Fare beyinlerinin immün-histokimyasal lekelenişi nörobilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, beyin histolojisi sonuçlarının kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında değişebilir. Fare beyinlerinin histolojik çalışmaları için tekrarlanabilir, güvenilir ve verimli olduğu kanıtlanmış yerleşik bir metodoloji sunuyoruz.
Prosedürün sergilenmesine yardımcı olacak Dr.Chunmei Wang, laboratuvarımdan yardımcı doçent Sekiz ila 16 haftalık bir C57 siyah / 6J farede başarılı anesteziyi doğruladıktan sonra, fareyi bir köpük tahtaya sabitleyin ve toraks ve karın üzerindeki orta hat boyunca uzunlamasına yüzeysel bir kesi yapın, ardından toraks ve karın kas duvarını ortaya çıkarmak için cildi bir kenara hareket ettirin. Daha sonra, karaciğeri ve bağırsağı ortaya çıkarmak için kas tabakasında bir kesi yapın. Daha sonra makas kullanarak göğüs kafesini keserek toraksı açın ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkarın.
Hemostatik kümesleri kullanarak, çalışma alanını genişletmek için göğüs kafesini bir kenara çekin. Önümüzdeki. bir perfüzyon kanül yerleştirmek için, doğrudan sol kalp ventrikülüne künt bir kanülle nüfuz edin ve yükselen aort içine dikkatlice yerleştirin. Kanül ve bağlı borunun birleşiminin etrafına pimleri perfüzyon sırasında kanülleri yerinde sabitlemek için köpük tahtaya yerleştirin ve kan dolaşımından kan akışını sağlamak için sağ kulakçık kesmeye devam edin.
Salin ile perfüzyon için, tuzlu su basınç anahtarını açın ve fareyi transkardiyatif olarak 40 ila 60 mililitre salin ile perfüzyon. Sağ kulakçıktan çıkışı ve karaciğerin rengini yakından gözlemleyin. Daha sonra, formalin ile boğmak için, salin basınç anahtarını kapatın ve fareyi% 10 nötr tamponlu formalin 40 mililitre ile boğmak için formalin basınç anahtarını açın.
Titreme kanıtı için hayvanın uzuvlarını gözlemleyin. Beyin izolasyonu için, başı çıkarmak için makas kullanın ve kafatasını ortaya çıkarmak için bütünleme boyunca bir orta çizgi kesisi yapın, ardından cilt ve kas bağlanmasını kesin. Daha sonra, yörüngesel sırtta bir kesim yapın ve iris makasının keskin ucunun foramen magnum'a yerleştirilmesi.
Beynin zarar görmesini önlemek için yukarı doğru basıncı koruyarak kafatasının iç yüzeyi boyunca makası ilerletin. Daha sonra, beyni açık kafatasından çıkarmadan önce parietal ve frontal kemikleri ve menenjitleri dikkatlice çıkarın. Kayan bir mikrotomun yükseklik ayarlama plakasının üzerine kuru buz yerleştirin ve beyaz don görünene kadar bekleyin, ardından sakkaroz donduktan sonra sağlam bir taban tabakası oluşturmak için plakanın üzerine% 30 sakkarozun beş mililitresini dikkatlice yayın.
Daha sonra, tüm beyin örneklerini yatay olarak sakkaroz tabanının üzerine% 30 sakkarozun 500 mikrolitresi ile bir çizgiye yerleştirin. Beş ila 10 dakikalık donmadan sonra, beyin sert ve beyaz hale geldiğinde, istenen katmana veya bölgeye ulaşılana kadar beyni kırpın, ardından 25 mikrometre kalınlığında bölümler oluşturmak için trim modundan besleme moduna ve bölüm beyin dokusuna geçin. Ardından, PBS ile dolu 48 kuyulu bir plaka hazırlayın ve bir fare beyni için beş kuyu işaretleyin.
Bir boya fırçası kullanarak, bir bölüm toplayın ve bir kuyuya yerleştirin, ardından aynı farenin sonraki bölümünü toplayın ve ikinci kuyuya yerleştirin. Beşinci kuyuya ulaşılana kadar prosedürü tekrarlayın, birinci ila beşinci kuyuya altı ila 10 bölüm yerleştirin, vb. Pbs ile dolu altı kuyulu bir hücre kültür plakasının bir kuyusuna bir hücre süzgeci yerleştirin ve bir boya fırçası kullanarak bir dizi beyin bölümünü hücre süzgecine aktarın.
Hücre süzgecini çalkalayıcıda PBS ile dolu başka bir kuyuya aktararak bu bölümleri PBS'de durulayın. Daha sonra, beyin bölümlerini hücre süzgecinden bir mililitrelik biyotin etiketli WFA içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir gecede 50 RPM'de sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beyin bölümlerini daha önce gösterildiği gibi PBS ile durulayın, ardından bölümleri bir mililitre streptavidin-gün ışığı 488 çözeltisi içeren bir tüpe aktarın ve sallanan bir platformda iki saat boyunca kuluçkaya yatırın.
Beyin bölümlerini PBS ile tekrar duruladıktan sonra, iki saat boyunca bloke tamponunda kuluçkaya yatırın, ardından bir gecede birincil antikorda inkübasyon sallanan bir platformda. Ertesi gün, PBS durulamalarını takiben, ikincil antikordaki bölümleri iki saat boyunca kuluçkaya yatırın. İki Petri kabını 100 mililitre PBS ile doldurun ve tüm beyin bölümlerini bir süzgeçten ilk yemeğe aktarın.
Beyin bölümlerini kaudalden rostrale nöroanatomik sırayla hizalayın. Daha sonra, bir kaydırağı bir ucu bir standla hafifçe eğik olarak ikinci tabağa batırın ve ince bir boya fırçası kullanarak, hava tampon arayüzünün hemen altındaki bir beyin bölümünü eğik kaydırağa hafifçe yerleştirin. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, beyin bölümü tamamen hava tampon arayüzünün üzerinde olana kadar seviyesini düşürmek için tamponu yavaşça ve nazikçe çıkarın.
Slaydın altına ulaşılana ve tüm bölümler slayda takılana kadar bu işlemi yinelemeye devam edin. Görüntüleme için tarayıcıyı ve bilgisayarı açın, ardından slaytları yükleme aygıtıyla slayt tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu tarayıcıya yerleştirin. Tarayıcının yazılımını açın ve uygun depolama konumunu ve tarama profilini seçin.
Önizleme Taramasını Başlat düğmesine tıklayarak önizleme taramasını başlatın. Taramadan sonra doku algılama sihirbazını açın ve görüntüleme için ilgi alanlarını daire içine alıp daire içine alıp verin. Görüntüleme bölgelerini seçtikten sonra Taramayı Başlat düğmesine tıklayın ve makinenin taramayı bitirmesini bekleyin.
Sonuç dosyasını denetleyin ve görüntüleri dışa aktarın. Burada gösterilen bregma negatif 0.82 milimetre koronal fare beyin bölümlerinin temsili floresan immün-histokimya görüntüleri, wisteria floribunda aglutinin, arginin vazopressin ve DAPI dağılımını gösteren. Ön hipotalamus ve retiküler çekirdeğin perifornik bölgesinde Wisteria floribunda agglutinin sinyalleri gözlenirken, paraventriküler çekirdekte arginin vazopressin sinyalleri görülür.
Bu protokolü ilk kez denerken, deneyimli bir araştırmacının gözetiminde gerçekleştirmeyi öneriyoruz. Protokol, farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında optimal ve tutarlı histolojik sonuçlar elde etmeye yardımcı olacak ve bu tekniği öğrenen yeni başlayanlar için bir referans görevi görecektir.
