Bu sonuçlara yol açan araştırma n hibe anlaşmaları kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı. 228334 ve 241526. Bu araştırma projesi, aynı zamanda İnsan Frontier Bilim Programı araştırma bursu (RGP0027/2009) tarafından desteklenen ve olmuştur Flagship Proje Nanomax çerçevesinde Eğitim, Üniversite ve Araştırma İtalyan Bakanlığı tarafından ve çerçevesinde İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından &quot;Kök Hücreler Teklif Çağrısı&quot;. Bu araştırma, &quot;Ente Cassa di risparmio di Firenze&quot; tarafından desteklenen ICON vakıf araştırma faaliyetlerinin çerçevesinde yürütülmüştür.

1.. Doku Hazırlama ve Saklama <ol><li> 0.01 M PBS içinde% 4 paraformaldehid, 100 ml, ardından 20 ml 0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile standart transcardial 13 perfüzyon yoluyla fare beyin düzeltildi. Dikkatli bir şekilde 7.6 &#39;hem çözeltilerin pH değerini ayarlamak: pH biraz daha düşük değerleri, EGFP floresan söndürülmesi olabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de paraformaldehitte% 4 gecede kesilip beyinleri Post-fix </li><li> 4 ° C &#39;de, 0.01 M PBS içinde 0.01 M PBS ve mağaza da iki kez (her biri 30 dakika) yıkayın </li></ol> 2. Dehidrasyon ve Takas Not:. Dehidratasyon ve takas için protokol yakından Becker ve ark 10 tarafından açıklanan bir izler <ol><li> Güçlü bir kroma kullanılarak bazik aktif alüminyum oksit (Brockman aktivitesi sınıf I, THF içinde yaklaşık 250 g / L) ile XFP floresan, filtre THF söndürme dehidrasyon çözgen (tetrahidrofuran, THF), ikinci peroksitler kaldırmak içinsütunu tography. Peroksit kaldırma azaltacak, sütunun çatlama kaçının. </li><li> THF önce, filtrasyondan önce stabilize edilmiş olsa bile, nihai çözeltiye dengeleyici (butile hidroksitolüen, 250 mg / L) ilave edin. Sabitleyici olmadan THF peroksitlerin büyük miktarda gelişebilir ve patlayıcı ve tehlikeli olabilir: Sabitleyici alüminyum oksit tarafından muhafaza aslında. </li><li> Daha sonra% 50,% 70,% 80,% 90,% 96,% 100, 1 saat, her biri bir gece boyunca% 100: bütün fare saf su içinde THF bir aşamalı dizi beyin kurutmak. Dönen bir tekerlek üzerinde numune ile şişe yerleştirin. Işık maruz kalmasını önlemek için, bir alüminyum folyo ile sarın şişeleri. </li><li> Alüminyum oksit ile temizleme çözücü (dibenzil eter, DBE) filtrele (aktif temel aktivite seviyesi Brockman I, DBE yaklaşık 250 g / L), bir filtre hunisi kullanılarak. </li><li> % 100 DBE de örnek temizleyin. 3 ve 6 saat sonra çözelti değiştirin. </li></ol> 3. Montaj Numune <ol><li> Beyin, göz (Tipik kanalı&#39;nın tarafından şeffaf görünüyor zamanİkinci DBE değişiklikten sonra Cally 1 saat), aşağıdaki yöntemlerden biri ile uçlu görüntüleme plaka üzerine monte: </li><li><ol><li> Doğrudan montaj - yavaşça ipuçları biri (Şekil 3a) üzerinde örnek dalma. </li><li> Agaroz disk - ipuçları 6% agaroz jel yapılmış bir disk dalıyoruz. Yavaşça akrilik yapıştırıcı ile agaroz disk üzerindeki örnek düzeltmek (Şekil 3b). Tedavi için yaklaşık 1 dakika bekleyin. </li><li> Agaroz beher - ipuçları% 3 agaroz jel yapılmış bir beher dalıyoruz. Yavaşça beher altındaki (Şekil 3c) üzerine numuneyi. </li></ol></li></ol> Not 1: bütünüyle örnek görüntüleme önemli olduğunda agaroz beher içinde montaj tercih edilmelidir, ancak, numuneyi çevreleyen agaroz jel görüntü kalitesi için zararlı olabilir, ek ışık dağılımı meydana getirir. Numunenin çok küçük bir bölümü görüntüleme dışında olabilir, bu spec monte etmek daha iyidiragaroz diskte veya doğrudan ucunda imen. Eski yöntem en iyi (koku ampuller bir kısmını görüntüleme veya spinal kord hariç) dikey beyin tutmak için yatay beyin (beynin ventral ve dorsal kısmını görüntüleme itibaren hariç), ikincisi tutmak için uygundur. Not 2: açıkça saydam olana kadar agaroz jel (% 50 ve% 100 her biri 4 saat) daha sonra susuz THF ile su içinde hazırlanabilir, ve DBE,% 100 temizlenmiş 4 saat ya da gerekmektedir. <ol start="3"><li> Yukarıdaki yöntemlerden birine sonra numune monte edildikten sonra, cımbız kullanarak numune odasının içine görüntüleme plaka yerleştirin. Çözeltisi temizleme odası ile doldurun. </li></ol> 4. Tomografi Hazırlık <ol><li> Mümkün olduğu kadar çok floresan toplamak için yarık çıkarın. </li><li> Photobleaching önlemek için, düşük lazer gücü ile örnek aydınlatın. </li><li> Yazılım odaklı micropositioning syste kullanarak üç yönde örnek hareketm. Her yön için örnek ışıklı ve kamera (Şekil 4a) görüş alanı içinde olduğu olduğu için minimum ve maksimum koordinatlarını belirlemek. </li><li> &#39;Pre-tomografi&#39; alt yordam için parametre olarak yukarıda koordinatları yerleştirin. Ayrıca tomografi kullanılmak üzere bitişik yığınlar arasındaki mesafeyi ve z yönünde ön tomografi örnekleme adım belirtin. </li><li> (4.4) de belirtilen z örnekleme ile her yığınında görüntüleri toplar ön tomografi, başlatın. </li></ol> Not: Toplanan görsel örnek şekil ve konum kaba bir ilk görüntüleme süresini azaltır ve bu nedenle, foto ağartıcı sadece gerçekten numune kapladığı hacme tomografi satın alma sınırlayan sağlar: (Şekil 4b), hazırlanması için bir yazılım tarafından kullanılır. 5. Tomografi Acquisition <ol><li> Micropositioning sistemi kullanılarak ışık tabakanın dışında örnek hareket ettirin. </li><li> A.Ş.rease lazer gücü ve görüş alanının merkezinde tek bir sabit hat aydınlatmak amacıyla, tüm tarama sistemlerinin hareketini durdurur. </li><li> Yarık montaj ve takas çözüm otofloresans sinyali kullanarak hizalayın. Bu açıkça görüş alanının merkezinde yarık satır göreceksiniz. </li><li> , Tarama sistemini yeniden aktive lazer gücü azaltmak ve micropositioning sistemi kullanılarak ışık tabakanın içindeki örnek hareket ettirin. Yarık birlikte kullanılan lazer gücü, ışığın uzamsal filtre blok yana olmayan bir ihmal edilebilir bir payıdır olmadan kullanılan daha yüksek olacağını not edin. </li><li> Görüntüler net ve parlak bir görünüm kadar, genlik ayarlayın ve kontrol yazılımı ile tarama ve de-tarama sistemlerinin ofset. </li><li> Deney için uygun z adımı ayarladıktan sonra, tomografi toplama yazılımı çalıştırın. Hacmi çok paralel, kısmen örtüşen yığınlarının (Şekil 5a) görüntülü olacak, ve görüntüler kaydedilirhiyerarşik bir klasör yapısı. </li></ol> 6. Dikiş ve Görselleştirme <ol><li> Bir otomatik yazılım (Şekil 4c) kullanarak sentetik siyah görüntüleri ile (toplanan aynı tip ve boyutlarda yani görüntüleri olanlar-, ama sıfır yoğunluğu ile) edinilen seviyesini tamamlayın. Bu adım, tam bir küp hacmi ile başa çıkmak için dikiş yazılım için zorunludur. </li><li> Başlat Vaa3D yazılım (serbestçe indirilebilir <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> TeraStitcher ve TeraManager yüklü eklentileri ile). </li><li> TeraStitcher eklentisi yükleyin. Görüntülü hacim içeren dizini seçin, (bir referansa göre koordinat sistemi sağlak) eksenlerin göreli yönelimleri işaret ve voksel boyutu. </li><li> Dikiş ilk bölümünü başlatın. Yazılım yığınlarının çiftler arasındaki nispi yer değiştirmeyi hesaplamak, ve genel bir optimum placem bulabilirsinizbirlikte tüm yığınlarının ent (Şekil 5b). </li><li> Tek çözünürlükte veya çoklu-çözünürlük formatında dikişli hacmini kaydetmek için seçin. İkincisi TeraManager eklentisi ile çoklu-çözünürlüklü görüntüleme için olanak sağlar. Yüksek çözünürlüklü görüntü birkaç gigabayt daha büyük ise her iki durumda da, aynı yöntemi kaydetmek çok yığını seçin ve bireysel substacks boyutunu belirtin. Bu depolanan verilere verimli bir erişim sağlayacak. </li><li> Dikiş ikinci bölümünü başlatın. Yazılım hizalanmış yığınları birleştirme ve tek veya çoklu-yığın modu (Şekil 5c ve 5d) onları kurtaracak. Sonunda TeraStitcher eklenti kapatın. </li><li> TeraManager eklentisi yükleyin. Çok yığılmış çok çözünürlüklü hacmi ile klasörü seçin ve voksel boyutunu gösterir ve yönelimleri eksenleri. Hacmi minimum çözünürlükte yüklenecektir. </li><li> Daha yüksek bir çözünürlüğe yakınlaştırmak için, sağ-tıklama modalit kullanarak bir dönüm noktası seçinVaa3D y, sonra fare kullanarak kaydırma yakınlaştırmak. Alternatif olarak doğrudan bir sağ tıklama ile yakınlaştırmak için ROI seçin, ya da ilgi hacminin koordinatlarını belirleyebilirsiniz. </li><li> Düşük çözünürlüğe geri yakınlaştırmak için, sadece fare kaydırma kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+light+sheet+microscopy:+micron-scale+neuroanatomy+of+the+entire+mouse+brain.">Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain.</a> Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Kimyasal temizlenmesi ile birleştiğinde CLSM floresan probları, proteinler ya da sentetik boyalarla işaretlenmiş tüm fare beyinleri nöroanatomisini incelemek için güçlü bir araç temsil eder. Odak düzlemi dışında yayılan ışık fiziksel mekansal filtre tarafından engellenen beri hafif levha mimarisinin tipik yüksek çerçeve hızlarını korurken, yüksek kontrastlı görüntüleme, kalın kesitlerle da mümkündür. Açıklanan yöntemler kullanılarak zaman başa ana konu kontrast maksimizasyonu olduğunu. Aslında, mevcut sinyal kimyasal ve optik faktörler tarafından her iki düşürülür. Bakış kimyasal açıdan bakıldığında, bir organik çözücü göre temizleme işlemleri floresan protein ve diğer floresan boyalar 7 emisyon söndürülmesi olabilir. Becker et al., 10 tarafından tarif edildiği gibi çözücünün süzülmesi, peroksitleri çıkarmak için, solvent-temizlenmiş dokularda da floresan iyi bir düzeyde muhafaza sağlar. YayınlamakTüm kemirgen beyinleri ile uğraşırken ed su bazlı temizleme yöntemleri 14 en azından doğrusal optik teknikleri ile, floresan verimliliğini azaltır, ancak yoksul şeffaflık yol açmaz. Diğer yandan, şu anda, yüksek kırılma indeksi (n ≈ 1.56) kullanılan çözümler temizleme için düzeltilmiş uzun çalışma mesafesi olan ticari amaçlar vardır. Bu durumda, numune içine gömülmüş olduğu orta ve objektif tasarımında bir kırılma endeksi arasındaki uyumsuzluk güçlü küresel sapmaları yol açmaktadır. Mikroskobun çözünürlüğünü azaltarak yanı sıra, bu tür sapmaları ışığı daha geniş bir alana yayılmış olduğundan, görüntü yoğunluğu ve kontrast bir düşüşe neden. Bu konuya Yapılabilecekler uyarlanabilir optik 15 ve / veya statik asferik düzelticisi kullanımını içerir. Daha kısa bir görüntü kontrast Başlangıcı ve yoğunluk herhangi bir gelişme, hali hazırda, aynı zamanda görüntüleme hızını etkilergörüntü başına tegration zaman seçilebilir. Şu anda CLSM 100 msn 9 bir kamera maruz kalma süresi ile, yaklaşık 10 um 6 3 / sn &#39;lik bir görüntüleme hızı gelemez. Bu hızda bu numune boyutuna bağlı olarak 1-3 gün görüntüye bütün bir fare beyin alır. Görüntü kalitesinde önemli bir bozulma çünkü çoğunlukla hafif sac aydınlatma 6 içsel düşük ağartmanın böyle uzun görüntüleme oturumu boyunca görülmekle birlikte, uzun süre tek bir fare beyin pratikte CLSM uygulanabilirliğini azaltabilecek görüntü gerekiyordu. Tespiti için yüksek hızlı kameranın kullanımı ile birlikte sistem verimliliği bir 10-kat artış, tarif edilen protokol rutin bir kullanımına izin veren, bir kaç saat için bir görüntüleme zamanı azaltacaktır. Tüm yukarıda belirtilen sınırlamalara rağmen, az bir de mikron çaplı bir çözünürlüğe sahip tüm fare beyinleri yeniden dokular izinlerinin kimyasal açıklığa birleştiğinde CLSM görüntülemehafta. Tüm beyin görüntüleme için diğer optik yöntemler CLSM daha yüksek çözünürlüğe göze, ancak daha uzun hazırlık ve / veya görüntüleme süresi 2-4 fiyata, ya da seyrek z örnekleme 5. Bu makalede açıklanan yöntemler floresan etiketlemesi için farklı stratejiler ile kombinasyon halinde kullanılabilir: transgenik hayvanlar, vb seçilmiş nöron alt gruplarının, viral transfeksiyonu, intraparenkimal boya enjeksiyon, floresan proteinleri ifade Uygulamada, hayvan kurban önceki tüm boyama stratejileri CLSM uyumludur . , Boyama bu tür yakın gelecekte mümkün olurdu neyse, CLSM ile yeniden olabilir örneklerin sayısı daha fazla olur, aslında, tüm fare beyinleri otopsi floresan etiketleme bugüne kadar ortaya konmamıştır potansiyel olarak insan beyin dokusu da dahil olmak üzere. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi ışık tabaka TBS ile birlikte kullanılırsue takas ve çok çözünürlüklü veri yönetimi araştırmacılar çoğu laboratuarların elinde iyi olan teknolojik çabaları ile, mikron ölçeğinde çözünürlüğe sahip makroskopik örnekleri yeniden ve analiz etmek için izin verebilir. CLSM potansiyel uygulamaları nörobilim sınırlı değildir elbette, ama 16,17 ve küçük hayvanların 18 anatomisini embryogenesis olarak, hafif levha mikroskobu zaten kullanılmış olan tüm araştırma alanları kapsar.

Moleküler ve hücresel mekanizmaları altta yatan beyin fonksiyonlarının anlayışımıza göre, ince nöroanatomi bilgimiz henüz emekleme 1 hala görünüyor. Aslında, biz hala beyin boyunca nöronal somata veya uzun menzilli çıkıntıların konumuna kapsamlı haritalar eksikliği. Aslında, birçok teknolojik çabalar mikroskobik çözünürlükte fare beyin yeniden adadık. Reçine gömülü numunelerinin seri kısımlara göre optik yöntemler Bıçak kenar tarama mikroskobu (KESM) halinde 2, Mikro-Optik Bölünmesi tomografi (ÇOK) ve floresan 3-EN (fMOST) 4, alt-mikron üç boyutlu çözünürlüğü sağlayabilir Tüm fare beyinleri görüntüleme. Ancak, tek bir numune hazırlanması ve görüntüleme için gerekli olan toplam zaman bu yöntemlerin sınırlayıcı pratik uygulama, birkaç hafta düzeyindedir. Seri kesit dayalı başka bir tekniktir (ama reçine gömme olmadan), Seri İki-Foton tomografi (STP) 5, yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntüleme sağlar. Ancak, bu teknik 1 bölümü her 50 mikron 5 toplama, sadece çok seyrek örnekleme ile tüm fare beyinlerinde kanıtlanmıştır, ve bizim bilgilerimize STP henüz bir fare beyninin tam örnekleme yeniden üretemiyor. Yüksek hızda üç boyutlu olarak tüm örneklerin yeniden bir üstün optik yöntem hafif levha mikroskobu 6&#39;dır. Bu optik şemada örnek bir ışık ince bir tabaka ile aydınlatıldığında ve floresan emisyonu aydınlatma düzlemine dik olan bir eksen boyunca toplanır. Bu sayede sadece odak flüoroforlar heyecanlı ve yüksek çerçeve hızlarını garanti, geniş alan konfigürasyon optik bölümlendirilmeleri elde etmek mümkündür. Bir kırılma indeks uyumlu sıvı 7 su ile ikame göre temizleme protokolleri bağlanmış olduğunda, ışık mikroskobu tabaka uygulanmıştırFare beyinleri bütün olarak 8 makroskopik örnekleri,. Ancak, elde edilen görüntü bulanıklık genel ekler out-of-odak Flüoroforlann uyarılmaya neden ışık tabakası düşürür, hatta temizlendikten örnekleri etkiler ışık saçılması, numune kaynaklı. Seçici sadece odak fotonları toplamak için, son zamanlarda bir konfokal algılama düzeni 9 ışık sac aydınlatma birleştiğinde. Konfokal ışık levha mikroskobu (CLSM) in, out-of-odak ve dağınık fotonlar lineer uzaysal filtre (yarık) öncesinde algılama (Şekil 1) tarafından reddedilir. Işık tabaka mimarisinde konfokal işlemi elde etmek için, bir aydınlatma tarama hattı vasıtasıyla üretilen ve algılama yolunda bir de-tarama sistemi yarığın konumunda uyarma tarama çizgisinin bir statik bir görüntü oluşturur. Üçüncü bir tarama sistemi kamera sensör üzerinde iki boyutlu bir görüntü yeniden yapılandırır. CLSM temizlenir fare% 100 kontrastlanma tanıyorKonvansiyonel ışık levha mikroskobu ile ilgili beyin, bir 10 Hz kare hızını korurken. CLSM sayesinde Z 2 XY um ve 9 um çözünürlüğü ile tüm fare beyinleri yeniden ve tek bir floresan etiketli nöronlar ayırt etmek için yeterli kontrast mümkündür. Bu maddede biz CLSM ile bir fare beyni yeniden deneysel boru hattı açıklar. Aldehit sabit fare beyinleri peroksit içermeyen tetrahidrofuran serileri içinde suyu alınır ve daha sonra Becker et al. 10 temizlenir numune tarafından geliştirilen protokol izlenerek, peroksitsiz dibenzil eter (Şekil 2) temizlenmiş sonra dikkatli bir şekilde monte edilir uçlu plaka ve bir ısmarlama konfokal ışık levha mikroskop görüntüleme odasında konumlandırılmış. Alternatif olarak temizlenir agaroz jel bir disk (şekil üzerinde yapıştırılmış olabilir, örnek, doğrudan plaka (Şekil 3a) bir ucu üzerine dalma ile monte edilebilir3b) ya da temizlenmiş agaroz jeli (Şekil 3c) yapılmış bir beherin boşluğuna yerleştirilir. Birçok paralel komşu yığınları tüm beyin hacmi (Şekil 4) kapsayacak şekilde edinilen gibi tüm beyin bir optik tomografi, sonra yapılır. Örnek konum ve şekil kaba bir ilk üreten bir ön tomografi örnekleme, görüntüleme sadece örnek tarafından işgal edilen hacim içinde olduğunu garanti eder. Tomografi yığınlar sonradan ısmarlama yazılım ile birlikte dikişli ve bir çok çözünürlüklü hiyerarşik düzeni 11 kaydedilir. Fare beyinleri sonunda Prototypal çoklu-çözünürlüklü Google Maps gibi görselleştirme yazılımları ile keşfedilebilir. Her iki yazılım araçları açık kaynak platformu Vaa3D 12 eklentileri olarak entegre edilmiştir. Biz nihayet ince kemirgen neuroanatom okuyan açıklanan deneysel boru hattının yeteneklerini göstermek için fare beyinleri temsili görüntülerini göstermeky.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Tek hücreli çözünürlükte memeli beyin mimarisini anlama nörobilim önemli konulardan biridir. Ancak, bütün beyin boyunca nöronal soma ve projeksiyonları haritalama hala görüntüleme ve veri yönetimi teknolojileri için zordur. Gerçekten de, makroskopik hacimleri Terabyte aralığında veri setleri üreten, makul bir süre içinde, yüksek çözünürlük ve kontrast ile yeniden inşa edilmesi gerekiyor. Biz son zamanlarda bir optik yöntem gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş tüm fare beyinleri mikron ölçekli imar elde edebilen (konfokal ışık levha mikroskopi, CLSM) gösterdi. Işık sac aydınlatma ve konfokal algılama birleştirerek, CLSM yüksek kontrast ve hız ile makroskopik temizledi örneklerin içinde derin görüntüleme sağlar. Burada floresan proteinleri ile etiketlenmiş tüm fare beyinleri kapsamlı ve okunabilir görüntüler elde etmek için tam deneysel boru hattını tarif. Takas ve montaj procedures birlikte bir çok paralel komşu yığınları alarak onun bütün hacmi üzerindeki bir optik tomografisi gerçekleştirmek için adımlar ile tarif edilmiştir. Biz birden fazla yığınları ve çok çözünürlüklü veri navigasyon dikilmesini sağlayan açık kaynak ısmarlama yazılım araçları kullanımını gösterdi. Tüm Purkinje hücreleri seçici olarak etiketlenmiş edildiği bir L7-GFP transgenik fare, ve rastgele seyrek nöronal etiketleme ile karakterize edilen bir thy1-GFP-M fare gelen bütün beyin beyincik: Son olarak, beyin haritalarının bir örneği tasvir.

Açıklanan protokol, fiziksel kesit için gerek kalmadan, mikron çaplı bir çözünürlük tüm Fare beyinleri ya da kesilmiş ya da parçalar ile yeniden kullanılabilir. Temsili bir sonucu olarak, Şekil 6&#39;da bir L7-GFP fare (doğum sonrası gün 10) bütün serebellum gösterilmiştir. Bu hayvanın tüm Purkinje nöronlar EGFP&#39;nin ile etiketlenmiş. Biraz yakından bakarsak, serebellar korteks tipik katmanlı yapının (Şekil 7) görülebilir. Dahası yakınlaştırma açıkça her Purkinje hücre soma (Şekil 8) ayırt sağlar. Açıklanan protokol, böylece çeşitli nörogelişim çalışmalarda nöronal mekansal organizasyon taranması için kullanılabilir. Ikinci bir tipik Sonuç olarak, yetişkin bir thy1-GFP-M fare beyninden unsectioned görüntüler sunmak. Bu transgenik hayvanda EGFP rastgele seyrek nöronal alt kümesi olarak ifade edilir. Beynin sağ yarısı Şekil 9&#39;da gösterilmiştir. Olarak,ayrıca zoom-in ve daha da (Şekil 10 ve 11), nöronal süreçleri ayırt olur. Bu sonuç, tarif edilen protokol nörodejeneratif hastalığın fare modellerinde hücre çözünürlükte tüm beyin eğitim anatomiyi olasılığını açılması, tüm yetişkin fare beyinlerinde mikron çaplı çözünürlüklü görüntü olanak sağladığını gösterir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Şekil 1. Uyarma yolunu gösteren aparatın konfokal hafif levha mikroskobu (CLSM) optik şeması. (A) Üst görünümü. 488 nm diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer lazer emisyon, ilk teleskop tarafından genişleme ve kolimasyonu sonra, ışın yoğunluğunu ayarlayan bir acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) girer. Daha sonra, ikinci bir teleskop daha da ışın genişletir. (Y birlikte) dikey bir galvo ayna olmak tarar<html> deteksiyon yolunu gösteren tertibatın numune odasının iç tarafında bir mercek tarafından odaklanmıştır AM. (b) yanal görünüşüdür. Algılama objektif tarafından toplanan hafif dikey bir galvo ayna tarafından descanned ve hareketli uyarım hattı sabit bir görüntü üreten, bir lens tarafından odaklanmıştır. Sabit görüntünün konumunda bir doğrusal uzamsal filtre (yarık) yerleştirilir. Yarık sonra, 4f lens sistemi içine yerleştirilen bir galvo ayna, bir elektron-çarparak şarj bağlı cihaz (EM-CCD) ve çip üzerinde 2 boyutlu görüntüyü yeniden yapılandırır. Bir floresan bant geçiren filtre tespiti önce tüm uyarma başıboş ışık kaldırmak. Uyarma, algılama ve bant geçiren filtreden algılama ışık Temsilcisi ışınları sırasıyla, mavi, açık mavi ve yeşil ışınları tarafından tasvir edilmektedir. Aslında mikroskop kullanılan tüm lenslerin odak uzunlukları gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; jove_content hep &quot;&gt; <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Şekil 2,. Örnek takas. Formaldehit sabit fare beyinleri, 4 ° C&#39;de PBS içinde 0.1 M depolanır (a), ((THF, b) ve daha sonra% 100 dibenzil eter içinde temizlenmiş, tetrahidrofuran kademeli bir dizi suyu alınır DBE , c). Dehidratasyon adım, aynı zamanda bazı doku büzülme neden olur. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Şekil 3.. Numune CLSM görüntüleme için montaj. Temizledi beyni doğrudan (a), temizlenmiş bir agaroz disk (b) üzerine yapıştırılmış veya temizlenmiş bir agaroz beher (c) takılı uçlu montaj plakası üzerine dalmış olabilir. Şekil 4. Tomografi elde etme. Ön tomografi rutin örnekleri beyin (a) bir görüntü için tüm gerekli numune paralel komşu yığınlarının sayısı ve uzunluğu tanımlamak için ihtiva eden bir paralel yüzlü (b). Tomografi sonra, siyah görsel bir paralelyüzlü sanal alınan hacmi tamamlamak için oluşturulan (c). <img alt="Şekil 5," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Şekil 5,. Cilt dikiş. Toplanan görüntü kısmen TeraStitcher eklentisi (b) ile hassas uyumu sağlayan, (a) aralarında üst üste yığar. Eklenti daha sonra, tek yığılmış (c) ya da çok-sta ya hizalanmış yığınları birleştirircked (d) çoklu çözünürlük gösterimi. <img alt="Şekil 6," fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Şekil 6,. Tüm Purkinje nöronları EGFP. Ölçek çubuğu, 1 mm ile etiketlenmiş olduğu bir P10 L7-GFP fare, tamamı serebellum. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Şekil 7. Serebellar korteks. Ölçek çubuğu, 500 um, tipik katmanlı yapısını gösteren, Şekil 6&#39;da gösterilen beyincik bir kısmı, bir zoom-in. <img alt="Şekil 8," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Şekil 8,. Şekil 6&#39;da gösterilen serebellum bir bölümünün ayrıntılı zoom-in. Purkinje hücreleri soma açıkça ayırt olabilir,ed. Ölçek çubuğu, 200 mikron. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Şekil 9,. Seyrek spesifik nöronal EGFP etiketleme. Ölçeği bar, 1 mm ile karakterize bir yetişkin thy1-GFP-M fare, gelen beynin sağ yarısı. <img alt="Şekil 10," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Şekil 10. Yaklaştırma, Şekil 9&#39;da gösterilen yarı beyin bir kısmının,. Ölçek çubuğu, 200 um hipokampus ve korteks bir kısmını gösteren. <img alt="Şekil 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Şekil 11. Kortekste, Şekil 9&#39;da gösterilen yarım beynin bir bölümünün ayrıntılı Yaklaştırma. Çeşitli neurites açık bir şekilde ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu, 50 um.

Watch this Scientific Journal Video about Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

micron-scale-resolution-optical-tomography-entire-mouse-brains-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K Görüntüleme.  European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS).  Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir. 

Video: Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Nörobilim

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Konfokal Görüntülerle Fare Retina OCT Fibergram Hizalaması

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Glokom Tanı ve Tedavisi için In Vivo ve Ex Vivo Retinal Görüntülemedeki Gelişmeler 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...