Name: live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Christine Holt ve Bill Harris'e konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Floresan zamanlayıcı omurga yapıları için Darren Gilmour'a ve Tol2-Lyz omurga vektörü için Anna Huttenlocher'e teşekkür ederiz. Steve Renshaw'a Tg(mpx:GFP)i114 serisi için teşekkür ederiz. Bu çalışma MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] ve bir Isaac Newton Trust hibesi 19.23(n). C.C., MRC DTP öğrenciliği ve kısmen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] tarafından desteklendi; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe. H.W. MRC DTP Studentship tarafından desteklendi. H.P., Wellcome Trust doktora hibesi (105391 / Z / 14 / Z) ve kısmen bir Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z] tarafından desteklenmiştir; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] hibe ve MRC (MR/L019523/1).

<ol>
	<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li><li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration.">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases.">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li><li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells.">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).</li><li>Arnon, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK2-dependent+S1PR1+desensitization+is+required+for+lymphocytes+to+overcome+their+attraction+to+blood.">GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood.</a> Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li><li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4.">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don&#224;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient.">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li><li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+dynamics+of+an+endogenous,+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue.">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li><li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+receptor+internalization,+signaling+level,+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration.">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, 5702-5710 (2012).</li><li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase.">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).</li><li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish.">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics.">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2004).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li><li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Textural+features+for+image+Classification.">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li><li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+infection:+From+pathogenesis+to+cell+biology.">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).</li><li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals.">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li><li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Zebrafish+and+CRISPR/Cas9:+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline.">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy.">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler

Tarif edilen yöntem, doku hasarına inflamatuar yanıt sırasında endojen ligandlara in situ yanıt olarak reseptör dinamiklerinin canlı görüntülenmesini sağlar. Cxcr1 / Cxcr2 nötrofil muhabirlerinin kullanımı, enfeksiyon, tümör modelleri veya diğer doku hasarı türleri gibi diğer fizyolojik ortamlara genişletilebilir 14,25,26,27. Ek olarak, endojen reseptörün eksojen bir mutant reseptör tarafından bastırıldığı ve kurtarıldığı transgenik kurtarma hatları, immün yanıtlarda spesifik nötrofil migrasyon paternlerinin önemini incelemek için yararlı araçlar sağlayabilir. Örneğin, duyarsızlaştırmayı bozan Cxcr1 reseptör mutantları, enflamatuar bölgelerde daha belirgin nötrofil kümelenmesine neden olur14. Bu fonksiyon kazancı fenotipi, nötrofil cemaatinin farklı fizyolojik süreçlerdeki rolünü anlamak için kullanılabilir, örneğin, yara onarımı, bulaşıcı hastalık veya tümör evrimi ve kompleman reseptör nakavt / nakavt deneyleri. Metodoloji ayrıca mevcut muhabirlerin aralığını genişletmek için bir temel sağlar. Floresan muhabir seçimi dikkate alınması önemlidir ve biyolojik soruya bağlıdır. Nötrofillerdeki bu kemokin reseptörlerinin kurucu döngüsünün, epitel hücrelerine kıyasla yüksek olduğunu ve hızlı olgunlaşması olan muhabirlerin (örneğin, sfGFP) membran seviyelerini kararlı durumda bildirmeleri ve nötrofil stimülasyonuüzerindeki farklılıkları çözmeleri gerektiğini bulduk8,14. Bu nedenle, sfGFP / tagRFP'nin membran oranları, bu hücre tipinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi ölçmek için geçerli değildir, ancak tagRFP paterni, bazı çalışmalarda yararlı olabilecek reseptörün hücre içi kaderlerinin izlenmesine izin verir. Ayrıca, tagRFP'nin daha konsantre hücre içi sinyalinin bireysel larvaları taramak için yararlı olduğunu bulduk. Plazma zarındaki reseptör seviyelerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, nötrofillerdeki bir floresan membran belirtecini aynı transgen9'da veya bağımsız bir transgen14'te birlikte eksprese etmek olacaktır. Önceki senaryoda, transgen balığın taranması için ek bir araç sağlayacak ve ekspresyon seviyeleri belirteç ve reseptör arasında karşılaştırılabilir olacaktır. İkinci yaklaşım daha modüler olacaktır, çünkü bir reseptör muhabiri olan bir zebra balığı çizgisi farklı muhabir hatlarıyla birleştirilebilir. Her iki durumda da, kümelenmiş nötrofillerde reseptör seviyelerinin membran nicelleştirilmesinin zor olduğunu belirtmek gerekir (aşağıya bakınız). Son olarak, bu protokolün olası bir uzantısının, daha ayrıntılı lokalizasyon analizleri için canlı görüntülemeyi immünohistokimya ile takip etmek olacağını not ediyoruz.
Tol2 transgenez sistemi iyi kurulmuş7'dir ve lizozim C promotörü nötrofil ekspresyonu11,15 için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, transgenez yaklaşımı nispeten basittir ve bu promotör ile elde edilen ekspresyon seviyesi, reseptör dinamiklerinin analizi için yeterli kontrast sağlayacak kadar yüksektir. Olası bir sınırlama, ekspresyon seviyesinin endojen reseptör ekspresyon seviyelerini özetlememesidir. Yeni CRISPR teknolojileri, özellikle ilgi çekici reseptörler için zincirleme hatlar oluşturmak üzere konuşlandırılabilir28. Bu teknolojiler hala hantaldır ve hücre altı görüntüleme için gerekli ekspresyon seviyelerini garanti etmeyebilir, ancak başarılı gelişimleri endojen sinyal dinamiklerini anlamak için önemli bir atılım olacaktır. Fonksiyonel doğrulamalar, transgenik reseptör yapıları ile verilerin yorumlanması için önemlidir. Örneğin, floresan füzyon proteininin işlevsel olduğunu belirlemek için ligand tanıma testleri kullanılabilir ve transgenik nötrofil ekspresyon seviyelerinin işlevsellik14 ile uyumlu olduğunu belirlemek için nakavt fenotiplerinin kurtarılması kullanılabilir. Son olarak, reseptör füzyonunu doğrulamanın daha doğrudan bir yolu, etiketlenmemiş versiyonlar14'ün yanı sıra etiketli reseptörlü in vitro fonksiyonel bir tahlil kullanmak olacaktır.
Niceleme yaklaşımı, nötrofillerde in vivo olarak doğru membran segmentasyonundaki spesifik zorlukları ele almaktadır. Epitel niteliğindeki hücrelerde, membran reseptör seviyelerinin normalleştirilmesi, membran reseptör seviyelerinin bir kontrol belirtecine normalleştirilmesiyle otomatik olarak gerçekleştirilebilir, bu da tandem veya ayrı ayrı ifade edilebilir9. Gerçekten de, gastrulating embriyolarında ligand tanıma testini kullanırken böyle bir yaklaşım uyguladık14. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo hücre şeklinde karmaşık, hızlı değişikliklere uğrar ve membran segmentasyonunu hem 2D hem de 3D14'te zorlaştırır. Bu, birçok fizyolojik ortamda meydana gelen nötrofiller kümelendiğinde daha da zordur29. Kontrast metrik, membran segmentasyonu gerektirmediği, bunun yerine hücredeki reseptör dağılımının genel durumunu yansıttığı için bu sınırlamanın üstesinden gelir (membranöz / pürüzsüz vs veziküler / noktalı). Kontrast metriğinin görüntünün genel kontrastından etkilenebileceğine dikkat etmek önemlidir, bu nedenle farklı embriyolarda / örneklerde sinyalin değişkenliğini hesaba katmak için bireysel hücre değerlerinin dahili bir referansa normalleştirilmesi gerekir. Örneğin, CHT'deki yanıt vermeyen nötrofillerin ortalama hücre kontrast değerini kullandık (yani, sabit kalan ve ventral yüzgecine göç etmeyen nötrofiller)14. Ek bir olasılık, aynı hücredeki bir kontrol işaretçisinin kontrast değerleriyle normalleştirmek olacaktır. Bu, yanıt vermeyen hücrelerin dahili bir referansı mevcut olmadığında bir çözüm sağlayacaktır ve muhtemelen farklı koşullar arasındaki reseptör dinamiklerindeki daha ince nicel farklılıkları çözebilir.
Görüntülemenin yeri dikkate alınması gereken başka bir değişkendir. Burada ventral yüzgeç yarasının seçilmesinin nedeni, daha yaygın olarak kullanılan kuyruk yüzgeci yara modeli16,30'un aksine, yaralama yerinin nötrofil ikametgahı / göçmen kökenli bölgeye yakın olmasıdır. Bu, nötrofillerin gelmesi nispeten az zaman aldığı için tahlilin zaman çizelgesini hızlandırır. Ek olarak, hem göç kaynağında (CHT) hem de ilgilenilen hedef konumda (yara) hücre davranışını yakalama fırsatı sağlar. Bu burada önemlidir, çünkü hücre altı görüntüleme için gereken uzamsal ve zamansal çözünürlüğün geniş bir görüş alanı veya çok konumlu tarama ile birleştirilmesi zordur. Bu nedenle, ventral yüzgeç yara testi, göç orijininden göç yanıtının evriminin izlenmesine ve yanıt vermeyen hücrelerdeki spesifik olmayan reseptör dalgalanmalarının eşzamanlı olarak yakalanmasına izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi, ikincisi, spesifik olmayan dinamikler için dahili bir referans sağladığı için niceleme amaçları için yararlıdır. Diğer sistemlerde, böyle bir iç referansa sahip olmak mümkün olmayabilir, bu durumda birlikte ifade edilen bir membran işaretleyicisinin kontrast değerleri alternatif bir kontrol sağlayacaktır.
Özetle, metodolojinin diğer sistemlere uygulanabilir olduğunu ve çeşitli amaçlar için konuşlandırılabileceğini öngörüyoruz. Örneğin, aynı muhabirler enfeksiyon ayarları veya diğer hastalık modelleri gibi diğer enflamatuar ortamlarda kullanılabilir. Zebra balığı reseptör raporlayıcı hatlarının repertuarı, sinyal mekanizmalarını anlamak veya ligand dinamiklerini in vivo olarak bildirmek için diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir. Yaklaşım, gözlemlenen dinamiklerin mekanik temelini sorgulamak için nakavt / nakavt teknikleriyle birleştirilebilir. Örneğin, ligand ekspresyonunun pertürbasyonu, gözlemlenen reseptör dinamikleri için ligand bağımlılığını gösterebilir. Gelecekte, sistemin muhabirlerin zincirleme olarak yerleştirilmesini içerecek şekilde daha da rafine edilebileceğini öngörüyoruz. Nihayetinde, bu metodolojiyi kullanan bulgular, memelilerde bu sinyal reseptörlerinin korunması ve bu çalışmaların daha büyük organizmalarda yürütülmesinin göreceli zorluğu göz önüne alındığında, zebra balığı topluluğunun ötesinde değerli yeni bilgiler sağlayacaktır.

Lökosit göçü immün yanıtlar için büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık hücreleri, dokuları ve kan damarlarını geçebilen ve mikroplara veya diğer önemli konakçı hücrelere doğru yönlü olarak göç etmek için bir dizi kimyasal rehberlik ipucunu algılayabilen prototipik göçmen hücrelerdir. Doğru rehberlik, kemokinlerin en belirgin kategori1'i temsil ettiği kemoattractantların tanınmasına dayanır. Kemokinler, oldukça spesifik yedi transmembran G protein eşleşmiş reseptörleri tarafından tanınır. Kemokin bağlanması üzerine, kemokin reseptörleri, ilişkili trimerik G proteinlerinin aktivasyonuna ve bunların sitoiskelet değişikliklerini ve yönlendirilmiş migrasyonunu destekleyen fonksiyonel sinyal alt birimlerine ayrışmasına yol açan konformasyonu değiştirir1. İkincil olarak, kemokin reseptörleri fosforile edilir ve bu modifikasyon, cezbedici için duyarsızlaştırmaya yol açar, bunu hızlı yeniden duyarlılaştırma / geri dönüşüm veya hücre içi bozunma ve hücre yüzeyinden aşağı regülasyonizleyebilir 2. Bu reseptör dinamikleri, hücreler tarafından alınan sinyallemenin süresini ve dozunu etkiler, ancak lökosit migrasyon davranışını nasıl etkilediklerini in vivo olarak aydınlatmak zor olmuştur.
Geleneksel memeli sistemlerinde canlı lökositlerdeki reseptör dinamiklerinin izlenmesi çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Canlı çalışmalar için, floresan proteinlerle reseptör füzyonları hücrelerde eksprese edilmelidir. Bu, birincil lökositlerde, özellikle nötrofillerde zordur ve şimdiye kadar yapılan çalışmalar, kemokin reseptörlerini 3,4 eksprese etmek için vekil nötrofil hücre hatlarını kullanmıştır. Lökositlerin bilgilendirici kaçakçılık kusurları5,6 olan bir floresan reseptörü veya mutant reseptörleri eksprese ettiği transgenik fare modellerinin oluşturulması, önemli miktarda zaman ve kaynak yatırımı gerektirir. Bu durumlarda bile, canlı hayvanda görüntüleme reseptör dinamikleri için görüntüleme çözünürlüğü ve kontrastı sınırlı olabilir ve çalışmalar sabit doku kesitleri5'te immünohistokimyayı kullanmıştır. Bu teknik zorluklar göz önüne alındığında, kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı bir doku ortamında hücre davranışını nasıl etkilediğine dair anlayışımız şu anda sınırlıdır.
Burada, zebra balığı nötrofillerinde reseptör kaçakçılığını izlemek için bir metodoloji sunuyoruz. Zebra balığı, fareler gibi genetik olarak izlenebilir, ancak transgenez, verimli transpozon sistemleri ve doğrudan zigot manipülasyonu7 kullanılarak nispeten daha basittir. Şeffaf larva ideal olarak görüntülemeye uygundur. Kemokin reseptör dinamikleri, primordiyan germ hücrelerinde ve lateral line primordiumda, floresan muhabirler 8,9,10 ile karşılık gelen füzyonların ekspresyonu ile görselleştirilmiştir. Zebra balığı larvaları, memeli nötrofillerine göre oldukça korunmuş genetik ve hücresel özelliklere sahip olgun nötrofiller ile donatılmıştır. Sitoiskelet dinamiği ve polarite düzenleyicileri gibi hücre altı sinyal dinamikleri, bu hücrelerde karşılık gelen transgenik çizgilerin üretilmesiyle görselleştirilmiştir11,12,13. Son zamanlarda, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerdeki kemokin reseptör dinamiklerini görselleştirdik ve fonksiyonel olarak analiz ettik14. Burada, nötrofillerde kemokin sinyalizasyonu için transgenik muhabir hatlarının üretimini, canlı görüntüleme için embriyoların hazırlanmasını, nötrofil sinyallemesini incelemek için bir yara tahlili ve görüntülerin elde edilmesi ve analizi için protokolü açıklıyoruz. Ayrıca, aday ligandlara kemokin reseptör yanıtlarını test etmek için bir yan protokol sağlıyoruz, bu da karakterize edilmemiş reseptörlerde ligand tanıma paternleri oluşturmaya çalışırken yararlıdır. Bu teknikler, endojen kemokin ekspresyonunun inhibisyonu veya değiştirilmiş ligand kaynaklı kaçakçılık ile mutant reseptörlerin üretilmesi gibi daha ileri genetik manipülasyonlarla kombinasyon halinde, spesifik sinyal dinamiklerinin lökosit davranışını in vivo olarak nasıl etkilediğini sorgulamak için kullanılabilir. Floresan etiketli kemokin reseptörlerini ifade eden transgenik çizgiler, doğrudan antikor boyama ile tespit edilmesi zor olan endojen kemokin gradyanları için muhabir olarak da kullanılabilir. Açıklanan metodoloji, muhabirlerin üretimini diğer immüno-sinyal reseptörlerine genişletmek için kapsam sağlar.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capillary glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small paintbrush</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

Kimyasal gradyanlar tarafından lökosit rehberliği, immün yanıtlar için gereklidir. Nötrofiller, önemli antimikrobiyal işlevleri yerine getirdikleri doku hasarı bölgelerine alınan ilk hücrelerdir. Bu lokuslara yapılan kaçakçılık, kemokinler de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuar kemoattractantlar tarafından düzenlenmektedir. Moleküler düzeyde, kemoattractant sinyalleme, karşılık gelen reseptörlerin hücre içi trafiği ile düzenlenir. Bununla birlikte, kemokin reseptörlerindeki hücre altı değişikliklerin hücre ve doku düzeyinde lökosit migrasyon dinamiklerini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Burada, doku hasarına inflamatuar yanıtlar sırasında nötrofillerde kemokin reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu araçlar, zebra balığı nötrofillerinde diferansiyel kemokin reseptörü kaçakçılığının, doku hasarı bölgelerinde nötrofil kümelenmesini ve dağılmasını koordine ettiğini ortaya koymuştur. Bunun, enflamatuar yanıtların kendi kendine nasıl çözüldüğünü anlamamız için etkileri vardır. Tarif edilen araçlar, çeşitli fizyolojik ve patolojik ortamlarda nötrofil göç paternlerini anlamak için kullanılabilir ve metodoloji diğer sinyal reseptörlerine genişletilebilir.

Ventral yüzgeç yaralanmasını KHT'den ventral yüzgece hızlı nötrofil mobilizasyonu ve 30-60 dakika içinde yara kenarında kümelenme izler (Şekil 1). Zebra balığı nötrofilleri 24 tarafından eksprese edilen ve eğirme diski konfokal mikroskopisi kullanarak Cxcl8a ve Cxcl8b14'ü tanıyan iki kemokin reseptörünün, Cxcr1 ve Cxcr2'nin dağılımını görselleştirdik. Nötrofillerin reseptörün floresan zamanlayıcı (FT) yapısını ifade ettiği, yani sfGFP ve tagRFP tandemiyle bir füzyon olan Tg (lyz: Cxcr1-FT) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) olmak üzere iki karşılık gelen transgenik çizgi ürettik (Şekil 2 ve referans14). İki floroforun kullanımı, çok çeşitli reseptör kaderlerinin izlenmesine izin vermek ve plazma zarında protein devir süresi tahminleri sağlamak için tasarlandı, çünkü yeni sentezlenen reseptörler yeşil renkte floresan olacak ve 8,14 yaşlarında giderek kırmızı hale gelecektir. Bununla birlikte, bu reseptörlerin nötrofil plazma membranında hızlı kurucu ciroya sahip olduğu ve ikamet süresinin tagRFP'nin olgunlaşma süresinden daha kısa olduğu, sfGFP'nin membran lokalizasyonunu gösterdiği ve tagRFP'nin kararlı durumda veziküler lokalizasyonu gösterdiği bulunmuştur (Ek Video 1 ve ref14). Bu nedenle, doku hasarı bölgelerinde ligand kaynaklı içselleştirmeyi izlemek için sfGFP'nin dağılımına odaklandık. Reseptör dağılımının paterni, komşu pikseller arasındaki yoğunluk farklılıklarını bildiren kontrast metriği kullanılarak ölçüldü. Gerekçe, reseptör dağılımı membranöz ve pürüzsüz olduğunda, kontrast değerinin düşük olmasıdır. Reseptör dağılımı veziküler ve daha fazla noktasal olduğunda, kontrast değeri yüksektir (Şekil 3).
Alternatif bir yöntem, reseptör seviyelerinin (sfGFP yoğunluğu) bir kontrol membranı belirtecinin seviyelerine oranını ölçmektir, örneğin membran CFP (mCFP) (Şekil 3). Her iki yöntem de, hücrede küresel olarak daha fazla veziküler reseptör dağılım paterni (daha yüksek kontrast değeri) veya membrandaki daha düşük reseptör seviyeleri (daha düşük sfGFP / mCFP oranı) ile belirtildiği gibi reseptör içselleştirmesini tespit edebilir. Bununla birlikte, kontrast metriği, membran segmentasyonunun daha az doğru olduğu ve uygulanamadığı yaradaki nötrofil kümelerinde reseptör içselleştirmesini de tespit edebilir (Şekil 3). Bu metriği kullanarak, yaralardaki nötrofillerde Cxcr1 ve Cxcr2 kaçakçılığı arasındaki gözle görülür farklılıkları ölçebildik (Şekil 4 ve Ek Video 2). Cxcr1-FT yarada bulunan hücrelerde içselleştirilirken, Cxcr2-FT yaradaki nötrofillerde membranöz kalmıştır (Şekil 4A-C, Ek Video 2 ve Ek Video 3). Morfolino tedavisi ile Cxcl8a ve Cxcl8b'nin baskılanması, yaralarda Cxcr1-FT içselleştirmesini farklı şekilde etkilemiştir (Şekil 4C,D). Cxcr1-FT'nin Cxcl8a'ya yanıt verdiğini daha da doğrulamak için, erken embriyolarda kemokin yanıt testleri yaptık. Cxcr1-FT'nin, Cxcl8a'nın birlikte eksprese edildiği embriyolarda belirgin bir şekilde içselleştirildiğini bulduk(Şekil 5). Tüm bu sonuçlar, nötrofillerde kemokin kaynaklı reseptör içselleştirmesini ölçmek ve bu etkilere aracılık eden ligandın kimliğini belirlemek için tarif edilen yöntemlerin uygulanabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Şekil 1: Ventral yüzgeç yaralarına nötrofil göçü. (A) (Solda) Kaudal hematopoetik dokunun (CHT), venüs dolaşımının (VC, mavi), ventral yüzgecin (VF) ve yara yerinin yerini gösteren 3 dpf larva karikatürü. (Sağda) Nötrofillerin CHT'den harekete geçirilmesi ve yarada kümelenmesiyle yaranın (W) alanını gösteren karikatür. CHT dokusunun kaudal ven pleksusu (CVP) mavi renkte çizilir. (B) Ventral yüzgeç yarasını ve Tg (mpx: GFP) larvalarındaki nötrofillerin dağılımını gösteren parlak alan görüntüsü (solda) ve konfokal projeksiyon (sağda) yaralama sonrası 2 saatte. Kesikli çizgiler VF ve CHT anahatlarını gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiş karikatür ve floresan görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Şekil 2: Nötrofillerde kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi. (A) Cxcr1-FT (Floresan Zamanlayıcı) ve Cxcr2-FT'nin nötrofil-spesifik transgenik ekspresyonu için kullanılan yapılar 3 dpf transgenik larva (Tg(lyz:Cxcr1-FT), üstteki nötrofillerin konfokal projeksiyonları; Tg (lyz:Cxcr2-FT), alt) tRFP (macenta) ve sfGFP (yeşil) kanallarını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Şekil 1A'daki gibi 3 dpf larvanın anatomik şeması. Larvaların altında, yaranın (W) alanını gösteren şemalar, nötrofillerin CHT'den (üstte) mobilize edilmesi veya ventral yüzgece (alt) girdikten sonra kemotaksis yapılması ile tasvir edilir. Kesikli kare, sağdaki anlık görüntülerde görüntülenen alanı gösterir. (C) Tg(lyz:Cxcr1-FT) larvalarındaki nötrofiller (sfGFP gösterilmiştir) CHT'den (üst paneller) veya kemotaksisten yaraya (alt paneller) doğru mobilizasyon üzerine. Oklar zaman içinde aynı hücreleri gösterir. Sağdaki görüntüdeki zaman noktaları, soldaki görüntüden sonra geçen dakikalardır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Kemokin reseptörü kaçakçılığının canlı görüntülenmesi için deneysel yaklaşımın şematik gösterimi. Paneller A-C ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Şekil 3: Reseptör dinamiklerinin nicelleştirme örnekleri. Yaralardaki tek (mavi) veya kümelenmiş nötrofiller (yeşil) veya CHT'deki (kırmızı, turuncu) mobilize edilmemiş nötrofiller, sonuçları karşılaştırmak için farklı yöntemlerle bölümlere ayrıldı ve analiz edildi. Gösterilen aynı örnek hücreler, görüntüde görülenleri çıkarılan değer aralığıyla ilişkilendirmek için iki yöntemle analiz edilmiştir. (A) Seçilen, örnek hücrelerin yüzeyi, sfGFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. (B) Kontrast, A'da gösterilen örnek hücrelerden hesaplandı. (C) Seçilen, örnek hücrelerin zarı, CFP kanalındaki kontur tanımına göre bölümlere ayrılmıştır. Bunu sfGFP/CFP'nin oranmetrik analizi izledi. (D) SfGFP / CFP oranı, C'de gösterilen örnek hücreler üzerinde hesaplanmıştır. hata çubukları, tek tek hücrelerden S.E.M.'yi temsil eder, n>1 durumunda, buradaki değerler istatistiksel analiz için değil, yalnızca farklı niceleme yöntemleriyle elde edilen ölçümleri örneklemek için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Şekil 4: Yaralanmaya yanıt olarak Cxcr1 ve Cxcr2'nin diferansiyel dinamikleri. (A) Tg(lyz:Cxcr1-FT) veya Tg(lyz:Cxcr2-FT) larvalarındaki nötrofillerin yara sonrası 80 dakikada konfokal projeksiyonu (sfGFP kanalı gösterilmiştir). Ölçek çubuğu = 10 μm.  (B) Yarada büyütülmüş Cxcr1-FT nötrofil (solda) ve Cxcr2-FT (sağda). Yeşil reseptör gri renkte gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) Normalleştirilmiş kontrast (CHT'deki mobilize edilmemiş hücrelerin ortalama kontrastına normalleştirilmiş bireysel nötrofil başına kontrast). cxcl8a, cxcl8a için çeviri bloke edici bir morfolino ile birlikte bir ekleme blokajının enjeksiyonunu ifade eder. cxcl8b, cxcl8b için ekleme bloke edici bir morfolino ile enjeksiyonu ifade eder. Tg (lyz: Cxcr1-FT için: n = 24 hücre (CHT), n = 8 larvadan 47 hücre (yara). Morfolinolu Tg (lyz: Cxcr1-FT) için: 5 larvadan n = 28 hücre (Cxcl8a-MO), 5 larvadan n = 16 hücre (Cxcl8b-MO). Tg (lyz: Cxcr2-FT için): n = 10 hücre (CHT) ve n = 20 hücre (yara) 3 larvadan. Veriler 1-5 görüntüleme seansında elde edilen bağımsız larvalardan toplandı. Kruskal-Wallis, Dunn'ın Tg (lyz: Cxcr1-FT) için çoklu karşılaştırma testi, Tg (lyz: Cxcr2-FT) için iki kuyruklu eşleşmemiş Mann-Whitney testi ile test edildi. (D) Cxcl8a morfolinosu (MO) (solda) ve cxcl8b MO (sağda) ile tedavi edilen Tg (lyz: Cxcr1-FT) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına (yeşil renkte gösterilen sfGFP kanalı) yanıt veren nötrofillerin konfokal projeksiyonu. Eşdeğer nötrofil birikiminin zaman noktalarında çekilen anlık görüntü (sol görüntüde 85 dakika yaralama sonrası ve sağ görüntüde 45 dakika yaralama sonrası). Ölçek çubuğu = 10 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Şekil 5: Erken embriyolarda kemokin yanıt testi. Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA'nın ekspresyonunu ve dağılımını gösteren gastrulating embriyolarının lazer taramalı konfokal dilimleri, 150 pg Cxcl8a mRNA'lı veya Cxcl8a mRNA'sız bir hücre aşaması yumurtasına enjekte edildi. Yeşil ve kırmızı reseptörler ayrı kanallarda gösterilir. Kontrol membranı CFP işaretleyicisi (mCFP) camgöbeği kanalında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Şekil ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Film 1: 3 dpf'de bir Tg (lyz: Cxcr1-FT) (solda) ve Tg (lyz: Cxcr2-FT) (sağda) larvalarının kafasındaki transgenik nötrofiller. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 5 fps'dir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Film 2: Tg(lyz:Cxcr1-FT) (solda) ve Tg(lyz:Cxcr2-FT) (sağda) transgenik larvalarında yüzgeç yaralarına yanıt veren nötrofiller. Film yaralama sonrası 10 dakika içinde başlar ve 60 dakika sürer. sfGFP (yeşil), tagRFP (macenta). Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 10 fps'dir. CHT = kaudal hematopoetik doku. VF = ventral yüzgeç. Ölçek çubuğu = 25 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Film 3. Yaralı bir Tg (lyz: Cxcr1- FT) transgenik larvadan (Video 2'de gösterilenden farklı larva) nötrofillerin ek örnekleri, daha yüksek çözünürlükte elde edilir, CHT'de mobilizasyon üzerine veya girişte reseptör içselleşmesini (yeşil renkle gösterilen sfGFP kanalı) gösterir ve ventral yüzgeçte kemotaksis. Kare aralığı 30 sn'dir ve kare hızı 2 fps'dir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Video, ref.14'ten (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) alınmıştır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 1: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses at JoVE.com

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Yara Yanıtları Sırasında Zebra Balığı Nötrofillerdeki Kemokin Reseptörlerinin Canlı Görüntülenmesi

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

live-imaging-chemokine-receptors-zebrafish-neutrophils-during-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K Görüntüleme.  University of Cambridge. Burada, zebra balığı nötrofillerde kemoattractant reseptör dinamiklerinin canlı görüntüleme ve kantitatif analizini gerçekleştirmek için protokolleri açıklıyoruz.

Video: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Gelişim Biyolojisi

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

Larva Zebra Balıklarında Hedef Sinyalizasyon Yanıtlarının İzlenmesi - Z-REX Elektrofilik İlaçların ve Metabolitlerin Hassas Mekanizmalarının Maskesini Çıkarır

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Biyoloji

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Bakteriyel Enfekte Transgenik Zebra Balıklarında Fotokonversiyon Tabanlı Lökosit Takibi

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...