroepithelium desenlendirme katkıda hücre davranışlarını gözlemlemek için başarılı bir strateji. Belirli proteinlerin rolü kolayca göz gelişimi sırasında protein düzeylerini değiştirmek transgenleri ifade ile tespit edilebilir. Bu GMR-GAL4 yapmak için morfogenetik oluktan arkasında transgen ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu ilk iki larva dönemi boyunca göz alanını kurmak önceki olayları bozucu değil avantajı sunuyor. Ayrıca birçok RNAi transgenleri etkin bir (veri gösterilecektir) protein düzeylerini düşürmek için önemli bir zaman gerektirir. GMR-GAL4 sürücüsü hattı genellikle yarasız devam etmek metamorfoz sırasında göz disklerin üçüncü larva göz gelişimi ve tersine çevrilmesi sağlayan ve önemli ölçüde pupa göz morfolojilerinden sırasında, sadece daha sonra protein düzeyini azaltır ile Dolayısıyla RNAi transgenleri sürüş. Larva gelişme ancak yüksek verimli RNAi transgen tarafından tedirgin edilirse, haçlar can fly0 saat APF 25 ° C&#39;de aktarılan transgen ekspresyonunu ve pupa azaltmak için 18 ° C&#39;da muhafaza edilmesi. RNAi transgen ifadesi, transkript veya protein seviyelerinin etkinliğini ele almak için (örneğin kantitatif PCR, immunofloresan, imünolekeleme), standart teknikler kullanılarak sahne eşleştirilmiş pupa olarak değerlendirilmelidir. Larva gelişimi sırasında, her ommatidium fotoreseptör çekirdeklerinin göz diskin 11 ön tarafına posteriorundan geçecek bir dalga olarak alınırlar. Bu gelişimsel degrade pupa göz muhafaza edildi. Nitekim, zaman 22.5 saat APF, GMR-GAL4, UAS-DCR-2 desenlendirme görüntülü; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae (Şekil 2) arka bölgede belirgin daha olgun oldu. Bu retinae fenotipi, vahşi tip uçucu suşları ile karşılaştırılabilir olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Geleneksel pupa göz morfogenez gelişim zamana göre tarif edilmektedir (örneğin,saat APF). Ancak, belirgin gelişimsel degrade aşağıdaki olaylara göre göz desenlendirme açıklayan öneriyoruz çünkü: 1 ° sarma (Şekil 2 ve Film 1): Başlangıçta çok sekiz hücre doğrudan fotoreseptör demetleri temasa geçti. İki hücre - genellikle anterior ve posterior hücreleri - Primer (1 ° s) olarak alındı. Bu 1s hızla sabit bağlantı yerleri meydana getirmek üzere birbirlerine bağlayarak, fotoreseptör demetleri çevrili. Farklılaşmamış hücreler interommatidial (IC) her ommatidial gruplandırma arasında dağınık bir şekilde yatıyordu. 1 ° hücre alımı ile eşzamanlı, apoptoz 12 (değil Film 1 açıklamalı) daha önce açıklandığı gibi IC havuz yaklaşık% 5 budanır. IC ardalanması (Şekil 2 ve Film 2): 1 ° s sarılmış ve her fotoreseptör paket hakkında mühürlü olarak, yerel cell hareketleri her ommatidium dorsal ve ventral kenarlarında gruplandırılmış IC yeniden. Birden gelen ardalanmalı IC tek bir satır halinde (genellikle iki) satır. Hareketli IC hedef pozisyonu güvenle büyük &#39;hücresel uzantıları&#39; yön projeksiyon gözlemleyerek yabani tip dokusunda tahmin edilebilir. 1 ° hücrelerinin büyüme eşlik etti ve büyük olasılıkla IC ardalanmasından 13 katkıda bulunmuştur. Birçok IC ikincil hücreler (2 ° s) olarak ayırt etmek üzerine gidecek (gösterilmemiştir). 3 ° yarışma (Şekil 2 ve 3 Film): interkalasyonu ardından, üç IC üçüncül (3 °) niş işgal yarıştı. Bu dinamik savaşta, hücreler sık ​​sık yerinden edilmeden önce az 5-10 dakika gibi 3 ° niş işgal etti. Sonunda tek bir hücre istikrarlı 3 ° niş kurdu. Nihai budama (Şekil 2 ve Film 4): Apoptoz 3,15-18 bir dalgalanma verimli bileşik göz 5,14 karşısında düzgün altıgen IC kafes oluşturmak için gerekli olan minimum IC sayısını azalttı: üç 3 ° s ve her ommatidium yaklaşık altı 2 ° s. Daha önce belirtildiği gibi, çoğunlukla kılların yakın yatan bu aşırı IC apoptoz 7 suretiyle bertaraf edilmiştir. Biz IC interkalasyonu ve 3 ° niş kurulması ile hücre ölümü eşzamanlı gözlenen ve bu olayların verimliliğine katkıda aşırı hücrelerin bu budama öneriyoruz. IC budanır Buna ek olarak, fırça kılı organules ince yeniden konumlandırma genellikle gözlenmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52120/52120fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Pupa diseksiyonu ve görüntüleme (A) operkulum (23 saat APF burada gösterilen) bir Drosophila pupa kaldırılır a başını maruzNimal. Noktalı çizgi çift taraflı bant bir parça temsil eder. Basit canlı görüntüleme teçhizat (B) Çizim. Kafa maruz ile (C ve D), pupa yaklaşık 35 ° vazelin boncuk dayanan konumlandırılmış. (D) vazelin boncuk üstüne yerleştirilmiş bir pupa yüksek büyütme görüntü. lamel ve objektif pozisyonu (ölçekte çizilmiş değildir) gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52120/52120fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52120/52120fig2highres.jpg" /> Şekil 2: pupa, göz içinden gelişme gradyanı kullanılabilir. (A) 22.5 saat APF görüntülü bir pupa gözün tek bir görüntü. GFP ve αCat: adherens kavşak DE-Cad tarafından etiketli GFP. Kutulu bölge içinde açıklamalı (C). (B) sırasıyla 24 ve 41 saat APF de orta evre ve tam desenli ommatidia, illüstrasyonlar. İki 1 ° s (mavi) dört koni hücreleri (beyaz) bir merkezi çevreleyen gruplama. Interommatidial hücreler (açık gri) desenlendirme APF 41 saat tamamlandığını: üç 3 ° s alternatif köşeleri ve tek 2 ° formları altıgen her tarafı işgal. Üç organules (koyu gri) her ommatidium çevreleyen kıl. (A) göz küçük bir bölgeye (C) ek açıklama. İki 1 ° hücreleri (pseudo-renkli ışık mavi örnekleri) her fotoreseptör paket kuşatmak için genişletin. Tek sıra halinde IC (yeşil, sarı, kırmızı ve koyu mavi) birleşip. (Pembe özetlenen) üç hücre rekabet her alternatif köşe 3 ° niş (renkli turuncu) işgal etmek. Açılımı bu olayları gözlemlemek için Filmler 1-4 bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52120/52120fig2large.jpg" target="_blank">Bu figür daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>ör. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52120/52120fig3highres.jpg" /> Şekil 3:. Deneysel işlemin özeti <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52120/52120fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/Hellerman_Movie_1.mov" target="_blank">Film 1</a> :. primer ambalaj 1 ° hücreler her acemi ommatidium çevreleyen hücreler havuz arasından seçilir. İki 1 ° s her ommatidium kuşatmak ve bağlantı gibi, kavşaklar hızla (pembe çizgiler) oluşturmak adherens. düz 1 °: 1 ° hücre kavşaklar genişletmek ve 1 ° s çevreleyen IC gelen fotoreseptör demetleri yalıtım, büyümeye başlar. Başlangıçta fotoreseptör ayrıntılı adherens kavşakları işaretleme, parlak yoğun GFP kızdırma. Morfolojik gra değiştiririkili olarak netleşir ommatidium görüntüleme ve her tepesinde dört apikal koni hücreleri her set arasında X-şekilli kavşak düzleminin altında bu fotoreseptör kavşaklar çizin. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 21 saat APF gelen görüntülenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/Hellerman_Movie_2.mov" target="_blank">Film 2</a> :. Interommatidial hücre intercalaction interommatidial hücreler (IC) vurgulanan, kırmızı, mavi, sarı ve iki hücre mesafeye göre bir dorsal (üstte) ve ventral (alt) ommatidium ayıran bir kadranı oluşturur başlangıçta yeşil. Kırmızı ve sarı IC 56 dakika ile hedef 1 ° s temas, ventral ve dorsal (sırasıyla t = 42 dk) germek. mavi ve yeşil IC benzer zıt ommatidium hedef genişletmek. &#39;Yeni&#39; 1 °: IC eklemleri hızla yanal genişletin. 112 dk IC orijinal kadran ge tamamen interkalate vardırHücrelerin tek bir satır nerate. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 23 saat APF gelen görüntülenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/Hellerman_Movie_3.mov" target="_blank">Film 3</a> :. Tersiyer rekabet alternatif köşe, iki ya da üç hücreleri de (pembe özetlenen) 3 ° niş işgal için yarışırlar. &#39;Itme&#39; görünen komşularının kenara, hücreler karşısında ommatidia doğru ulaşmak büyük uzantıları oluşturur. 3 ° niş (renkli turuncu) işgal genellikle geçicidir ve hücrelerin geri veya komşuları tarafından yerinden çıkarılarak itilir ya. Bu 217 dk filmin sonunda, birçok 3 ° niş kurulan görünür. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 23 saat APF gelen görüntülenmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/Hellerman_Movie_4.mov" target="_blank">Mo</a>vie 4:. Nihai budama kıl organules yakın hücreler apoptoz ile uzaklaştırılır. Örnekler, mor, kırmızı, sarı ve mavi vurgulanır. Görüntüleme boyunca, hücrelerin çıkarılması IC altıgen her yatay kol boyunca sadece bir 2 ° bıraktı. IC altıgen çapraz tarafta aşırı hücre Budama bu filmde yakalanan değildi. Bu genotip içinde kıl grubu yerleştirilmesinde küçük hatalar genellikle (Şekil 2B ile karşılaştırın) gözlenmiştir. Üç İki görüntüleme sırasında köşe niş içine manevra kıl grupları: konumlandırma yeniden komşu IC kaldırılması ve hareket kolaylaştırılabilir ortaya çıktı. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 26 saat APF gelen görüntülenmiş.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye at JoVE.com

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K Görüntüleme.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Video: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Gelişim Biyolojisi

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Canlı-görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Uzun süreli Canlı Görüntüleme