Yazarlar Kami Harris için astar tasarım, Ashley McKibbon ve Jessica Thomas-Ebbett filme ve John Blakely, Alexandra Foley-Münir, Chris Langley, Julie Lewis, Kelsey McIntyre, Ashley McKibbon, Chris Zinck ve Rosie köpek görünmesini için teşekkür etmek istiyorum video. A. M. K. Kanada Lyme hastalığı Araştırma Vakfı tarafından desteklenen ve proje finansman Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) tarafından sağlandı. M. K. d. W. maaş New Brunswick yenilik Vakfı (NBIF) üzerinden fon aldı.

1. keneler DNA izolasyonu
<ol><li>Keneler alan koleksiyonu veya pasif güvenlik kayıtlarından veterinerler ve kamu üyeleri aracılığıyla elde etmek. Keneler dondurarak öldüren, mühürlü bir çantaya yerleştirilir ve oda sıcaklığında gönderilecek gerekir.<ol>
<li>Gönderme formu kullanarak, karşılaşma, kene eki durumu, ana türler ve son seyahat tarihi konağın coğrafi konumu ve tarihi hakkında bilgi toplayabilir.</li>
		<li>İç içe geçmiş PCR için kirlenme doğal olarak savunmasız olduğu için laboratuvar çalışma alanı çapraz-pozlama örneklerin en aza indirmek için ayarlandığından emin olun. Bu protokol farklı unsurları iyice temizlenmeli ve sterilize de birbirinden izole ayrı, özel alanlarda içinde yürütme içerir ve tüm aletleri sağlanması kirleticiler ücretsiz.</li>
		<li>Numune alınması, üzerine kene fotoğrafını çekip türler, gelişim aşamasını, seks ve şişkinliği durumunu bir kimlik anahtar32 ' ye kıyasla belirlemek.</li>
		<li>Aseptik şartlarda bir steril jilet veya skalpel kullanarak kene bisect ve iki kene parçaları ayrı microcentrifuge tüpler içine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplam DNA ayıklamak için PCR uyumlu şablon verir herhangi bir yalıtım yordamı kullanın; Bu iletişim kuralı basit bir şelasyon tabanlı yaklaşım gösteriyor.<ol>
<li>Kene parçası litik şelasyon reaktif (genellikle 50-200 µL arasında) uygun bir ses ekleyerek başlayın. Tutarı örnek boyutu ve şişkinliği durumuna bağlıdır; yönergeleri üretici tarafından sağlanmalıdır. Microtube havaneli kullanarak lunaparkçı.</li>
		<li>Bir su banyosunda 45 dk ve girdap için 60 ° C'de örnekleri kısaca kuluçkaya.</li>
		<li>Örnekleri için 16,276 x g (13,300 devir/dakika), 4 dk santrifüj kapasitesi bir masaüstü microcentrifuge.</li>
		<li>Süpernatant 50 µL isopropanol, mix inversiyon ve yeniden santrifüj kapasitesi olduğu gibi (1.2.3) içeren bir taze, etiketli microtube aktarın.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak ve DNA Pelet 50 µL % 70 etanol ile durulayın.</li>
		<li>Bir pipet ile aşırı etanol kaldırmak ve Pelet oda sıcaklığında 15 dakika kurumasını bekleyin.</li>
		<li>DNA resuspend için 1 mM Tris pH 7,0 50 µL ekleyin ve bir su banyosu 60 ° C'de 1 h için örnekleri kuluçkaya DNA şimdi gelecekteki moleküler analiz için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. iç içe PCR algılanması Borrelia OspA ve FlaB.
Not: Lorenz, 201233genel PCR ilkeleri ve uygulamaları genel bir bakış sağlanır.
<ol><li>Sentez veya Borrelia gene özgü dış ve iç Oligonükleotid astar alın. Astar setleri, onların anılan sıraya göre amplicon boyut ve erime sıcaklıkları için bkz: Tablo 1 .</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Astar adı</td>
			<td>Gene hedef</td>
			<td colspan="2">Sıra (5' - 3')</td>
			<td>Amplicon boyutu</td>
			<td>Tavlama sıcaklığı</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB Fw dışarı</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB Rv dışarı</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw flaB</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB Rv içinde</td>
			<td>FlaB</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 bp</td>
			<td rowspan="2">55° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Out Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Fw içinde</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 bp</td>
			<td rowspan="2">58° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv içinde OspA</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Astar Borrelia burgdorferiFlaB ve OspA nPCR için iç ve dış. Uygulamada, B. burgdorferi s.s. ve diğer yakından ilgili Borrelia genospecies, sadece B. burgdorferi s.s. OspA astar yakalamak iken FlaB astar algılamak amplifikasyon her iki loci üzerinden B. göstermek burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>UV ışık ve % 70 etanol PCR dolapla önceden sterilize. Not: potansiyel örnek kirlenme en aza indirmek için bu çalışma alanı kene diseksiyon, DNA ekstraksiyon, konumdan farklı olmalı ve Elektroforez jel.<ol>
<li>İlk PCR koşmak için dış astar DNA yukarıdaki 1,0 iyileşti ve Tablo 2' de açıklandığı gibi tepki karışımı ayarlayın şablonuyla birlikte kullanın. Buna paralel olarak, doğrulanmış Borrelia DNA oluşan denetim çalışır ve no-şablonu reaksiyonlar reaktif ve aerosol kirlenme tespit etmek de dahil olmak üzere negatif kontrol çalışan olumlu gerçekleştirin. DNA reaktifler olası bulaşma en aza indirmek için sona ekleyiniz. Her tüpün hiç otelde reaktifler değil eklenmektedir ve tüpler yakın hemen sonra DNA toplama ve diğer tüpler açılmadan önce kez kapalı olduğunu emin olun.</li>
		<li>Aşağıdaki gibi bir termal cycler programı: 95 ° C 5 dakika; 40 devredir 15 95 ° c sıcaklık 30 tavlama s, s, 45 72 ° C s; 72 ° C 5 min için; 4 ° C'de tutun</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR (2.2.2 içinde üretilen) ilk PCR ürününün 2 µL ile iç astar kullanmak dışında ilk tepki benzer ikinci tur gerçekleştirmek. Not: Tepki birimleri yeniden Tablo 2' de verilmektedir. Şablon DNA son eklenen ve tek tüpler bir örneğe karşılık gelen bir zaman açıktır sağlayarak amplicons Çapraz bulaşma kaçınmak için özen göstermelidir. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
				<td>PCR # 1 birimleri</td>
				<td>PCR # 2 birimleri</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq polimeraz Master Mix 2 X</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
				<td>12.5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nükleaz ücretsiz su</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
				<td>8,5 ΜL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µM ileri ve geri astar</td>
				<td>1.0 µL dış astar</td>
				<td>1.0 µL iç astar</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA şablonu</td>
				<td>Örnek çıkarma (1.2.7) üzerinden 2.0 µL</td>
				<td>2.0 µL PCR (2.2.2) yuvarlak 1</td>
			</tr>
</tbody></table>
Tablo 2: PCR reaksiyon karışımları için birinci ve ikinci Arttırımlar. 
	 
	<ol>
<li>Daha önce olduğu gibi termal cycler programı ama (tablo 1'e bakınız) iç astar karşılamak için tavlama sıcaklığı ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. özel Jel Elektroforez ve görüntüleme
Not: DNA tarafından Elektroforez ayıran temel yönergeleri için bkz: Lee ve ark., 201234.
<ol><li>1 X seyreltilmiş 20 X SB tampon (0.2 M NaOH, 0, 8 M Borik asit pH 8) kullanarak bir % 1.2 özel jel hazırlamak ve jöleyi ön boyama isteniyorsa dökülmeden önce yaklaşık 5 µL DNA leke ekleyin.</li>
	<li>10 µL ikinci (iç) PCR reaksiyon gelen her deneysel ürün ve yanı sıra 100 bp merdiven (5 µL) denetimi örneğini yükleyin.<ol>
<li>107, 1 h için electrophorese V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntülemek ve bir transilluminator ve ilişkili kamera ve yazılım kullanarak jel belge.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kullanım on yıl içinde PCR tabanlı teknikleri sürekli Eklem bacaklılar ve memeli örnekleri Borrelia tespiti onların değeri kanıtlamıştır Borrelia çevresel veya klinik kökenli gelir. PCR gözetim önceden varolan yaklaşımlar üzerinde birçok yenilik sunuyor. Özellikle, geliştirme ve Antikor Reaktif performansını üzerinde bağımlı değildir ve bunun yerine kolayca sadece astar sıralarını değiştirerek ilgi yeni hedefler tespit etmek için uyarlanabilir. PCR da tek başına veya bir multiplex tepki ile paralel, birden çok loci değerlendirilmesi barındırır. Taze ve arşivlenmiş keneler22, hayvan veya insan vücut sıvıları ve rezeke doku25de dahil olmak üzere çeşitli numune girişleri için uygulanabilir. PCR da daha fazla, restriksiyon enzimi sindirim, sonda hibridizasyon veya sıralama artan mikrobiyal kimlik21içgörü sağlamak için örneğin işlenebilir amplicons verir.
Konak immün yanıt üzerinde enfeksiyon ikincil bir ölçüsü olarak güvenmek yerine, bakteriyel varlığı hakkında doğrudan bir bilgi vermez gibi klinik bir araç olarak PCR standart serolojik teşhis için kavramsal olarak tercih edilir. Ancak, Lyme borreliosis nispeten mütevazı bir mikrobiyal yükü ile ilişkilidir (< idrar veya plazma 50 organizmalar/mL) ve25için yanlış negatif çıkmasına neden olabilir geçici spirochetemia neden olur. Bu teknik klinikte duyarlılığını önemli ölçüde doku türü, enfeksiyon ve örnek durum, aşamada % 12,5 ve kan, beyin omurilik sıvısı ve biyopsi doku36varolan çalışmalarda % 62 arasında düşülüyor bağlı olarak değişir. PCR bakteri kültürü ardından üstlenilen uygun spirochetes kurtarma klinik örneklerin en benzer şekilde zor kanıtlamıştır ancak moleküler duyarlılık sınırlamalar bir endişe değildir. Ancak son zamanlarda iletişim kuralları daha yüksek verim35için optimize edilmiştir. Bu arada, virüslü yetişkin kene gut ortalama olarak her yerde 2.000 nPCR algılama aralığı içinde sağlam olan 50.000'i aşkın Borrelia37,38,39, liman. Böylece, protokol kene gözetim çabalar için uygundur.
Birçok avantajları rağmen nPCR belli sorunlarla ve doğru bir şekilde kene enfeksiyon bu nedenle genler ve amplicons, kalite DNA kurtarmak titiz deneysel iş akışları stratejik seçime bağlıdır bildirmek için bu teknik kapasitesini teşkil etmez çapraz-pozlama örnekleri ve laboratuar ortamında ve reaktifler kirletici bildirmek uygun kontrollerin kullanımı en aza indirirken örnekler. Böylece uygun genetik loci ve bölgeler, seçilebilir herhangi bir deneme önce kapsam ve soruşturma niyetlerini açıkça tanımlanmalıdır. Amaç karmaşık Lyme neden Borrelia burgdorferi s.l. için tarafsız bir ekran sağlamak için ise, astar tüm benzer ilgi ile ilişkili suşlar algılamak için oluşturulacak ve yakalama olmadan amplifikasyon verimlilik, ilgisiz organizmalar25. Yeni astar tasarlanabilir ve uncharacterized örnekler için uygulanan önce biçilen silico her ne kadar onlar da deneysel olarak karşı standart referans doğrulanması gerektiğini astar-BLAST40gibi yazılım araçları kullanılarak izole ediyor. Sağlam mikrobiyal şablon bir karışık çevresel örnek (kene homogenate) kurtarmak için DNA ekstraksiyon yordamı hedefidir. İsteğe bağlı PCR ile devam etmeden önce ayıklanan DNA bütünlüğünü değerlendirmek için bir adımdır. Ayrıca, paralel reaksiyonlar kene bir temizlik gen hedeflemek için kurmak olabilir. İkinci yöntem da olumsuz Borrelia tepkiler organizmanın ve değil bir inhibitör kirletici varlığı nedeniyle olduğunu artan güven sağlayan tepki karışımı inhibitörleri varlığını gösterebilir.
İç içe geçmiş PCR yaklaşım duyarlılık arttı yanlış pozitif sonuçlar üretir potansiyel kirlilik pahasına geliyor. Eksojen şablonu bir örnek için kene diseksiyon ve DNA kurtarma sırasında veya kadar dış ve iç amplifikasyon tepkiler kurma sürecinde tanıttı. Bu nedenle özellikle PCR şablonu veya amplicon önlemek için en iyi uygulama protokolleri takip etmek önemlidir Çapraz bulaşma. Bunlar ayrı iş istasyonları ile bağımsız airflows, kapsama kullanımı PCR ve biyolojik Emanet dolapları uygun olan durumlarda, dahil kapsamlı kimyasal ve fiziksel temizlik ve sterilizasyon yüzeyler ve reaktifler ve DNA dikkatli işleme 41. No-şablonu denetimler de hisse senedi reaktifler kirlenme belirlenmesinde hayati vardır. NPCR belirli bir açığı bu işleme amplicon ilk tepki ürünleri ikinci PCR damar aktarma oluşur olduğunu. Hedef DNA zaten olumlu örnekler üstel zenginleştirme uğramıştır beri bu adımı Çapraz bulaşma özellikle eğilimli ve bir tek tüp nPCR protokol bu sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, her iki kümesini astar için belirli bir gen de birlikte PCR31her iki tur için mühürlü kalacak bir tepki tüp eklenir. Öyle ki dış çift şablonu için iç astar yasak olduğunu yüksek tavlama sıcaklıkta yükselterek dış ve iç astar çiftleri thermodynamically farklı olması gerekir. İkinci turda, tavlama sıcaklığı iç çift karşılamak için indirilir. Sadece bu potansiyel karıştırıcı bir adım atlamak yok, Ayrıca ek kullanımına izin verir Anti-kirlenme ölçer31,42. Ancak, bu değişiklik bazı tahlil duyarlılık kurban. Yaklaşım ne olursa olsun, teknik çoğaltır bağımsız olarak bir örnek üzerinde gerçekleştirilen artırıldığında sahte kirlenme tanımlamak için yardımcı olacaktır.
Moleküler teknikleri nPCR giriş beri gelişmeye devam etmiştir ve bu yeni yaklaşımlar, mali gider artmış da olsa özgün tasarımlar, select avantajlar sunuyor. Adından da anlaşılacağı gibi kantitatif PCR (qPCR veya gerçek zaman (RT)-PCR) geleneksel teknikleri doğa43nitel olmakla birlikte bir örnek patojenler numaralandırılmasına olanak sağlar. QPCR duyarlılığını bildirildi nPCR38, benzer olsa da astar özellikleri28bağlı olarak değişebilir. Moleküler işaretleri (MB) geleneksel TaqMan sondalar yerine kullanır qPCR bir varyasyonu da Borrelia algılama içinde klinik örneklerin44,45,46söz göstermiştir. Kendi benzersiz ikincil yapı nedeniyle moleküler işaretleri bildirildi alt arka plan Floresans ve böylece üstün hassasiyet47sağlayarak daha yüksek meşru sinyalleri üretmek. Önceden klinik değerlendirme bir ve on spirochetes44,45arasında bir potansiyel algılama eşiği öneririz. Ayrıca, aynı anda bir memeli ev sahibi gen44 ve diğer kene patojenler45, hangi ile nPCR olarak kolayca ulaşılabilir değil algılamak için çok katmanlı reaksiyonlarda tekniği başarıyla uygulandı. Diğer tasarım değişiklikleri DNA bir standart eğri39,48kullanmadan ölçmek damlacık dijital PCR (ddPCR) teknolojisini içerir. Daha düşük algılama bu tekniğin için Borrelia aynı şekilde yaklaşık on spirochetes/örnek39sınırıdır. Onlar sadece bir tek amplifikasyon protokol gerektirir gibi nPCR için karşılaştırıldığında, bu yaklaşımlar da kontaminasyon için azaltılmış potansiyel avantajı var.
Gözetim amacı yerine bir kene çeşitli bakteri içeriğini profil ise, 16S rRNA metagenomic tarama bir çekici bir seçenek49olur. Bu yaklaşım costlier, tüm moleküler biyoloji laboratuvarlarında bulunamadı özel DNA sıralayıcılar için ve daha sofistike yorumu Biyoinformatik tabanlı gerektirir rağmen bu mikroplar daha geniş bir yelpazede doğru bir şekilde yakalayabilirsiniz vektör patojen yük temsil eder.
QPCR ve türevleri kantitatif uygulamaları için seçim yöntemlerini, metagenomics ekranlar kene microbiome geniş stoklar sunar iken ve hedeflenen gözetim çabalar kez varlığı ya da yokluğu ikili raporlama ile ilgili bir vektör bir veya bir kaç patojenler. Bu durumda, bu daha yeni, daha ayrıntılı yaklaşımların gereksiz karmaşıklık ve mali yük sürecine neden olabilir. Bu nedenlerden dolayı nPCR test kene önemli bir teknik olarak zaman test dayanmış.

Lyme hastalığı (LD) kuzey yarımkürede en yaygın vektör kaynaklı enfeksiyon, ve onun insidansı1artmaya devam ediyor. Bu zayıflatıcı hastalığı tarihsel baskın Kuzey Amerika patojen, B. kapsamaktadır (genellikle Borrelia burgdorferi sensu lato veya s.l. olarak adlandırılır), Lyme borreliosis (LB) karmaşık spirocheteal patojenlerin neden olduğu burgdorferi sensu stricto (s.s), B. afzelii ve B. garinii, Avrupa ve Asya yaygın ve klinik önemi2,3gelişen türlerin vardır ek olarak. Bu bakterilerin insanlara virüslü Ixodes keneler2. ısırık aracılığıyla aktarılır Ana Kuzey Amerika vektörel çizimler ı. scapularis ve ı. pacificusolmakla birlikte, bu cins içinde birden çok tür liman ve bakteri4iletmek için bulundu. İnsanlarda, B. burgdorferi cilt, eklemler, kalp, sinir sistemi, endokrin bezleri, gastrointestinal sistem ve iç organlar5,6,7etkileyen çoklu sistem semptomlara yol açabilir, 8,9,10. Hastalık kontrol ve Önleme Merkezi şu anda 300.000'den fazla yeni insan durumlarda her yıl Amerika Birleşik Devletleri11,12tahmin ediyor. Hastalık tanısı ve erken aşamalarında tedavi prognoz genellikle olumlu olsa da, çalışmalar bu yerde arasında % 10 ve tedavi sonrası farklı belirtilerle devam önerilen antibiyotik rejimi alınan hastaların % 60'ı tavsiye ettiler bırakma, bir fenomen olarak sonrası tedavi Lyme hastalığı Sendromu (PTLDS)13,14,15olarak adlandırdığı. Ayrıca, klinik müdahale gecikmeler kene ısırması bilincini, non-spesifik sunuyu ilk hastalık ve enfeksiyon başlangıcında kullanılan geleneksel seroloji tabanlı tanılama düşük duyarlılık eksikliği sonucu olarak ortaya çıkabilir. Hızlı ve uygun bir şekilde tedavi etmek için başarısızlık giderek komplikasyonlar16,17zayıflatıcı, meydana gelen belirti ilerleme sağlar. Lyme hastalığı önleme bu nedenle risk yönetimi taşıdır. Büyüyen bu tehdidi ile savaşmak için stratejiler patojen yaygınlık dilimleri belirtmek için sağlam gözetim önlemler ve endişe coğrafi bölgeleri tanımlar.
Bu makalede iç içe Polimeraz zincir reaksiyonu (nPCR) yardımcı programı enfekte keneler tanımlamak kullanılacak bir moleküler tarama aracı olarak gösterilmektedir. Özgüllüğü artırmak için iki Borrelia gen paralel amplifikasyon için kullanılır. Flagellin B (FlaB) kamçı18büyük filaman protein kodlar ve lipoprotein ürün dış yüzey protein A (OspA) kene midgut aracılık eder iken gen tek doğrusal kromozom üzerinde bulunan kolonizasyon, ve plazmid kodlanmış19,20' dir. İş akışı kene koleksiyonu, DNA ekstraksiyon ve o zaman PCR Borreliaalgılamak için ilk turunda oluşur-belirli loci. Sonraki PCR ürünü ilk tepki olan daha küçük, iç amplifikasyon parçaları oluşturmak için yeni bir şablon olarak kullanır. Her iki Borrelia genler üzerinden iç amplicons özel Jel Elektroforez tarafından tespit edilebilir bir kene Borrelia burgdorferi için pozitif kabul edilir.
Hem nPCR tekniği ve FlaB ve OspA gen hedefleri, yaygın olarak ekolojik gözetim ve Lyme Sfilis klinik algılama erken 1990'larda21,22,23 beri için kullanılmıştır ,24,25. Moleküler protokoller geliştirme önce keneler bağırsak içeriği boyama anti -Borrelia ayirt (Eğer), mikrobiyal kültür veya bunların bir kombinasyonu26subjecting tarafından değerlendirildi. Bu yaklaşımlar yavaş büyüme ve titiz doğa Borrelia27, antikor performans sorunları ve eğer işleme21canlı keneler şartı da dahil olmak üzere içerdiği sınırlamaları muzdarip. PCR daha sonra virüslü vektörler hızlı, hassas ve belirli kimlik sağlamak için kabul edilmiştir. Kültür bağımsız direkt uygulama için başka21,22 test etmek için uygun olacağını ölü ve arşivlenmiş kene gibi çeşitli örnek türleri de dahil olmak üzere geleneksel yöntemler üzerinde işaretli gelişmeler teklif . İç içe geçmiş deneysel tasarımlar daha fazla özgüllük ve klasik PCR hassasiyeti gene özgü astar amplifikasyon25,28iki ardışık tur iki ayrı takım istihdam ederek geliştirmek.
Deneysel başarısı stratejik gen seçimi ve amplicon tasarım üzerinde eleştirel bağlıdır. Borrelia burgdorferivarlığı doğru bir şekilde tahmin etmek için astar ilgili patojenler depreşen spirochetes da Borrelia Sylviidae ile cross-reacting olmadan algılaması gerekir. FlaBsöz konusu olduğunda, bir değişken iç bölge çeşitli bakteri (şekil 1)24,29 tarafından paylaşılır nispeten korunmuş kanat dizileri yerine gen hedefleyerek bu özgüllüğü elde edilir , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> Şekil 1: kullanma gösterildiği gibi nPCR, kavramı Borrelia FlaB bir hedef olarak gen. Gen 5' ve 3' termini organizmalar bu bölgelerini Lyme neden olan patojen belirli değerlendirilmesi için uygun olmayan işleme Borrelia burgdorferi s.l. ötesinde yaygındır. Daha az korunmuş iç dizileri astar hedef olarak kullanılarak, PCR iki tur final, iç amplicon algılamak için yürütülür. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ayrımcı kapasitelerini test, iç FlaB astar 80'den fazla farklı Borrelia yalıtır ile değerlendirildi ve sadece o Lyme hastalığı24ile ilişkili tanımlamak için bulundu. Duyarlılığı daha da Güney amplicon kurutma ve radiolabelled bir hybridizing tarafından geliştirilmiş rağmen nPCR alt algılama sınırı, altı24 ve saf kültür, on31 bakterilerden arasında belgelenmiş oldu veya chemiluminescent sonda. Teknikleri kaplin algılama eşiği tek Sfilis31azaltır. Doğrudan karşılaştırma tarafından geleneksel, unprobed tek yönlü PCR en az 104 spirochetes31varlığı rapor bulundu. Bu, ancak, tahlil duyarlılık ilgisiz DNA ve potansiyel inhibitör maddeler ezici varlığı nedeniyle karmaşık çevre ve klinik örnekleri ile çalışırken düşük olacağı unutulmamalıdır. Bu sorunlar büyük ölçüde nPCR kullanımı ile atlatılabilir.
Son on yıl içinde moleküler teknoloji gelişmeler rağmen nPCR modern gözetim çabalarında bir zımba teknik kalır. Tasarım ve yürütme bu protokol özen, kene vektörel çizimler patojenler varlığı yakalamak için güçlü, uyarlanabilir ve nispeten basit bir yaklaşım tek.

<table><tbody><tr><td>LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0.22 mm thickness</td></tr><tr><td>Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&amp;nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA extraction reagent</td></tr><tr><td>Microtube Pestle</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>Designed for 1.5 ml tubes</td></tr><tr><td>Water bath - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Primer Synthesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cabinet</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>The water comes with the GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power pack&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (Serial number 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

Lyme hastalığı Borrelia burgdorferi sensu lato ailesinin insana enfekte Ixodes kene ısırması ile bulaşan spirochetes neden olduğu ciddi bir vektör kaynaklı enfeksiyondur. Kuzey Amerika'da birincil etyolojik Ajan Borrelia burgdorferi sensu stricto değil. Gibi coğrafi risk bölgeleri genişler, kene enfeksiyon oranları ölçmek ve bulgular klinisyenler, veterinerler ve halkın geneli için iletişim sağlam gözetim programları desteklemek ihtiyatlı olduğunu. İç içe geçmiş Polimeraz zincir reaksiyonu (nPCR) moleküler tekniğin uzun bu amaç için kullanılan ve algılama Borrelia keneler ve yabani hayvanlar ve bitkiler Merkezi, ucuz ve sağlam bir yaklaşımda kalır.
Bu makalede virüslü numuneler tanımlamak için DNA özleri kene için nPCR uygulanması gösterilmektedir. İki bağımsız B. burgdorferi hedefler, genlerin kodlama Flagellin B (FlaB) ve dış yüzey protein A (OspA), kullanılan kapsamlı bu tekniği ile. Kene koleksiyonu, DNA ekstraksiyon ve sonra her iki Borreliaalgılamak için PCR ilk turunda protokol içerir-belirli loci. Sonraki Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ilk tepki ürün daha küçük, iç amplifikasyon parçaları oluşturmak için yeni bir şablon olarak kullanılır. İç içe geçmiş yaklaşım özgüllük ve geleneksel PCR hassasiyeti geliştirir. Her iki Borrelia genler üzerinden iç amplicons özel Jel Elektroforez tarafından tespit edilebilir bir kene için patojen pozitif kabul edilir.

nPCR özellikle karmaşık çevre örnekleri soruşturma altında olduğunda özgüllük ve patojen algılama, duyarlılığını artırmak için zarif bir yaklaşımdır. Şekil 1' de gösterildiği gibi iki tur Borrelia FlaB odağı (ve OspAresimde değil,) stratejik bir bölgede hedefleyen PCR kısa iç nesil aracılığıyla Borrelia burgdorferi bakteri varlığı bildirebilirsiniz amplicons. Jel Elektroforez tarafından çözüldü zaman her kene FlaB ve OspA reaksiyon Urun olabilir görsel olarak attı ve denetimleri karşı karşılaştırıldığında. Şekil 2, benzersiz numune tanımlayıcıları her jel üst kısmında sağlanır ve no-şablonu ve aerosol denetimleri, sol ve sağ, sırasıyla, merdivenler için bitişik temsil edilir.
Sağlam amplicon bantları select deneysel örnekleri açıkça görülebilir ve ihtiyaç fazlası astar ve kalan DNA (Şekil 2) kolayca ayırt edilirler. Belirtilen deneysel tasarım ilkelerine dayanan, bir kene için Borrelia paralel zaman negatif denetimler hiçbir amplifikasyon gösterir ve iç amplicons FlaB ve OspA astar üretilen pozitif olarak kabul edilir. Bu durumda, örnek T907, T604 ve T606 için Lyme patojen (Şekil 2) gözetim kriterlerini karşıladı. By Contrast, T923 sadece OspAiçin birden çok olası açıklaması vardır bir sonuç pozitif: A) kökenli kene Borreliaiçin negatif çıktı, ama dış veya iç OspA PCR hazırlık spuriously ile kontamine yapıldı. Şablon DNA (reaktifler sistemik bulaşma yolu ile negatif denetimleri ekarte Not), B) BorreliaLyme kene taşıdı, ancak düşük şablon tutarlar veya deneysel hata engelledi amplifikasyon FlaBveya C) bir organizma mevcuttu Bu korunmuş OspA sıra yer alan ama Flagellin yoksun veya astar için tavlamak için FlaB hedeflenen bölgede yetersiz kimlik vardı. Gerçekten de, OspA sıra benzerlikler bitki ve hayvan28da dahil çeşitli gözlemlemekteyiz. Converse durum, daha fazla amplifikasyon Flagellin gen, ama OspA gene korunmuş, ilişkili bir Borrelia tür olduğunu gösterebilir. Uygulamada, bu iletişim kuralını senaryo 'A' en muhtemel açıklama olduğunu düşündüren FlaB astar yapmak daha fazla OspA tek pozitif sonuç verir. Çekişmeli numune deneysel analizi daha fazla, ancak, bu tek pozitif sonuç kaynağını belirlemek mümkün değildir. Belirsiz örnekleri üzerinde gerçekleştirilen teknik çoğaltır sayısını artırarak spuriously önceki tepkiler sunulan herhangi bir kirletici arşivlenmiş DNA'mevcut olmaz bu yana doğru onların durumu, uzlaştırmak için yardımcı olabilir. Ancak, bu astar sonraki reaksiyon kesin sonuçlar sağlamak için başarısız olursa, diğer Borrelia loci PCR tarafından soruşturma. Bu tepkiler oluşturulan Amplicons Ayrıca sıralı ve yalıtır arasında kimlik atamak ve gerilme sapma derecesini tahmin etmek için karşılaştırıldığında. Sapı ve arkadaşları insan klinik örnekler35kullanarak bu iş akışı için bir örnek sağlar.
Tüm faktörler olarak kabul, anahatları belirlenmiş iletişim kuralı ve yorumu kriterleri %0.17, %0.0063, yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları sırasıyla verim için tahmin edilmiştir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> Resim 2 : Hafiye-in Borrelia burgdorferi nPCR tarafından tek tek dilimleri FlaB ve OspA. Her kene için atanan kodları jelleri üst kısmında gösterilir ve kimlik tespiti OspA ve FlaB her örnek içinde bildirmek için dikey olarak hizalama. Şerit B sol tarafındaki görüntü temsil no-şablonu denetimler biletlerinde (sağ şerit) laboratuar ortamında kirlenme yakalamak için aerosol denetimleridir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR at JoVE.com

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

İç içe geçmiş PCR DNA Borrelia burgdorferiiçin hastalığının Lyme hastalığı araştırma ayıklar kene için uygulanan hassas, belirli ve basit bir tekniktir. İlk PCR deney gene özgü astar iç primerler kullanılarak bir sonraki tepki için şablonlar haline uzun amplicons oluşturmak için kullanılır.

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

detecting-lyme-disease-spirochete-borrelia-burgdorferi-ticks-using

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

17.9K Görüntüleme.  Mount Allison University. İç içe geçmiş PCR DNA Borrelia burgdorferiiçin hastalığının Lyme hastalığı araştırma ayıklar kene için uygulanan hassas, belirli ve basit bir tekniktir. İlk PCR deney gene özgü astar iç primerler kullanılarak bir sonraki tepki için şablonlar haline uzun amplicons oluşturmak için kullanılır.

Video: Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Genetik

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was developed to detect the conserved region of the nucleoprotein (N) gene of lyssaviruses. The method applies reverse transcription (RT) using viral RNA as template and oligo (dT)15 and random hexamers as primers to synthesize the viral complementary DNA (cDNA). Then, the viral cDNA is used as a template to amplify an 845 bp N gene fragment in first-round PCR using outer primers, followed by second-round nested PCR to amplify the final 371 bp fragment using inner primers. This method can detect different genetic clades of rabies viruses (RABV). The validation, using 9,624 brain specimens from eight domestic animal species in 10 years of clinical rabies diagnoses and surveillance in China, showed that the method has 100% sensitivity and 99.97% specificity in comparison with the direct fluorescent antibody test (FAT), the gold standard method recommended by the World Health Organization (WHO) and the World Organization for Animal Health (OIE). In addition, the method could also specifically amplify the targeted N gene fragment of 15 other approved and two novel lyssavirus species in the 10th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) as evaluated by a mimic detection of synthesized N gene plasmids of all lyssaviruses. The method provides a convenient alternative to FAT for rabies diagnosis and has been approved as a National Standard (GB/T36789-2018) of China.

A pan-lyssavirus nested reverse transcription polymerase chain reaction has been developed to detect specifically all known lyssaviruses. Validation using rabies brain samples of different animal species showed that this method has a sensitivity and specificity equivalent to the gold standard fluorescent antibody test and could be used for routine rabies diagnosis.

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently reclassified into Borreliella, the relapsing fever (RF) group Borrelia, and a third reptile-associated group of spirochetes. Culture-based methods remain the gold standard for the laboratory detection of bacterial infections for both research and clinical work, as the culture of pathogens from bodily fluids or tissues directly detects replicating pathogens and provides source material for research. Borrelia and&#160;Borreliella spirochetes&#160;are fastidious and slow growing, and thus are not commonly cultured for clinical purposes; however, culture is necessary for research. This protocol demonstrates the methodology and recipes required to successfully culture LB and RF spirochetes, including all recognized species from B. burgdorferi s.l. complex including&#160;B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto&#160;(s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, and B. miyamotoi. The basic medium for growing LB and RF spirochetes is the Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II or BSK-H) medium, which reliably supports the growth of spirochetes in established cultures. To be able to grow newly isolated Borrelia isolates from tick- or host-derived samples where the initial spirochete number is low in the inoculum, modified Kelly-Pettenkofer (MKP) medium is preferred. This medium also supports the growth of B. miyamotoi. The success of the cultivation of RF spirochetes also depends critically on the quality of ingredients.

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

In vitro culture is a direct detection method for the presence of living bacteria. This protocol describes methods for the culture of diverse Borrelia spirochetes,&#160;including those of the Borrelia burgdorferi sensu lato complex, relapsing fever Borrelia species, and Borrelia miyamotoi. These species are fastidious and slow growing but can be cultured.

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Kompleksi ve Tekrarlayan Ateş Borrelia'dan Spiroketlerin Yetiştirme Yöntemleri

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Serumda Borrelia-Spesifik IgG ve IgM için Multipleks İmmünoassay

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

Yazar Spotlight: Lyme Borreliosis Teşhisi ve Patojen Araştırmaları için Multipleks İmmünoanalizlerin Kapsamının Genişletilmesi 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Kompleksi ve Tekrarlayan Ateş Borrelia'dan Spiroketlerin Yetiştirme Yöntemleri

Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama