Yazarlar kendi meslektaşlarına ve bu tekniğin gelişmesini destekleyen şimdiki ve geçmiş laboratuvarların personeline müteşekkiriz. SP&#39;den laboratuvar için Kanada Enstitüsü tarafından desteklenen Sağlık Araştırma İşletim Hibe MOP-84473 ve (Medical Research Endowment Fund için Alberta Heritage Vakfı tarafından finanse edilen) Alberta yeniliklerin-Sağlık Çözümleri. DP en MD001091-01 ve GM068855-02 hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1.. Bakteriyel Kültürler, Araçlar ve Reaktifler hazırlanması (GÜN 1, Afternoon) <ol><li> Öğleden sonra, 1-5 ml steril LB et suyu otoklava bakteri (E. coli ya da V. cholerae) küçük bir kısım ile (örneğin, 100 x 13 mm) borosilikat cam test tüpleri inoküle. </li><li> , 37 ° C sıcaklıkta (sıcak oda ya da inkübatör) bürosunun bir silindir tambur içinde aşılanmış deney tüpleri Set yüksek hızda silindir tambur açmak, ve O / N kuluçkaya </li><li> Cam yumuşatır kadar bir Bunsen brülörün alev çubuğun orta ısıtılması ile bir cam çubuk bir &quot;hokey sopası&quot; şeklinde bir hücre yayıcı hazırlamak ve daha sonra bir 135 ° &#39;lik açı içine cımbız veya pense ile hafifçe viraj doğrudan . Bir kez daha ucu ile birinci kavisin arasında orta noktasında ısıtılır ve çubuk (birinci dirseğinin ters yönde) bir içeriye doğru 45 ° &#39;lik açıyla eğmek. </li><li> Antibiyotikler olmadan LB-agar hazırlayın ve hazırlanmasında Petri kutularına dökün4 ° C &#39;de, uygun (elektropore edilecek olan vektör üzerindeki direnç belirteci göre) antibiyotik ve mağaza içeren electrocompetence protokolü ve LB-agar plakaları </li><li> 2 mM CaCl V boyunca 2 çözeltisi steril bir filtre hazırlanması E için cholerae, veya otoklav GKD 2 O 4 ° C&#39;de coli ve depolamak </li></ol> 2. Elektrokompetan Bakterilerin Büyüme (2. GÜN, Sabah) <ol><li> Her bir LB agar plakası üzerine O / N bakteri kültürü 100 ul sunun, donmuş gliserol stokları da kullanılan ve doğrudan plaka üzerine teslim edilebilir. </li><li> % 100 EtOH hokey sopası biçimindeki hücre serpme batırın, kısaca drenaj ve kullanmadan önce ve yaymak sterilize etmek kalan EtOH&#39;nin yakmak. Steril cam hücre yayıcı (mola) agar yüzeyi bozmaya emin yapma ile eşit 100 ul O / N bakteri kültürü yayıldı. </li><li> Bakteri büyüme ince çim olmak kadar 4-6 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin veyaayırt geliyor. Aktif büyüyen zaman Hücreler en yetkin. </li></ol> 3. Elektrokompetan Bakteriyel Hücrelerinin Hazırlanması (2. GÜN, Öğleden Sonra) <ol><li> Agar yüzeyini delmek ya da kırmak için emin değil yapım steril bir aşılama döngü ile bakterileri hasat. Bir 2 mm çaplı bakteri kitle, tek bir dönüşüm için yeterli olacaktır. Genellikle, bu aşılama döngü iki veya üç kez olan ince çim yüzeyi kazıma gerektirir. (Tipik olarak 4-6 arasında) çeşitli örnekleri, aynı plakadan toplanabilir. </li><li> 1 ml buz soğukluğunda 2 mM CaCl2 (V. cholerae için) ya da steril GKD 2 O (E. coli) &#39;de bakteriyel kütle tekrar ve herhangi bir kümeleri görebilir kadar karıştırın, buz üzerinde tutun. </li><li> Santrifüj 4 ° C ya da 4 ° C&#39;ye ayarlanmış bir soğuk bir odada depolanır bir mikrosantrifüj içinde ayarlanmış bir soğuk mikrosantrfuj 5,000 xg&#39;de 5 dakika boyunca her bir bakteri süspansiyonu </li><li> Süpernatan, resusp atınbuz soğukluğunda 2 mM CaCl2 ya da steril GKD 2 O, aynı hacimdeki bakteri pelet sonunda ve üç kez olmak üzere toplam iki kez daha önce yapılan gibi santrifüj adımı tekrarlayın. </li><li> Süpernatant, tekrar süspansiyon kaldırmak ve daha sonra 40 ul buz soğuk iyice 2 mM CaCl 2 veya steril GKD 2 O bakteriyel pelet gevşetin ve buz üzerinde tutmak. </li></ol> 4. Elektrokompetan Bakterilerin Dönüşüm (2. GÜN, Öğleden Sonra) <ol><li> 40 ul bakteri süspansiyonuna plasmid DNA (1 kadar ul su veya Tris-EDTA tampon maddesi içinde) ve 1 ug kadar ekleyin ve önceden soğutulmuş, steril 0.2 cm boşluk küvet, bu karışımı aktarın. DNA örneğinde tuz konsantrasyonu, bir sonraki aşamada darbenin kavisine katkı gibi, bir düşük olması gerekir. </li><li> Darbe kontrol modülünün elektroporasyon odası ve küvet yerleştirin ve 1.8 kV, 25 | iF de elektroporasyona. Zaman sabiti ~ 5.0 msn olmalı ve hiçbir ark gerçekleşmelidir. </li><li> Hızla 1 ml LB suyu içine yeniden süspanse edilmesi suretiyle hücre süspansiyonu geri kazanmak ve daha önce otoklavlanmıştır borosilikat cam test tüpü içine aktarın. </li><li> Hücreler antibiyotik seçim olmadan, 30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de (bir silindir tambur içinde) havalandırılmış bir büyüme koşulları altında inkübe edilmesi ile geri izin verin. </li><li> Uygun seçici madde (antibiyotik) varlığında daha önce hazırlanmış LB agar plakaları üzerine bakteri Plate ve 37 ° CO / N. inkübe Bakteriler arıtıldı vektörü (0.1-1 ug süper sarılmış plazma) yüksek bir konsantrasyon ile değiştirilmesi halinde, LB agar levhasının kenarına ve kadran çizgi yöntemi kullanılarak izole edilmiş koloniler için steril bir aşılama döngü çizgi ile bakteri kültürü 10 ul sağlar. Ligasyon karışımı, bir dönüştürülmüş ise, her bir agar plakası üzerine bakteri kültürü 100 ul teslim ve eşit olarak steril cam hücre yayıcı ile yayıldı. </li></ol> bir zaman sabiti (olmak kısaysadüşük 3.5 msn) ya da darbe sonra, DNA örneği yeniden çökeltilmesi kurutmadan önce tuzları çıkarmak için iki kez% 70 EtOH ile yıkanır ve TE tamponu içinde yeniden süspanse, ark oluşumuna sebebiyet verir.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

Hiçbir açıklamalar geçerlidir.

Dönüştürme verimliliği bağımsız olarak yetkili hücrelerin hazırlanması için kullanılan yöntemin çeşitli faktörlere bağlıdır. Benzer değişkenler bu yöntem uygulanır; itina gerektiğini hücreler sabit soğuk sıcaklıkta (yüksek olmayan ° 4 den C) muhafaza edildiği şekilde agar plaka hasat kez. Bakteriyel çim aktif toplama zamanında büyüyen olmalıdır, hücre büyüme orta-logaritmik fazı içinde olması gerekir. DNA (örneğin tuzların kontaminasyon) Kalitesi transformasyon etkinliğini etkiler. Bu yöntem kullanıldığında özellikle, agar agar küvet içinde fragmanları, darbenin kıvılcım atlamasına neden olacak gibi kırık olmamalıdır. Bu teknik ile karşılaşılan sorunların çoğu iki konu ile ilişkili, onlar aktif büyüyen zaman agar plaka zaman uygun penceresi sırasında bakteri toplama. Çok yakında onları toplayarak yetersiz hücre sayıları verecektir ve verecekoluşturdukları &quot;Pellicule&quot; plaka yüzeyini kaldırarak zor olduğu için sinir bozucu bir LB agar plaka kazıma. Toplama bakteriler çok geç ölçüde kendi yetkinlik azalacaktır. Zaman penceresi doğal olarak LB agar plakaları üzerine kaplanmıştır inokulum yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir. İkinci kritik adım bunlar transformasyonu takip eden LB agar üzerine plakalanır dek agar plaka kaldırdı ve CaCI2 ya da GKD 2 O içinde tekrar süspanse edilir andan itibaren (4 ° C) soğuk bakterileri tutmaktır. Bakterileri, küvetler ve tampon içeren mikrofüj tüpleri önceden soğutulmuş olması ve bakteriler kaplama kadar her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Steril GKD 2 O veya CaCl2 çökelti içeren veya kontamine Ancak, ek sorunlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle biz bu reaktif taze hazırlamak öneririz. Sorun dönüşüm ba dönüştürürken kontrolleri de dahil olmak üzere tarafından kolaylaştırılırcteria herhangi bir yöntem ile kompetan hale. Seçici işaretleyici içeren bir LB agar plakası üzerine kaplanmıştır dönüştürülmemiş yetkili bir bakteri toplu oluşan bir negatif kontrol hızlı bir şekilde plaka üzerine antibiyotik etkili olup olmadığının belirlenmesine yardımcı olur. Deneysel örnek olarak aynı seçici markerini barındıran iyi kalite ve miktar bilinen bir plasmid preparasyonu ile bir pozitif kontrol, bir dönüşüm bakteriler yetkili değil, aynı zamanda dönüştürülmüş deneysel DNA miktar ya da kalitede yeterli olup olmadığını belirlemede yararlı olacaktır. Bu tekniğin avantajları çok yönlüdür, bu yöntem, bir dönüşüm için planlanan aynı gün içinde gerçekleştirilebilir. Biz (gece kültürden önce güne başlamak için unutmak sonra) &quot;acil&quot; durumlarda bu yapmış; Biz dondurulmuş bakteri gliserol stok electrocompetence herhangi bir kayıp olmadan LB agar doğrudan kaplama olabilir bulduk. Biz e sınamak olamazdı daçok fazla türe herhangi bir E., bilinen E. coli ya da V. elektroporasyon ile transforme edilebilir kolera suşu elinde bu protokole mükellef olmuştur. Bu teknik, hızlı etkili olan ve geleneksel yöntemler kullanılarak, elektrik bakteri hazırlanması elde edilen değerler ile karşılaştırılabilir verimler dönüşüm verimliliği. Yöntem, yüksek hızlı santrifüj ve ilgili rotor, bir orbital kuluçka çalkalayıcı ve steril bir santrifüj kova (konteyner) ve otoklavlanmış tampon büyük miktarlar için gereksinimi ortadan kaldırır. Belirli Reaktifler ve Ekipmanları Tablo oldukça kapsamlı olmasına rağmen, elektroporasyon yürütmek en laboratuvarları zaten mevcut bu malzemelerin, çoğu var, hepsi değilse de olacaktır. Belki de en önemlisi, bu teknik hali hazırda, hızla mutant geçmişleri olan, elektrik laboratuar özgü soyları üretmek için uygulanabilir. Bu elektrot hazırlanması geleneksel yöntem yerini aldı gibi bu tekniğin herhangi bir sınırlama habersizlaboratuarımızda bakteri trocompetent. Burada gösterilen deneylerin sonuçları, 1 haftadan daha uzun bir süre -80 ° C&#39;de saklanmış olan geleneksel yöntemle üretilen yeni elektro-güçlü hücreler ile yapıldı. Ancak, donmuş elektrokompetent hücre stokları depolama uzun süreler boyunca yetkinlik ve veya canlılığını kaybeder. Bizim kısaltılmış protokolü aynı gün azaldı transformant dönüşüm verimi ile sonuçlanabilir stokunun yaş ile ilgili endişeleri olmaksızın planlanan taze elektro-güçlü hücreler hazırlanmasına olanak sağlamaktadır. Biz bu gerekli olmamıştır gibi başka bir gün kullanmak için hızlı bir yöntem kullanılarak üretilen elektrokompenant hücreleri saklamak teşebbüs değil. Burada gösterilmemiş olsa da, elektro-hücre etkinliği eden hızlı bir yöntem ligasyon karışımları için yeterlidir kullanılarak hazırlandı. Non-O1 V için rapor dönüşümler Unterweger ve arkadaşları tarafından bir son makalesinde cholerae.17 (konjugasyon tarafından gerçekleştirilen olanlar hariç) burada tarif edilen yöntem yolu ile hazırlandı, elektrik bakteri kullanılarak gerçekleştirildi. Bu teknik, büyük hücre toplu hazırlamak zorunda kalmadan hızlı ve etkili bir şekilde arka plan ile mutant suşları dönüştürmek için araştırmacılar elde edilir. Elektro-bakteri yöntemin bu hızlı hazırlanması hazırlama prensip olarak elektroporasyon için uygun olduğu gösterilmiştir ve elektroporasyon ayar geleneksel protokoller ile aynı olacak şekilde uyarlanmıştır, diğer prokaryotlar olabilir.

1980&#39;lerin başında 1 yılında &#39;kuruluşundan bu yana, elektroporasyon ayrılmaz bir moleküler biyoloji tekniği, dairesel veya doğrusal nükleik asitler ile / transfect canlı hücreleri dönüştürmek için kullanılan muhtemelen tek ve en yaygın yöntem haline gelmiştir. Başlangıçta 1 ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için geliştirilmiş, elektroporasyon, daha sonra E. transformasyonu için uyarlanmıştır coli 2, 3. Bakteriyoloji olarak, elektroporasyon laboratuar standart haline gelmiştir ve Gram-negatif Pseudomonas 4, Salmonella 5, 6 Vibrios, Serratiae ve Shigellae 7 dahil olmak üzere, bakterilerin geniş bir yelpazede dönüştürmek için tadil edilmiş olan, Gram-pozitif Clostridia 8, Bacilli 9, 10 Lactobacilli Enterokok 11. Hatta bazı Archaebacteria Methanococci de dahil olmak üzere, elektroporasyon suretiyle transformasyona müsait olduğu kanıtlanmıştır </em&gt; 12 ve Sulfolobus türler 13. Kapsamlı bir inceleme için Aune ve Aachmann 14 bakınız. Elektroporasyon ile dönüşümün verimliliği kimyasal yeterlilik veya ısı şoku 2 söylendiğine göre 10-20 kat daha yüksektir. Ancak, çok 1980&#39;lerde 15 Douglas Hanahan tarafından optimize gibi kimyasal yetkinlik için bakterilerin hazırlık gibi, hücreler de elektrouyumlu için hazır olmalıdır. Elektroporasyon, elektrik bakteri, saflaştırılmış DNA, elektrik uyarısı veren bir puls kontrol modülü ve bir elektrot olarak işlev küçük tek küvetler barındıran bir bölmeyi gerektiren, bakteriyel bir dönüşüm, hızlı ve etkili bir araçtır. Kısaca, soğuk, yetkili bakteriler 30-45 dakika boyunca 30-37 ° C&#39;de inkübe büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, bir küvet içinde, bir yüksek voltaj darbesine maruz plazmid DNA, ile karıştırılır ve daha sonra yan katı ortam (besleyici agar üzerine plakalanır appr ile plakalar)seçici antibiyotik opriate. Darbe aşamada, elektrokompetent E. hazırlanmasında aksine coli geleneksel olarak büyük miktarlarda gerçekleştirilir çok parçalı bir işlemdir kalır. Kısaca, bakteri, bir gece boyunca kültür büyüme orta-logaritmik fazı (&lt;1.0 OD 600) için yetiştirilir ve bir steril olmayan ile seri yıkama işlemine tabi 1 L Luria Broth (LB) için, 100 ml bir Erlenmeyer şişesi içine aşılanır İyonik 4 ° C&#39;de hacimleri azaltılmasında tampon ya da çift damıtılmış su (GKD 2 O) Büyük bir özenle tüm prosedür boyunca soğuk hücreleri tutmak ve kirlenmeyi önlemek için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu otoklava santrifüj kova ve non-iyonik ya da tampon GKD 2 O kullanımını, bir orbital kuluçka çalkalayıcı, büyük hacimli, yüksek hızlı soğutmalı santrifüj ve rotor bir dizi gerektirir. Bakteriler son olarak% 10 gliserol ile takviye edilmiş tampon küçük bir hacmi içinde yeniden süspansiyona alınmış ve 40 ul hacimler ~, WH içerisine bölünürich kullanılana kadar -80 ° C&#39;de saklanır. Düşük sıcaklıkta saklama nedeniyle genellikle zaman içinde canlılığı kaybı düşmüştür dönüşüm verimi ile sonuçlanır. Elektro-bakteri hücreleri ticari kaynaklardan çeşitli ancak (genellikle rekombinasyon eksikliği) E: sınırlı sayıda mevcuttur ana plazmidler, geniş bir yelpazede yaymak için yaygın olarak kullanılan E. coli suşu. Sonuç olarak araştırmacılar, dönüşüm için kendi soylar / mutantlar hazırlamak için in-house yöntemlere bağlıdır. Elektrokompetan E. hazırlanması için bir alternatif, hızlı ve etkin bir protokol coli süredir birkaç moleküler bakteriyoloji laboratuarları tarafından kullanılmakta olan ve bizim durumumuzda V., ek Gram-negatif bakterilere uzatıldı cholerae. Zamanla diğer araştırmacılar tarafından optimize edilmiş gibi protokolünün yaratıcısı tespit edilemez. Burada sunulan yöntem eden LABORATOR kullanılmıştıryaklaşık iki yıldır ler, ve bizim akranları ile bu yararlı bir protokol paylaşmak hedefimizdir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Elektroporasyon hızlı ve verimli bir şekilde geniş bir hücre aralığı içine yabancı DNA&#39;nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Electrotransformation doğal olarak yeterli değildir prokaryot DNA &#39;nın verilmesi için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Elektroporasyon arıtıldı DNA ve yetkili bakteri ek olarak, ticari olarak temin edilebilen gen puls kontrol ve küvetler gerektiren, hızlı, verimli ve akıcı dönüşüm yöntemidir. Darbe aşamasından aksine, elektro-hücre hazırlama orta-logaritmik fazı büyümüştür tekrar steril, soğuk su hacimleri azaltmada santrifüjleme ve yıkama mermi ya da kültürlerin büyük hacimlerde iyonik olmayan tamponlar içeren yoğun zaman alıcı ve emek büyüme. Zaman ve çaba ticari kaynaklardan elektrokompenant hücreleri satın alarak kaydedilebilir, ancak seçim sık E. istihdam sınırlıdır coli laboratuar suşları. Biz burada hızlı bir yaygınlaştırılması ve vardırelektrobileşen E. hazırlanması için etkili bir yöntem bir süre için bakteriyoloji laboratuarlar tarafından kullanımda, V uyarlanabilir edilmiştir coli, cholerae ve prokaryotlar. Biz orijinal tekniğini geliştirmek için krediye kime tespit edemesek, biz burada bilimsel topluluk için kullanılabilir yapıyoruz.

Biz E. ile dönüşümler bir dizi yürütülen coli ve V. cholerae ilk elektro bakteri hazırlanması için, Dower ve ark. 2 tarafından tarif edilen (geleneksel) yönteminin bir uyarlanması ile hızlı bir yöntemin dönüşüm verimliliğini karşılaştırmak için. Yetkin hücrelerin hazırlanmasını geleneksel gerçekleştirmek için, bir 2 L Erlenmeyer şişesi içinde-500 ml LB E: 500 ul gecelik kültürü ile aşılanmıştır E. coli DH5a ya da V. orbital bir karıştırıcı (37 ° C&#39;de 215 rpm) inkübe edilir ve 0.5-1.0 arasındaki OD 600 hasat cholerae O395. Şişe, buz üzerinde soğutuldu ve kültürler, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4000 x g&#39;de, önceden soğutulmuş bir rotor içinde santrifüjlendi Hücre topakları tamamen V için 500 ml buz soğukluğunda 2 mM CaCI2 içinde yeniden süspanse edildi E için cholerae ve GKD 2 O coli ve tekrar santrifüje tabi aynı şartlar altında. Resüspansiyon An sonraki rauntd santrifüj emin kültür 4 ° C&#39;de soğutulmuş kalmıştır yapma 200 hacimleri ve 100 ml hacim azalması içinde gerçekleştirilmiştir Son olarak, bir 10 ml hacminde bir yeniden süspansiyon ve santrifüjleme,% 10 gliserol ile gerçekleştirilmiştir. Nihai pelet, 2 ml% 10 gliserol içinde yeniden süspanse edildi ve 40 | il tam bölünen miktarları, -80 ° C&#39;de donduruldu ve daha önceki elektroporasyon için bir haftadan daha uzun depolanmıştır. Darbe ayarları ve küvet boyutu da dahil olmak üzere Elektroporasyon koşulları ne olursa olsun, yetkin hücre hazırlama yöntemi tüm electroporations hem de bakteri türleri için aynıdır. Tek fark, biz soğuk GKD yılında E. 2 O yıkar yürütülen oldu coli ve V için soğuk 2 mM CaCl2 cholerae. Tablo 1 aynı şekilde, ancak hızlı protokolü ile ya da geleneksel yöntemle ya da kompetan hale elektroporasyon ile transforme edilmiş bakterilerin neden olur. Biz ortak olarak zorlanma O395 ve DH5a istihdamV. ly kullanılan temsili suşları cholerae ve E. sırasıyla coli, benzer sonuçlar (her bir soy test edilmiştir olmasa da) aynı türün başka türlerden elde edilen ve büyük olasılıkla muhtemelen dışındaki diğer Gram-negatif bakteri ve uyarlanabilir. Eşit hücre sayıları darbeli her parti mevcut olduğunu sağlamak için, hızlı bir yöntem kullanılarak oluşturulan elektro-bakteriler, toplanarak bir araya getirilmiş karıştırıldı, homojen olarak süspansiyon haline tutulur, ve kısa bir süre önce, elektroporasyon için 40 ul hacim içinde alikotlandı. Geleneksel yöntem kullanılarak üretilen elektro bakteri benzer önce 40 ul hacimde donma tedavi edildi. Nabız teslimattan sonra, 40 ul elektroporasyona bakteri her parti 400 | il LB içine süspanse edildi ve seri olarak 1:10 seyreltilmiştir. Her bir seyreltme yüz mikrolitre 100 ug / ml ampisilin mevcudiyetinde LB agar üzerine kaplanmıştır ve steril bir cam hücre dağıtıcısı kullanılarak yayıldıve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildi. Her bir dönüşüm kullanılan bakteri sayısını ölçmek için, her hazırlanan toplu elektro bakterilerin 40 ul hacimler seri olarak seyreltilmiş, ve aynı şekilde paralel olarak, antibiyotikler olmadan LB agar üzerine kaplanmıştır. Her partiden eşit muamele bakterilerin bir alikosu DNA&#39;sız 1 ul Tris-EDTA (TE) tampon ancak (mock dönüşüm), seri olarak teslim tarafından kayıp hücre sayısını tahmin etmek için, antibiyotikler olmaksızın seyreltildi ve LB agar üzerine kaplanmıştır ile elektroporasyona tabi tutulmuştur elektrik nabız. Son olarak, deney için ek bir varyasyon elektroporasyon ancak LB-agar üzerine plakalanmadan önce dönüştürülmüş hücrelerin kurtarma etkileyecek sonra 1 ml LB içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika inkubasyon olmadığını belirlemek için yürütülmüştür. Koloni oluşturan birim (CFU) bir sonraki gün numaralanmıştır. Bu deneme için biz pUC18, bilinen bir laboratuvar plazmid kullanılabilir, ve yetkili bir bakteri toplu oluşanpproximately hücreleri için 10 8 CFU geleneksel yöntem ve hızlı bir protokol kullanılarak hazırlanır hücreleri için 10 7 CFU kullanılarak hazırlanır. (DNA&#39;sız) tek başına Elektroporasyon ne olursa olsun, elektrik hücrelerini hazırlamak için kullanılan yöntem kat 10-100 ile uygun CFU azalır. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, transformant verim E için üç suret deney (parantez içinde standart sapma) olarak DNA aralığın 10 6 -10 7 CFU / ug içinde oldu E. coli (DH5a) ve V. cholerae (O395) sırasıyla, elektro-hücre hazırlanması için olan geleneksel yöntem kullanılarak lengthier. Transformant verim E. üç suret deneylerin (parantez içinde standart sapma) DNA&#39;nın 10 5 -10 6 CFU / ug düşmüştür 10 kat çıktı coli ve V. hızlı bir yöntem ile, sırasıyla cholerae. Bu nedenle biz dönüştürülmüş CFU bölünerek dönüştürülmüş bakteri yüzdesi belirlendiCFU sayısı, hücre içerisine özdeş toplu işletmeye (plazmid) olmadan &quot;sahte dönüşümler&quot; ile geri kazanılır. Dönüştürülmüş bakterilerin yüzdesi ne olursa olsun, hazırlanması ve (Tablo 1 parantez sayılar) transforme edilmiş türler yönteminin bir log (2,5-9,4%) içinde oldu. Bu sonuçlar, bu hızlı yöntemin verimliliği yetkili hücrelerin hazırlanması ve Vibrio cholerae ve Escherichia coli suşları temsil hızlı prosedüre eşit müsait olduğu geleneksel lengthier prosedürü ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Biz, β-laktamaz kasetleri barındıran pUC18 gibi plasmidler için, LB et suyu içinde 30 dakika geri kazanım süresi etkilenmez, yani transformasyon etkinliğini bulundu. Transformantların aynı sayıda doğrudan elektroporasyon sonra veya bir 30-45 dakika iyileşme süresi bırakıldı olup hücreler ampisilin mevcudiyetinde LB agar kaplama olup olmadığını geri kazanıldıkaplama öncesi 37 ° C&#39;de LB ortamı içinde mevcuttur. Ampisiline dirençli seçici olmayan koşullar altında büyümesinin gerektirmez Bulgularımız, β-laktamaz sentezleme dönüşümü üzerine yeterince hızlı cereyan ettiğini ortaya çıkarmaktadır. Ancak biz, elektrik şoku kurtarma katkıda ve gen ekspresyonunu başlatmak olabilir LB et suyu, pulsed bakteri seri dilüsyonları gerçekleştirilir unutulmamalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Şekil 1. Elektro bakterilerin hızlı hazırlanması için metodoloji grafik tasviridir. 4-6 saat sonra (inokulum yoğunluğuna bağlı olarak) bakteri yeterli sayıda tek bir LB agar plakasından 4-6 dönüşümleri gerçekleştirmek için toplanabilir. Elektroporasyona tabi olan her nihai hacim için yetkin hücrelerin eşit sayısı sağlamak için, LB agar plakasından toplanan bakteriler, başlangıçta al daha sonra bir araya toplanmış ve yıkanmıştırpelet boyutuna bağlı olarak, 40 ul hacminde iquoted (büyük topaklar 40 ul ile bölünebilir büyük hacimli içinde seyreltilmiştir). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Ampisiline karşı dirençli başkalaşımlar / ug DNA sayısı (Ampisiline karşı dirençli başkalaşımlar, geri kazanılmış [%]) </td></tr><tr><td> Gerginlik </td><td> Geleneksel yöntem </td><td> Hızlı bir yöntem </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2.3 x 10 6 (5 10 x 7.3 ±) [% 9.4] </td><td> 3 x 10 6 (5 10 x 7.1 ±) [% 2.5] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (7 ila 10 x 1.7 ±) [% 5] </td><td> 6.7 x 10 5 (5 ila 10 x 2.1 ±) [% 3.3] </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Elektro-b DNA (pUC18) arasında mikrogram başına dönüşümü verimliliğiAncak bakteriler hızlı bir yönteme göre, geleneksel bir metotla hazırlandı. Tüm dönüşümler (% 1 agaroz jel elektroforezi ile görselleştirildiği gibi ~% 80 süper sarılmış DNA) 500 ng DNA pUC18 ile gerçekleştirildi ve Elektroporasyona tabi tutulan hücreler seri antibiyotik ile LB-agar üzerinde CFU için plakalanmadan önce LB et suyu içinde 10-kat seyreltilmiştir. Non-Electroporated bakteri ve plazmid olmadan elektroporasyona bakterilerin kontrol eder, seri olarak seyreltildi ve antibiyotikler olmadan LB agar üzerine kaplanmıştır önce ve doldurulmasından sonra, canlı bakteri sayısını belirlemek için dönüşümlerin her set için gerçekleştirilmiştir. Elektroporasyona kontroller başarılı bir şekilde transforme edilmiş canlı bakteri yüzdesi için taban hattı temsil etmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA&#39;nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.3K Görüntüleme.  University of Texas Brownsville.  Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder. 

Video: Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: Bakteriyel Patogenez Eğitim Modeli Organizma - Röportaj

Biyoloji

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...