מתקני PLATIM וDroso כלים של UMS3444 Biosciences, ליון, צרפת. המחקר של BM נתמכה על ידי מענקים מFondation לשפוך la משוכלל ונדיר Médicale מCNRS (ATIP) וANR-12-BSV1-0,019-01. פ&quot;ד נתמכה על ידי רשתית צרפת עמותה ואקול נורמל סופרייר בליון (צרפת). CL נתמכה על ידי La Ligue Nationale contre le סרטן עמותה.

1. חציית קווים עם העגבניות / GFP-FLP / FRT הדור של זבובים שנשאו את המוטציה השיבוט דורש צלב יחיד בין קו המוטציה נושאת FRT והעגבניות / GFP-FLP / FRT המתאימה לטוס קו. עבודה זו מנוצל אוסף BruinFly של מוטציות recombined-FRT <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">(http://www.bruinfly.ucla.edu).</a> ניתן להשתמש בו ארבעה קווי העגבניות / GFP-FLP / FRT, נושאים FRT RH1-tdtomatoninaC על כל זרועותיה של 2 ו -3 בכרומוזומים בשילוב עם מקור flipase (אי-FLP) וביטוי של ה-GFP בכל הפורטוריקנים החיצוניים (כטב&quot;מ RH1-Gal4 -GFP) 20: - זרוע 2L: קו # 43,345, P {ר&quot;י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ר&quot;י [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {ר [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 3 - זרוע 2R: קו # 43,346, P {ר&quot;י [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {ר&quot;י [T7.2 +] = neoFRT} 42d P{ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {ר [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 3 - זרוע 3L: קו # 43347, P {ר&quot;י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 2, P {ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ר&quot;י [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, שחפת [1] - זרוע 3R: קו # 43,348, P {ר&quot;י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w P {ר&quot;י [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, שחפת [1]; [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 2 ארבע שורות אלה זמינות במרכז מניית Bloomington דרוזופילה. הם סיפקו מקור של FLP בעיני הפיתוח לייצור שיבוטים המיטוטי 21. כרומוזום פראי מסוג נושאת רצף FRT וninaC RH1-tdTomato לבנות קידוד tdTomato חלבון פלואורסצנטי האדום, כסמן לwild-type ו הפורטוריקנים חיצוניים הטרוזיגוטיים. במבנה זה, 41 חומצות אמינו האחרונות של איזופורם p174 של ninaC (לא איון ולא הפעלת C) גן היה appended במסגרת לC-הסופית של רצף tdTomato. זנב C-מסוף של איזופורם p174 ninaC אחראי על לוקליזציה rhabdomeral של החלבון 22 והיתרים להדמיה חיות טוב יותר של הפורטוריקנים ניאון אדומים שימוש בטכניקת נטרול קרנית. אמרגן RH1 הוא נ&quot;ב המינימלי 234 (-152 +82) אמרגן RH1. GFP סמן פלואורסצנטי הירוק בא לידי ביטוי בכל הפורטוריקנים החיצוניים, בשל נוכחותם של RH1-Gal4 (אמרגן 3KB) וכטב&quot;מ-GFP ninaC בונה. צלבים בין המניה לטוס נושאת x מוטציה על כרומוזום FRT (FRT-x) וקווי העגבניות / GFP-FLP / FRT מניב צאצאים עם גנוטיפ הבא (דוגמא למוטציה ב2L): RH1-Gal4, אי-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x; כטב&quot;מ-GFP ninaC. בזבובים אלה, תאים שעברו מוטציה הומוזיגוטים מופקים על ידי רקומבינציה mitotic בדיסק העין מתפתח ומתחלקים על מנת לייצר שיבוט של הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים (איור 2 א). הומוניתן לזהות תאים שעברו מוטציה zygous משום שהם מבטאים את החלבון פלואורסצנטי הירוק בלבד (GFP), ואילו wild-type ו תאים הטרוזיגוטיים סביב לבטא גם tdTomato וGFP (2B דמויות ו-B &quot;). 2. הכנת דרוזופילה להדמיה קולטי אור להדמיה יחסי ציבור על ידי טכניקת נטרול קרנית, לשתק את הזבובים על צלחות agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקבוק שטיפה מלא במים 4 ° C מזוקקים ולמקם אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose הרגיל במים (agarose 1.2-1.5% במי 100 מיליליטר) על ידי חימום במיקרוגל. מניחים את הבקבוק באמבט מים ב55 ° C ולאפשר פתרון agarose להתקרר לטמפרטורה זו. שמור את agarose על 55 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים עם CO 2 לדקות לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון agarose החם (ב55 ° C) לתוך צלחת פטרי (35 x 10 מ&quot;מ, 1.37 x 0.39 ב) ומקום היא מידately הרדים דרוזופילה על agarose. למתחילים, מתחיל עם 10 זבובים לכל צלחת פטרי הוא סביר. גם מנה גדולה יותר פטרי (60 x 15 מ&quot;מ, 2.362 x 0.59 ב) יכולה לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, כוון את דרוזופילה על צידו עם מלקחיים, דוחף כנף אחת לתוך agarose, כך שהכנף וחצי של הגוף מוטבעים בagarose (איורים 3A-3A &quot;&quot;). היצמד האגף האחר על פני השטח של agarose. הערה: אם הזבובים אינם מוטבעים עמוק מספיק בagarose, הזבוב יהיה חופשי לנוע בראשה במהלך ההדמיה של יחסי הציבור, וזה יגרום לתמונות מטושטשות. הנטייה של העין תהיה גם יפריע לו. זה עלול להיות קשה לצלול לתוך דרוזופילה agarose, עקב או הריכוז של agarose או הטמפרטורה שלו. זה יותר קל להטביע זבובים בagarose מרוכז יותר, אבל אם את agarose מרוכז מדי, הזבוב עלול לשקוע. אם agarose הוא מגניב מדי, זה יכול להיות דיfficult להטביע את הזבוב, אבל גבוהה מדי טמפרטורה עלולה לגרום נזק לקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי על קרח ולאפשר agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, כוון את הראש כך שעין אחת חשופה למטרת הטבילה (איור 3 א &#39;ו 3 א &quot;&quot;). באופן כללי, עיניים יכולות להיחשב להיות מכוונות היטב תחת מיקרוסקופ לנתח כאשר pseudopupil (דמיינו ככתם שחור) הוא באמצע של העין. כיוון אופטימלי של העין מגדיל את הרוחב של שדה ommatidial בי הפורטוריקנים מתמקדים. מטרת צעד הנטייה היא למצוא את האזור של העין עם השדה הרחב של הפורטוריקנים ממוקדים, בדרך כלל במרכז העין. שלב זה הוא גם שימושי עבור הסרת כל רגליים או aristae מכסה את העין ומניעת ההדמיה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את הזבוב עם מים קרים כקרח ולהשאיר את צלחת פטרי על קרח עד להדמיה. מים קרים כקרח שומר על הזבובים מורדמים. </li></ol> 3. חזותיקולטני אור מתחת למיקרוסקופ להדמיה של הפורטוריקנים דרך הקרנית, פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ זקוף מצויד מטרת מים עם מרחק עבודה ארוך (W N-Achroplan 40X/0.75). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי מכוסה במים קרים כקרח בשקופית זכוכית על הבמה של מיקרוסקופ (איורים 3 לפני הספירה). צלחת פטרי יכולה להיות דבוקה לשקופית הזכוכית, כך שניתן להעביר אותו בצורה חלקה על עם ברגי מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול אובייקטיבי הטבילה לתוך המים של צלחת פטרי (איורים 3B&#39;-3C &#39;). מקם את הראש של הזבוב תחת קורה העירור (להתחיל עם מסנן ה-GFP, למשל). להזיז את הבמה למעלה ולמטה עד הקרן מתכנסת על העין. כאשר העין היא ברמה הנכונה, הוא נוטה לשקף את אור העירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסתכל דרך העינית לקרינה. כאשר העין ממוקמת במרכז שדה הראייה, להתמקד בהמשךקרנית כדי להמחיש את קולטני אור הניאון. </li></ol> הערה 1: כאשר מסתכלים דרך העינית, זה עשוי להיות לא נוח להבחין חלקי הגוף של הזבוב, ובעיקר החלק האחורי של הבטן והראש, למשל. במקרים כאלה, אתה צריך להסתכל ישירות בשלב כדי לשנות את מיקום דרוזופילה. הערה 2: הקרינה קלאסית או confocal עשויה לשמש. מיקרוסקופיה confocal נותנת תמונות עם פחות רקע ושדה רחב יותר של הפורטוריקנים ממוקדים ממיקרוסקופיה קלאסית. הגדרת דוגמה לכך היא מיקרוסקופ confocal LSM510 (Zeiss) עם מטרת מים 40X. ניתן לקבל תוצאות טובות יותר על ידי פתיחת חריר של מיקרוסקופ confocal הרחב יותר מאשר בדרך כלל מומלץ לאובייקטיבי. לדוגמא, השתמש בשווי של 204, ולא ברירת המחדל 98 לצמצם של חריר. הערה 3: רמות גבוהות יותר של פיגמנטציה + w של העין להפחית את הקרינה הרקע. </p&gt; 4. ויזואליזציה בזמן קורס של תאי קולטי אור טיפול נדרש כאשר בעקבות גורלם של יחסי ציבור אינדיבידואליות באותה עין על פני תקופה של זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את הטמפרטורה של agarose ל45 ° C, על מנת למקסם את הישרדות דרוזופילה. Agarose מתמצק במהירות בטמפרטורה זו. יש להשתמש רק אחד דרוזופילה לכל צלחת פטרי, על מנת להבטיח כי זבובים אינם מעורבים במהלך תצפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שיטתי למקם את הזבובים באותו הצד, לצפייה של אותו עין. זו יכולה להיות מושגת על ידי נטילת הזבוב הרדים מהבקבוקון שלה על ידי כנף אחת והצבת דרוזופילה על agarose. תמיד לכוון את העין באותה הדרך, אם אפשר, מה שהופך את זה קל למצוא שיבוטים יחסי ציבור שכבר נצפו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את השיבוטים על בסיס הצורה שלהם מתחת למיקרוסקופ confocal. שדה הראייה ממוקם בסמוך לשיבוט של עניין לעתים קרובות. בsuch המקרים, העין צריכה להיות ההתמצאות מתחת למים, למרכז שדה הראייה על השיבוט של עניין, המבוסס על הקוטביות של העין (איור 4). </li></ol> 5. שחזור זבובים לאחר יזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים מצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את דרוזופילה מתוך agarose עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את דרוזופילה ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את דרוזופילה לבקבוקון, על מנת להבטיח שזה לא להיתקע במזון. מחמד לטוס לבוא עגול ב25 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Hardie, R. C., Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sensory physiology 5. 5, 1-79 (1985).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+normal+and+rough+eye+mutants+of+Drosophila.">Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila.</a> Development. 113, 825-839 (1991).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+ectopic+eyes+by+targeted+expression+of+the+eyeless+gene+in+Drosophila.">Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila.</a> Science. 267, 1788-1792 (1995).</li><li>Mollereau, B., Domingos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+differentiation+in+Drosophila:+from+immature+neurons+to+functional+photoreceptors.">Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors.</a> Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).</li><li>Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+what+can+we+learn+from+flies?+Editorial+for+the+special+review+issue+on+Drosophila+apoptosis.">Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis.</a> Apoptosis. 14, 929-934 (2009).</li><li>Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+in+focus:+a+comparison+of+lens+development+in+Drosophila+and+vertebrates.">The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates.</a> Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+visual+transduction.">Drosophila visual transduction.</a> Trends Neurosci. 35, 356-363 (2012).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery-based+science+education:+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers.">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59 (2005).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+protects+from+retinal+degeneration.">ER stress protects from retinal degeneration.</a> Embo J. 28, 1296-1307 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+adult+Drosophila+eyes+for+thin+sectioning+and+microscopic+analysis.">Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Mollereau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+process+for+photoreceptor+formation+in+Drosophila.">Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila.</a> Nature. 412, 911-913 (2001).</li><li>Domingos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+transcription+factors+are+required+for+R3/R4+specification+and+establishment+of+planar+cell+polarity+in+the+Drosophila+eye.">Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye.</a> Development. 131, 5695-5702 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c-d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).</li><li>Domingos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+R7+and+R8+differentiation+by+the+spalt+genes.">Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes.</a> Dev Biol. 273, 121-133 (2004).</li><li>Mollereau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+green+fluorescent+protein+enhancer+trap+screen+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells.</a> Mech Dev. 93, 151-160 (2000).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128, 815-826 (2001).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-134 (2011).</li><li>Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination+between+homologous+chromosomes+in+Drosophila.">Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila.</a> Science. 252, 958-961 (1991).</li><li>Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localizations+of+and+requirements+for+the+two+Drosophila+ninaC+kinase/myosins+in+photoreceptor+cells.">Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).</li><li>Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+crumbs+is+required+to+inhibit+light-induced+photoreceptor+degeneration.">Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration.</a> Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).</li><li>Dourlen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fatty+acid+transport+protein+regulates+rhodopsin-1+metabolism+and+is+required+for+photoreceptor+neuron+survival.">Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival.</a> PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).</li><li>Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+seven-up+gene,+a+member+of+the+steroid+receptor+gene+superfamily,+controls+photoreceptor+cell+fates.">The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates.</a> Cell. 60, 211-224 (1990).</li><li>Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ras+targets+using+a+genetic+approach.">Identification of ras targets using a genetic approach.</a> Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).</li><li>Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ras+signaling+pathway+in+Drosophila.">The Ras signaling pathway in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).</li><li>Janody, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosaic+genetic+screen+reveals+distinct+roles+for+trithorax+and+polycomb+group+genes+in+Drosophila+eye+development.">A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development.</a> Genetics. 166, 187-200 (2004).</li><li>Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+for+X-linked+mutations+affecting+Drosophila+photoreceptor+differentiation+identifies+Casein+kinase+1alpha+as+an+essential+negative+regulator+of+wingless+signaling.">A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling.</a> Genetics. 190, 601-616 (2012).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Berger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+genes+that+regulate+neuronal+wiring+in+the+Drosophila+visual+system.">Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system.</a> PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).</li><li>Bayat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+mitochondrial+methionyl-tRNA+synthetase+cause+a+neurodegenerative+phenotype+in+flies+and+a+recessive+ataxia+(ARSAL)+in+humans.">Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans.</a> PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

עין דרוזופילה כבר בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי איתות ויסות פיתוח, שגשוג והישרדות. בתחילת 1990, מספר גדול של מסכים גנטי בוצע על מנת לזהות את המסלולים הנדרשים במהלך השלבים הראשונים של פיתוח יחסי ציבור 25-27. היעילות של מסכי גנטיים גדלה במידה רבה על ידי טכניקת רקומבינציה mitotic, מה שהופך את זה אפשר לבדוק מוטציות אובדן של פונקציה בשיבוטי פסיפס 21. לפיכך, תפקידה של מוטציות קטלניות עובריים יכול להיבדק באופן שיטתי בשיבוטי מוטציה הומוזיגוטים בעיניים של זבובים שהיו אחרת הטרוזיגוטיים. רוב הקרנות הפסיפס התמקדו בגיוס יחסי הציבור המוקדם, הבידול, הקרנת אקסון או המורפוגנזה מתרחשת בזחלים או גלמי 10,25-31 המתפתחים. עד כה, רק אחד מסך פסיפס חקר את מנגנוני ויסות תפקוד יחסי ציבור מבוגרים, על ידי ניטור התגובה החזותית באמצעות electroretinogram הקלטות 32. עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT והאפשרות של ביצוע ניתוח כמובן זמן חי חיות שעברו מוטציה, יש לנו תוכננו שיטה חדשה לזיהוי הגורמים המסדירים את יכולת קיום יחסי ציבור מבוגר ולתפקד 20,24. יש שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כמה יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית הקלאסי של עיניים משובצות שרף. ראשית, שיטה זו היא הרבה יותר מהר, זול יותר וקל יותר לביצוע מאשר השיטה היסטולוגית, ובלבד שמיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במטרת טבילת מים מתאימה הוא זמין (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד). שנית, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש בשילוב עם ביטוי transgene, כגון הביטוי של P (כטב&quot;מ, W +), שנשאה transgene מיני לבן. בניגוד לסעיפים היסטולוגית, שבי + w משמש לזיהוי משובט, במערכת העגבניות / GFP-FLP / FRT, P (כטב&quot;מ, W +) לא מפריע ד המשובטetection מבוסס על חלבון פלואורסצנטי עגבניות. באמצעות P (כטב&quot;מ-fatp, W +) זבובים מהונדסים, היינו יכול לדמיין את ההצלה של הפורטוריקנים מוטציה fatp (איור 7). שלישית, מכשול עיקרי של כל סוגי ניתוח משובט, ובכלל זה המבוסס על העגבניות / GFP-FLP / FRT, היא העמימות של גנוטיפ של הפורטוריקנים לאיבוד. ואכן, זה עשוי להיות לא ברור אם יחסי ציבור נעדר בגלל חוסר תפקוד גן מסוים או בגלל השפעה בלתי אוטונומית תא, במיוחד בגבול של השיבוט שעבר מוטציה. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT מקבלת לעקוף בעיה זו לניוון על ידי כך שניתן לעקוב wild-type ו הפורטוריקנים מוטציה באותו בעל חיים על פני תקופות של מספר שבועות. היינו מסוגל לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים פרט על ידי הקינטית ניתוחים על זבובים שעברו מוטציה fatp שונים (איור 6). אותו השיבוט יכול להיות מוכר בבעלי חיים ניתנו בזמנים שונים, בגלל צורתו המדויקת של השיבוטים פראי מהסוג שמסביב. אנחנו הצלחנו להראות חד משמעיly שכל הפורטוריקנים החסרים היו מוטציה לfatp, מצביעים על כך שתפקידם של מוטציות fatp בהפורטוריקנים הוא תאים אוטונומיים. לכן, על ידי ניטור אובדן הפורטוריקנים בניתוח קינטי, ניתן לקבוע את הגנוטיפ של הפורטוריקנים במודלים של ניוון ממבוגרים. לבסוף, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הוכיחה חזקה מאוד לזיהוי של גורמים המסדירים את הקמתה של PCP 20. האפשרות של הבקיע מספר רב של האומטידיה פסיפס לפנוטיפ קוטביות ללא הצורך בחלקים, מאפשרת קביעה מהירה של דרישת יחסי הציבור להקמתה של PCP. עם זאת, ניתוח של יושרת יחסי הציבור עדין ידרוש חתך מסורתי ואחריו שלב בניגוד או microscopies האלקטרוני. לסיכום, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT פותחת אפשרויות חדשות לסינון פסיפס יעיל כדי לזהות גורמים המסדירים את תהליכי התפתחות יחסי ציבור ופונקציות יחסי ציבור בוגרים, כגון מולתגובת רע&quot;מ ויכולת קיום.

רשתית דרוזופילה מורכבת מכ -800 יחידות ommatidial (איור 1 א), אשר מאורגנות בדיוק, עם ציר מוגדר וברור של קוטביות (איור 1). כל יחידה מכילה 20 תאים: שמונה תאי קולטי אור (PRS) ו12 תאי אבזר, כוללים תאים חרוטים, תאי פיגמנט וזיפי תאים 1,2. שני סוגים של יחסי הציבור נבדלים על בסיס הסוג של רודופסין (Rh) שהם מבטאים. שישה הפורטוריקנים החיצוניים (R1-6) להביע RH1 ומסודרים בתבנית בצורת טרפז (איור 1 ג). במרכז הטרפז, שני הפורטוריקנים הפנימיים (R7/R8) להביע את ארבעה סוגים אפשריים של רודופסין (Rh3, Rh4, Rh5 או Rh6) ומאורגנים כך שR7 שקרים על גבי R8 3. יותר מ 2,500 גנים מעורבים בהמורפוגנזה של העין דרוזופילה 4, אשר הוכיחה את מודל חזק מאוד ללימודים של פנל רחב של תהליכים, כוללים deve העיןlopment, גיוס יחסי ציבור, בידול, קוטביות תא מישוריים, המורפוגנזה, הישרדות, אפופטוזיס ותמרה חזותית 5-9. חוקרים עובדים על העין דרוזופילה יש, במשך שנים רבות, פיתחו טכניקות הדמיה הרשתית וביצוע מסכי גנטיים שיטתיים. הדרך הקלה ביותר לתמונת הרשתית המבוגר היא להסתכל על הקרנית בבעלי חיים משותקים (איור 1 א). המבנה של הקרנית יכול להיות דמיינו דווקא על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים סורק והיה בשימוש במסך גנטי בקנה מידה גדולה על ידי קונסורציום URCFG <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">(http://www.bruinfly.ucla.edu)</a> 10. זוהי גישה יעילה מאוד להמחשת שינויים הגלובליים מורפולוגיים במבנה קרני, כגון חספוס עין או ברק, לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות בגנים השולטים בשלבים מוקדמים בהתפתחות או כדאיות תא. עם זאת, להדמיה הגלובלית של הקרנית היא לא sufficient לזהות את הגורמים המסדירים את כדאיות המורפוגנזה או יחסי ציבור יחסי הציבור מבוגרים rhabdomere ותפקוד. ניתוח מסוג זה דורש חקירה יסודית יותר של יושרת יחסי הציבור, המבוססת על מיקרוסקופ שלב בניגוד סעיפים שרף חצי דקים המשיקים של 11-13 הרשתית. טכניקה זו מתאימה לניתוחי פסיפס, שבה ניתן לזהות הפורטוריקנים מוטציה על ידי חוסר 14,15 הפיגמנט האדום שלהם. יכולים גם להיות דמיינו שיבוטים מוטציה פסיפס ובניתוחים כל ההר של רשתית גלמים או מבוגר, על הבסיס של חוסר החלבון פלואורסצנטי ירוק אות (GFP) במיקרוסקופ פלואורסצנטי 16,17. שתי טכניקות אלה שימושיות מאוד, אבל שניהם עבודה וזמן רב ולכן אינו מתאימים להקרנה בקנה מידה גדולה. אנו ואחרים פיתחו את השימוש בטכניקות נטרול קרנית להדמיה של הפורטוריקנים ייצור חלבוני ניאון 18,19, כדי להקל על יחסי ציבור מהירים מנתח. בעזרת טכניקה, זה מוטציהניתן לזהות שיבוטים על בסיס autofluorescence של הפיגמנט האדום (w +) בשיבוטי דרוזופילה מבוגרים פסיפס. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת את הרזולוציה התא הבודד הדרושה לטיפול באוטונומית תא מנפיקה 19. התגברנו על בעיה זו על ידי פיתוח שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, המשלבת את ההדמיה של חלבוני ניאון על ידי נטרול קרנית עם רקומבינציה mitotic 20. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה, זיהוי מהיר ומדויק של הפורטוריקנים מוטציה בשיבוטי פסיפס, ברזולוציה של תא בודד <a href="http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/" target="_blank">(http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/).</a> הוא מתאים לשימוש בניתוחים הקינטית, לבא הפורטוריקנים בודדים על פני תקופה של שבועות בחיים דרוזופילה. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT וטיפים לשימוש בו בניתוחים פשוטים, הקינטית של עיני פסיפס.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Agarose</td>
			<td>
				Euromedex</td>
			<td>
				D5-E</td>
			<td>
				Regular agarose is used to immobilize the flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Petri dish</td>
			<td>
				BD Falcon</td>
			<td>
				353001</td>
			<td>
				35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Cold-ice water</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				To maintain the flies anesthetized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				[HEADER]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Dissecting microscope</td>
			<td>
				Dutcher</td>
			<td>
				SMZ645</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Water Bath</td>
			<td>
				Julabo</td>
			<td>
				9550102</td>
			<td>
				To keep the agarose solution at warm temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				40X Water objective</td>
			<td>
				Zeiss</td>
			<td>
				420967-9900-000</td>
			<td>
				Water dipping objective for the confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

	&nbsp;

the tomato/gfp-flp/frt method for live imaging of mosaic adult drosophila photoreceptor cells

עין דרוזופילה נעשתה שימוש נרחב כמודל למחקרים של התפתחות וניוון עצבי. עם טכניקת רקומבינציה mitotic רבת עוצמה, מסכי גנטיים אלגנטיים המבוססים על ניתוח משובט הובילו לזיהוי של מסלולי איתות מעורבים בפיתוח העין וקולטי אור בידול (PR) בשלבי זחל. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, אשר יכול לשמש לניתוח משובט מהיר בעין של חיים הבוגרים דרוזופילה. תאי קולטי אור פלורסנט הם צילמו עם טכניקת נטרול קרנית, ברשתית עם שיבוטים פסיפס שנוצרו על ידי רקומבינציה בתיווך flipase. לשיטה זו מספר יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית קלאסי של הרשתית: ניתן להשתמש בו להקרנת תפוקה גבוהה והוכיח את השיטה יעילה לזיהוי הגורמים המסדירים הישרדות יחסי ציבור ותפקוד. זה יכול לשמש גם לניתוחים הקינטית של ניוון יחסי ציבור באותו ענים חייםאל פני כמה שבועות, כדי להדגים את הדרישה לגנים ספציפיים להישרדות יחסי ציבור או פונקציה בזבוב הבוגר. שיטה זו היא גם שימושית לטיפול בבעיות אוטונומיה תא במוטנטים התפתחותית, כגון אלה שבהקמתה של קוטביות תא מישוריים מושפעת.

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה או ביטוי מחוץ לרחם על ההתפתחות וההישרדות של הפורטוריקנים ברשתית דרוזופילה. זה מהיר, מה שהופך אותו אידיאלי למטרות הקרנה, כפי שמודגם 20 לאחרונה. הנוכחות של הפורטוריקנים מוטציה ליד הפורטוריקנים wild-type באותה העין עושה את זה קל לזהות פגמים הקשורים הפורטוריקנים מוטציה ולהתייחס לנושא האוטונומיה תא. הליקויים התפתחותיים נצפו בניתוח שלנו מושפעים תהליכים שונים, ובכלל זה גיוס יחסי ציבור, המורפוגנזה וקוטביות תא מישוריים ההקמה (PCP) (איור 5). שבעה שלא בפניו הוא נדרש לגיוס יחסי ציבור, במיוחד עבור R7 אחד יחסי הציבור הפנימיים. האובדן של שבע בתוצאות שלא בפניו באובדן של יחסי הציבור הפנימיים וכמה פורטוריקנים חיצוניים (איור 5 א). הראש מגורען (grh) מעורב בהקמת PCP וכמה האומטידיה הן inverted בgrh שיבוטים מוטציה (איור 5). שיטה זו מאפשרת לזהות את הפורטוריקנים המוטציה בהאומטידיה פסיפס, להקל זיהוי של הפורטוריקנים בהם נדרש הגן לרכישה הנכונה של PCP. הראנו grh שנדרש לרכישה הנכונה של PCP במבשרי R3 20. ואכן, אנו ציינו כי, בהאומטידיה ההפוכה, R4, שמקורו באופן חריג ממבשר R3, תמיד היה מוטציה. פירורים (Crbs) הוא חלבון קרום הפסגה נדרש להמורפוגנזה rhabdomere 23. אובדן Crbs בתוצאות המוטציה Crbs 11A22 בהפורטוריקנים לא סדירים, גדולים יותר או קטנים יותר (איור 5 ג). גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים אחת במהלך הבגרות (איור 6). הוא אידיאלי עבור מחקרי ניוון מוחיים, כי קבוצה של הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים ניתן לראות וניתן למצוא אותה הקבוצה באותה עיןאותו לעוף על פני תקופה של ימים או שבועות. ניתן, אפוא, לקבוע איזה הפורטוריקנים לשרוד ואשר נידונו למות, כי כל שיבוט יש צורה ייחודית שניתן להכיר כאשר העין ממוקמת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כרשתית מקוטבת, ניתן לכוון את הרשתית כדי למצוא את אותו השיבוט שוב, על בסיס צורתו. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי להראות שfatp k10307 מוטציה גורמת להתנוונות יחסי ציבור מתקדמת בבגרות (איור 6, 24). גם שיטת הדמיה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את האוטונומיה תא. בfatp k10307 רשתית פסיפס, אובדן יחסי הציבור הוגבל לfatp הפורטוריקנים מוטציה, הפורטוריקנים פראי מהסוג להיות מושפעים. הדרישה של fatp לכדאיות יחסי ציבור ולכן תא אוטונומי. היינו גם יכול להציל את יחסי ציבור המוטציה fatp ידי reexpressing fatp wild-type עם נהג RH1-Gal4 ולבנות כטב&quot;מ-fatp (איור 7).אפשרות של ביצוע ניסויי הצלה כזו היא אחד היתרונות של שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT על ניתוח משובט המבוסס על סעיפים היסטולוגית של רשתית-מוטבע שרף. אכן, זיהוי משובט עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT אינו מושפע מהשימוש בP (כטב&quot;מ, W +) מבנים מהונדסים, ואילו פיגמנטציה האדומה הקשורים לגן המיני לבן (w +) מכסה את העין עם הפיגמנט האדום , מיסוך שיבוטים פסיפס בסעיפים היסטולוגית. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig1.jpg" /> איור 1. ארגון של העין דרוזופילה. (א) תצלום של העין דרוזופילה נלקחה עם סטראו. עין דרוזופילה מורכבת מכ 800 אומטידיה. (ב) תרשים סכמטי של תחום 64 האומטידיה באמצע של העין. שישה תאי עצב קולטי האור חיצוניים (PRS) של כל אומטידיום,מוצג בירוק, מאורגנים בטרפז סטריאוטיפי המצביע על הקטבים הקרובים ביותר של העין. הם כתוצאה מכך מצביעים בכיוונים מנוגדים בגחון והחלק הגבי של העין והם תמונת ראי לדברי את הגבול בין שני חלקים, הנקרא קו המשווה. תרשים סכמטי (C) של אומטידיום. כל אומטידיום מכיל שמונה הפורטוריקנים. הפורטוריקנים R1 לR6, המוצג בירוק, נמצא הפורטוריקנים החיצוניים. הם מבטאים את rhodopsin1 המולקולה רגיש (RH1) והם המקביל של תאי מוט יונקים. הפורטוריקנים הפנימיים, R7 ו R8, מוצגים באפור (R7 יושב על גבי R8). הפורטוריקנים הפנימיים להביע rhodopsin 3, 4, 5 או 6 והם המקביל של תאי חרוט יונקים. לשם פשטות, רק rhabdomere, החלק רגיש לאור של יחסי הציבור, מוצג עבור כל יחסי ציבור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <imgalt = &quot;איור 2&quot; עבור: תוכן ברוחב = src &quot;4.25in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50610/50610fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. יצירה באופן חזותי שיבוטים יחסי ציבור פסיפס בעיני דרוזופילה עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. (א) תרשים סכמטי של הדור של שיבוטים פסיפס בשיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. שיבוטים פסיפס נוצרים על ידי רקומבינציה mitotic, בשל הביטוי של flipase (תחת שליטה של ​​האמרגן חסר עיניים) במהלך התפתחות העין ורצפי FRT. לאחר רקומבינציה של רצף FRT וחלוקת תא, מוטציה הומוזיגוטים, פראי מסוג הומוזיגוטים ותאים הטרוזיגוטיים יכולה להיות שנוצרה מתאים הטרוזיגוטיים. תאים אלה מתחלקים שוב ליצירת שיבוטים פסיפס של הפורטוריקנים בעיניים המבוגרים. זיהוי של תאים שעברו מוטציה הוא הקל על ידי הוספת מבנה המבטא את tdTomato חלבון פלואורסצנטי האדום לכרומוזום wild-type, לתייג wild-type ו תאים הטרוזיגוטיים. ויזואליזציה (B-B&#39;&#39;) של שיבוטים יחסי ציבור פסיפס עם tשיטה שהוא העגבניות / GFP-FLP / FRT. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT משלבת רקומבינציה mitotic, ניטרול הקרנית ומיקרוסקופיה confocal. כל הפורטוריקנים להביע GFP ירוק ניאון החלבון, המאפשר ההדמיה של הפורטוריקנים באמצעות נטרול קרנית ומיקרוסקופיה confocal (ב &#39;). ניתן דמיינו הפורטוריקנים ברמת תא בודד. שיבוטים פסיפס מוטציה מופקים על ידי רקומבינציה mitotic ויכולים להיות מזוהה על ידי היעדר tdTomato האדום ניאון החלבון (ב &#39;). כתוצאה מכך, בתמונות הממוזגות, הפורטוריקנים הומוזיגוטים מופיעים בירוק, בעוד הפורטוריקנים wild-type ו הטרוזיגוטיים הם צהובים (ב&#39;&#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig3.jpg" /> איור 3. הגדרת דרוזופילה לvisualizatיון על ידי נטרול קרנית. (-&#39;&#39;&#39;&#39;) תצלומים של דרוזופילה משותקים על צלחת מלאה בagarose. בפנל&#39;&#39;&#39;&#39;, חתיכת agarose המכילה הזבוב נחתכה כדי לצלם פרופיל. דרוזופילה היא חצי משובצת בagarose, עם אגף ימין בתוך agarose והשמאל תקוע על פני השטח agarose (,&#39;&#39;,&#39;&#39;&#39;&#39;). כאשר דרוזופילה מוטבעת בagarose, הראש שלה ממוקם לעתים קרובות בצורה גרועה להדמיה של העין (, &#39;). הראש לכן יש reorientated עם מלקחיים כך שהאמצע של העין כלפי מעלה (&#39;&#39;,&#39;&#39; &#39;). (B-B&#39;) תרשים סכמטי המציג דרוזופילה משותק על צלחת agarose והמיצוב של דרוזופילה תחת המטרה של המיקרוסקופ תצלומים. (C-C &#39;) של ההגדרה של דרוזופילה על במתמיקרוסקופ תחת המטרה שלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig4.jpg" /> איור 4. נטייה של העין לניתוח בזמן כמובן. איור מציג תצלומים של ראש דרוזופילה בשתי אוריינטציות שונות והשדות המתאימים של האומטידיה שנצפו על ידי נטרול קרנית, מיוצגים כדיאגרמות סכמטי. (א) במהלך התצפית הראשונה, העין ממוקמת כך ששיבוט של הפורטוריקנים הטרוזיגוטיים או wild-type (בצהוב) נתפס באמצע השדה, ברמה של קו המשווה (קו אדום). (ב &#39;) במהלך התצפית השנייה, העין היא לעתים קרובות לא בדיוק באותו הכיוון. לכן, ניתן למצוא אותה הקבוצה של הפורטוריקנים שוב, אבל זה לא אפשרי כדי להציגאותו מדויק שדה (משמאל). העין חייבת להיות ההתמצאות לאותו שדה כדי לראות שוב. עמדתו של קו המשווה יכולה לשמש כמדריך. בדוגמא זו, אנו יודעים כי השדה שנצפה הוא הגחון מדי, וכי העין ולכן צריכה להיות מופעלת ventrally למקם את קו המשווה באמצע השדה שנצפה שוב, כמו בתצפית הראשונה. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות לליקויי התפתחות יחסי הציבור זוהו על ידי שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. (א) ויזואליזציה של הפורטוריקנים סינא פסיפס [BG02648] מוטציה, מראה את האובדן של הפורטוריקנים פנימיים. בהאומטידיה המוטציה, הפורטוריקנים חיצוניים מקובצים יחד בשל היעדר יחסי הציבור R7 הפנימי. ואכן, סינא ידוע להידרש לגיוס יחסי ציבור פנימי. ויזואליזציה (ב) לgrh פסיפס [s2140] הפורטוריקנים מוטציה מראים פגמים קוטביות. האומטידיה, surr המוטציה הפסיפסounded על ידי מעגל, מצביעים בכיוון ההפוך מהאומטידיה הסוג פראי, מה שמעיד על היפוך dorso-הגחון. מחקר מפורט בשיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הראה כי grh נדרש במבשרת R3 לרכישה הנכונה של קוטביות אומטידיום 20. ויזואליזציה (C) של הפורטוריקנים CRB פסיפס [j1B5] מוטציה, מראה הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מעוות. CRB ידוע להידרש להמורפוגנזה rhabdomere. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig6.jpg" /> איור 6. הניתוח בזמן במהלך fatp פסיפס [k10307] הפורטוריקנים מוטציה עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, מעל 14 ימים. fatp פסיפס [k10307] רשתית מוטציה הוא ציין ביום 1 (, &#39;), יום 4 ( ב &#39;, ב&#39;), יום 8 (C, C &#39;) והיום 14 (ד&#39;, ד &#39;) לאחר הבקיעה. אותה הקבוצה של הפורטוריקנים פסיפס יכולה להיות founד בכל נקודת זמן, בתחום הנצפה (מלבן לבן, A, B, C, D). בתחום זה של הפורטוריקנים (א &#39;, ב&#39;, ג&#39;, ד &#39;), הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מסומנים בירוק, ואילו הפורטוריקנים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים פראי מסוג מסומנים בצהוב. מיום 4 (ב &#39;) ואילך, הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מתחילים להיעלם, המציין כי fatp [k10307] מוטציה גורמת לניוון הדרגתי של הפורטוריקנים אלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50610/50610fig6large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig7.jpg" /> איור 7. הצלה של fatp [k10307] הפורטוריקנים מוטציה עם ויזואליזציה ביצוע מיני לבן לבנות להביע fatp. הפורטוריקנים הפסיפס הם דמיינו עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT בזבובים 15 ימים בת. (א) לשליטת פסיפס הפורטוריקנים. (ב) Visualization של הפורטוריקנים פסיפס fatp מוטציה, מראים את האובדן של הפורטוריקנים מוטציה ויזואליזציה. (C) של פסיפס fatp הפורטוריקנים מוטציה בfatp זבוב reexpressing ביחסי הציבור חיצוני (RH1&gt; fatp). הפורטוריקנים המוטציה הם חולצו. הנוכחות של גן מיני לבן ופיגמנטציה העיניים האדומה הקשורים בRH1&gt; תנאי fatp אינו משנים עגבניות או GFP הקרינה או זיהוי משובט.

Watch this Scientific Journal Video about The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells at JoVE.com

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי קולטי אור.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

the-tomatogfp-flpfrt-method-for-live-imaging-mosaic-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

17.9K Views.  Ecole Normale Supérieure de Lyon.  שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי ק...

Video: The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...