Bu protokol McGinnis Lab, Kim A. Mace ve Joseph C. Pearson önceki üyeleri ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Biz değerli hisse senetleri düzenlemek ve dağıtmak çalışmaları için Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi tarafından devam çabalarını teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM077197 ve K12 GM68524) ve Herbert Stern aileden fon tarafından desteklenmiştir. MTJ anda Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların üzerinde Ulusal Enstitüsü Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Hibe Numarası 8G12MD7603-27 Hibe Numarası 5G12RR003060-26 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Azınlık Sağlık Ve Sağlık Farklılıkların veya Sağlık Ulusal Enstitüleri üzerinde Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Drosophila embriyonik yara protokol beş adımda özetlenebilir: (1) Embriyo Collection, (2) Embriyo Hazırlama (3) Embriyo Yaralama, (4) Embriyo Mikroenjeksiyon, ve (5) Embriyo Fiksasyon. 1.. Embriyo Koleksiyonu <ol><li> , Yetişkin sinekleri toplayın 2-3 gün eclosing sonra, bir embriyo toplama kafesine 50 kadın ve 25 erkek ekleyin. </li><li> 3 gün boyunca her sabah taze bir elma suyu agar artı mantar plaka koyun. Notlar: 25 ° C inkübatör, 12 saat gündüz tarifesi optimum embriyo toplama, çevrimi için sinekler (ve 17:00 ışıklar &quot;OFF&quot; &quot;ON&quot; 05:00 ışıkları); dişi sinekler ışık döngüsü değişikliklere yanıt ve ışıkları &quot;OFF&quot; 10,11 &quot;ON&quot; ışıkları bir geçiş sırasında yumurta büyük miktarlarda yatıracaktır. </li><li> Day-3 öğleden sonra, kafes üzerinde bir taze elma suyu artı maya agar plaka koyun ve 2 saat boyunca embriyolar toplamak. Kafese yeni bir maya tabak yerleştirin ve kaydedin2 saat toplama plakası. </li><li> Embriyoların yaş 25 ° C&#39;de ek bir 14 saat boyunca toplama plakası saklayın. Notlar: Yara iyileşmesi Drosophila gelişimi sırasında herhangi bir aşamada analiz edilebilir, bu yazıda bahsedilen yara ile indüklenen transkripsiyonel raportörler, 15-16 Aralık aşamaları arasında optimum aktiviteye sahiptir. Geç evre 17 tarafından, embriyo kolayca olgunlaşan manikür delmek ve verimli bir yara gazetecilere etkinleştirmek veya yara kaynaklı transkripsiyonunu tespit etmek çok eski. Toplama zamanı ve yaralama zaman yoğun laboratuvar saatlerinde meydana izin vermek için, biz, saat 18:00 &#39;de yeni bir plaka ile toplama plakası alışverişi, 2 saat (16:00-18.00) için embriyo toplama bir program takip yaş 14 saat (bir gece) 25 ° C&#39;de bir toplama plakası ve (bir sonraki gün) 08:00 &#39;da embriyolar yara. </li></ol> 2. Embriyo Hazırlık Notlar: Bu protokol, keskin veya g yapılmış birçok araç ve nesne kullanımını içerirkız. Yaralanmaları önlemek için itina ile tüm keskin ve cam nesneler tutun. <ol><li> Yavaşça plaka ve dönen 2-3 ml su eklenerek bir fırça ile toplama plakalardan embriyolar kaldırmak. Naylon örgü ve toplama tüpü için plaka su ve embriyolar transfer. </li><li> Bir plastik Petri tabağı plakasının kap ağartıcı 4-5 ml ekleyin ve 2 dakika için ağartıcı embriyoları içeren toplama borusunun kapalı ucu örgü emmek, embriyonun dış yumurtaların kaldırır. Elle toplama tüpü beyazlatıcıya kümeleyerek embriyolar önlemek için birkaç kez döndürün. Su 10x&#39;e ile embriyolar durulayın ve bir kağıt havlu üzerine dechorionated embriyoları içeren örgüyle kaplı toplama tüpü kurulayın. </li><li> Bir agar plaka örgü naylon ~ 50 embriyolar transfer etmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Biz embriyo hizada kontrast ve yardım eklemek için agar plaka yeşil gıda boyası ekleyin. Bir mikroskop altında, Embry&#39;yi hizalama, ~ 25 embriyo, iki paralel satır yapmakslayt üzerinde os da mikroenjeksiyon aparatı üzerinde delme iğnesine doğru açıda olacak şekilde. Gaz değişimi amaçlı embriyolar arasında küçük bir boşluk (yaklaşık 1 embriyo uzunluğu) bırakın. Iki paralel sıra birbirinden yaklaşık 5 mm olmalıdır. </li><li> Hizalanmış embriyoların üstüne çift kaset sopa ile bir slayt yerleştirin ve dikkatli bir slayt yeşil plaka embriyolar transfer slayt basın. Sonra hava embriyoların kuru ~ 25 dk embriyo üzerinde iç basıncı azaltmak ve yaralama zaman bir patlama önlemek için. </li><li> Daha fazla su kaybını önlemek için embriyolar üzerinde halokarbonlu yağ karışımı 2-3 damla yerleştirin. </li></ol> 3. Embriyo Yaralama <ol><li> Enjeksiyon mikroskop aşamada taslak slayt yerleştirin. Görüş alanında embriyolar bulmak ve ters mikroskop sahne hareket uygulama. Notlar: iğne ile çalışmaya başlamadan önce, dorsoventral ekseni boyunca embriyonun orta düzlemine odaklanmak. Verimli yaraladığı için izin vermek içinhizalanmış embriyolar, yakın iğne aparatı satır yaralama başlar. Görüş alanı içine hizalanmış embriyoların satırın üst getirmek için sahne hareket ettirin. </li><li> Dikkatlice yerleştirin ve iğne tutucu bir çekti-iğne sabitleyin. Slayt aşağı doğru iğne taşımak için mikromanipülatör kullanın. Aynı odak düzlemi, embriyo ile iğne hizalayın. Iğne embriyo ile odak sonra, mikromanipülatör ile iğne taşımak yok. </li><li> Sonra üst üste sonraki embriyo taşımak, ve aracılığıyla embriyo delinme sahne taşıyın. İlk satırı yaralama Bittiğinde, slayt taşımadan önce aşamasından yukarı ve uzağa tamamen iğne taşımak için micromanipulator kullanmak, manuel slayt 180 ° döndürmek ve ikinci satır yara. </li><li> Oda sıcaklığında halokarbonlu yağ altında embriyoların Mağaza ve embriyo sabitleme ile devam situ hibridizasyon veya antikor boyama yapıyor if (Prosedür adım 5). Seçenek olarak ise, 4-6 saat için embriyolar depolamakhalokarbonlu yağ altında ve yara transkripsiyon floresan muhabiri görselleştirme (Temsilcisi Sonuçlar) ile devam. Notlar: floresan haberci görselleştirilmesi için,% 50 1-fenoksi-2-propanol ile 13 embriyolar anestezi. Embriyolar halokarbon yağdan çıkarıldı ve yeni bir lam üzerine yerleştirilir. Biz, embriyoların etrafında cam boncuklar yer anestezik birkaç damla ekleyin ve embriyolar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. </li></ol> 4. Embriyo Mikroenjeksiyon Notlar: Biz protokol kullanmak mikroenjeksiyon aparatı tahlil sırasında belirli bir ses sunmak için otomatik değildir. Biz mikroenjeksiyon görselleştirmek ve teslim ses normalleştirmek için denemek için çözüm bir boya ekleyin. Çok fazla çözelti embriyonun içine enjekte edilir, vitellin zar patlar. <ol><li> Kimyasal çözeltinin ayrıca boya 1 ul arkadan yük iğne (örn. 0,6 MH 2 O 2). Kılcal iziniğnenin ucuna kimyasal çözüm çizmek için eylemi. </li><li> Bir iğne kırmak için, bir slayt ve ceket halokarbonlu yağ karışımı ile kenar üzerinde bir açıyla bir kapak kayma yerleştirin. Açılı kapak kayma kenarı ile odak haline monte iğne getirin ve hafifçe kırık kadar iğne ucu genelinde kapak kayma kenarına taşıyın. Mikroenjeksiyon cihazları üzerinde baskı uygulayın ve kimyasal çözüm artı boya iğne dışarı aktığını kontrol edin. </li><li> Mikroskop sahnede hizada embriyoları içeren slayt yerleştirin. Aynı düzlemde embriyo ve iğne odak geçin. Aynı anda delinme ve Microinject kimyasal çözelti artı her embriyo içine boya. Notlar: Tıkalı iğneler sık ​​sık meydana gelen; eksik mikroenjeksiyon önlemek için yeni bir iğne kırmak. Bir künt bir iğne ucu kadar temiz açılı bir iğne ucu kadar yara almaz. Kırılması sırasında olmayan 90 ° açı ile lamel ayarlanması açılı bir iğne ucu üretmek için en uygunudur. </li></ol> 5. Formaldehit Fixation Notlar: Bu Drosophila tespitte kullanılan kimyasallar zararlıdır. Kimyasalları kullanırken kişisel koruyucu ekipman (örn. eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük) kullanın. Düzenlenir kimyasalların atılması için bireysel, kurumsal yönergeleri izleyin. <ol><li> Yaralanma sonrasında ortaya yara-teşvik edilmiş genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için 15, 30, 60, ya da daha fazla dakika bekleyin. Enjeksiyon slaytlar embriyolar kaldırmak için, dikkatli, slaytlardan halokarbonlu yağ karışımı boşaltın rafa karşı slayt yalın ve bir Kimwipe ucunu kurulayın. </li><li> Slayt üzerinde heptan durulama ve bir cam Petri kabı içine sıvı durulama yıkamak için bir cam pipet kullanın. Heptane bandı çözülür ve embriyolar yayınlayacak. Tüm embriyolar slayt kaldırılana kadar çalkalamaya devam edin. Tüm embriyolar slaytlar kaldırılana kadar, bir sonraki slayta geçin. </li><li> 20 ml&#39;lik bir bilim içine cam çanak heptan çözeltisi artı embriyo transferntillation flakon. 2-3 dakika boyunca çalkalayınız, heptan kaldırmak ve taze heptan 5 ml ekleyin. </li><li> Taze, fiksasyon solüsyonu 5 ml ekleyin (tarifi için reaktifler listesine bakınız). Kapatılır ve orbital çalkalama platformunda ekleyin. 220-230 rpm&#39;de 25 dakika boyunca embriyoları içeren şişe çalkalayın. </li><li> Çalkalanmış, arayüz pop da kabarcıklar sağlar. Tamamen embriyolar çekerek kaçınarak, bir pipet ile alt, sulu faz kaldırın. Alt tabaka, sabitleme çözeltisi oluşmaktadır ve uygun şekilde atılmalıdır. </li><li> , Metanol 5 ml ekleyin, şişeyi kap ve 20-30 sn, girdap için elle kuvvetlice çalkalanır ve tezgah üzerine yerleştirin. Yaralı embriyolar interfaz kalacak ve dibe batar olmayacaktır. Notlar: Tespit edildikten sonra bir yaralı olmayan embriyo vitellin zar normal olarak metanol ile dehidrasyon aşaması esnasında patlar. Ancak, yaralı embriyo vitellin zar zaten kırılmış ve dehidratasyon adım vitellin memb kaldırmazrane. El devitellinzation tespit protokolü tamamlamak için gereklidir. </li><li> Dikkatli bir şekilde üst heptan tabakayı kaldırmak ve sonra taze metanol 5 ml ekleyin. Şişeyi çalkalayın ve embriyolar lavabo olmalıdır. </li><li> Bir cam aktarım pipet ile metanol artı embriyo çözüm çıkarın ve bir cam tabak içinde, naylon örgü toplama tüpü içinde toplar. </li><li> Metanol çıkarın ve 1x PBS çözeltisi ile embriyolar yıkayın. </li><li> Bir elma suyu plaka için naylon mesh embriyolar transfer. Levhanın yüzeyi boyunca embriyolar yayıldı. </li><li> Bir çift sopa bant cam slayt embriyolar transfer. 1x PBS ile embriyolar örtün. Notlar: Embriyolar nedeniyle vitellin membran gelme eğilimindedir. Bir elma suyu kullanarak yer topaklaşmış embriyoların hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. Kuvvet embriyo kaldırmak için uygulandığı zaman embriyolar agar plakası gömülmek için embriyolar, levhadan kaldırılır ve bir çift çubuk bant cam slayt aktarılmalıdırvitellin membran. </li><li> Dikkatle vitellin membran &quot;pop&quot; bir diseksiyon iğne ile embriyolar itin. Embriyo PBS içinde lavabo olmalıdır. </li><li> Bir 1.5 ml tüp 1x PBS ve embriyo transferi için bir cam pipet kullanın. 4 ° C&#39;de 1x PBS ve mağaza ile embriyolar durulayın PBS serisi ve in situ hibridizasyon veya bağışık protokolü 14 devam: Bir Etanol kullanılarak embriyolar kurutmak geçin. </li></ol>

<ol>
	<li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA.">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li><li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila.">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head.">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li><li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice.">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li><li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila.">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li><li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair.">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li><li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes.">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duox,+Flotillin-2,+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila.">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster.">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12:12+of+Drosophila+melanogaster.">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li><li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase.">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li><li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology.">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Drosophila+transgenic+reporters:+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP.">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Casso, D., Ram&#237;rez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li><li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila.">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773 (2013).</li><li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations.">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Repiso, A., Berganti&#241;os, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs.">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li><li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs.">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dış işaretlere acil transkripsiyonel düzenleyici tepki hücreleri stres, hasar veya enfeksiyonu içerebilir dışı uyaranlara lokalize bir yanıtı koordine sağlar. Yerelleştirilmiş bir yanıtın uygun olmayan kontrol hasarı onarmak için zarar komşu hücreler üzerindeki etkilerinin yanı sıra, ziyan edilmiş bir kaynak olabilir. Drosophila embriyo, ucuz ve kolay muhafaza model organizma temel yara iyileştirici deneyler için mükemmel bir sistem sağlar. Diğer model organizmalar araştırma ve Drosophila işbirlikleri için potansiyel pek çok biyolojik soruları keşfetmek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Yara muhabir ek bir teknik epidermal yara tepki yolunun aktivasyonuna, yeni genlerin katkısı test etmek için etkili bir yöntem sağlamaktadır, mutant arka genetik kombinasyonudur. Biz, epidermal yara kaynaklı transkripsiyonel raportörler, av var2 nci ve 3 üncü kromozom 5 hem AILABLE. Bu çalışmada biz UAS ve aşırı ekspresyonunun 16 GAL4 sistemlerini kullanabilirsiniz. Ölümcül mutant allelleri ile çalışmalar için biz bir floresan dengeleyici kromozomu, örneğin Kruppel-GFP 17 kullanılarak genetik arka plan belirler. Biz birkaç genetik geçmişleri (Tablo 1) de yara muhabir yerelleştirme analiz ettik. Tekniğin muhtemel modifikasyon mikroenjeksiyon ve yaralama birleştirmektir. Mikroenjeksiyon embriyo bir kimyasal solüsyon tanıtmak için kullanılabilir. Birçok kimyasal bileşikler test edilmiş ve epidermal yara muhabir 9 aktivitesini düzenleyen bulunmuştur. Eş zamanlı yaralanmalar ve mikroenjeksiyon Bu yöntem, bir yara sinyal yanıt ve doğrudan 18 yaralama sonra gen ekspresyonu değişiklikleri izlemek için kullanılabilir Drosophila embriyo hücrelerinin sayısını arttırmak için yararlı olabilir. Mikroenjeksiyon tekniğin bir yönelik uygulama epidermal yara cevabının düzenlenmesi için yeni bir kimyasal test etmek olacaktır. Genetik çalışmalar için bir model sistemi olarak Drosophila verimli bir şekilde karmaşık soruları için basit protokoller geniş bir yelpazede sunuyor. Drosophila tekniklerinin fizibilitesi ile ilgili son raporlar daha Drosophila araştırma topluluğunun etkisini genişletmek için bir araç olarak hemocyte göç 19 ve parazitik yabanarısı enfeksiyon 20 kullanımını vurgulamaktadır. Yara onarım çalışmalarına ek olarak, Drosophila hayali disk sistemi 21,22 ile yenilenme için bir klasik model sağlar. Hayali disk rejenerasyon çalışmaları ve delinme / mikroenjeksiyon yaralanmasıyla kombine gelişmeler doku onarımının iyi korunmuş bileşenleri keşfetmek için mükemmel bir sistem sağlar.

Mikroenjeksiyon tekniği kullanarak Drosophila embriyolar Manipülasyon köklü bir tahlil 1&#39;dir. Epidermal yara yanıt raportör yöntemin önemi floresan muhabir delinmeye / mikroenjeksiyon için protokol birleştirmek ve Drosophila embriyolarda epidermal yaralanma için bir in vivo yanıt görselleştirmek için. Bu yöntemin amacı, epidermal lastik yaralanmaya transkripsiyon yanıtı düzenleyen işlemleri incelemek üzere bir araç olarak kullanmak için Drosophila bilim adamları, daha geniş bir dizi sağlamaktır. Drosophila tek katmanlı epidermis bir delinme yaralanma 2 sonra epidermal yara tepkisini incelemek için basit bir sistem sağlar. Drosophila embriyo genetik yara tepki, enflamasyon ve reepithelialization 3 de dahil olmak üzere, yara iyileşmesi aşamalarını incelemek için sağlam bir model sistem. Çok ya da çoğu zigotik mutantlar embryogenes sonuna kadar hayatta kalmak için bu kısmında bulunanve gelişimsel desenlendirme derinden ters gittiği zaman bile epidermal engelleri gelişir. GRH-hedef genler dopa dekarboksilaz (DDC) ve tirozin hidroksilaz (ple) transkripsiyonel yaralanma 4&#39;ün siteleri etrafında aktif olduğu. Tanımlanan, iyi korunmuş bir transkripsiyon faktörü Grenli kafası (GRH) Önceki karakterizasyonu Drosophila yara tepki için bir model organizma olarak memeli yara iyileşmesinde 5 çalışmalarını ilerletmek için soruşturma tamamlayıcı bir çizgi sunuyor. Daha sonraki çalışmalar, ek Drosophila yara kaynaklı gen belirlendi ve 6 yaralama temizlemek için in vivo epidermal yara yanıtını izlemek için birçok floresan yara gazetecilere bir &quot;araç kiti&quot; geliştirdik. Drosophila yara iyileşmesi düzenleme üzerinde son raporlar, hücre göçü 7,8 düzenleyen birçok yolların keşfini sağlayan, yara kapama fenotip odaklanmıştır. Analizi ilefloresan yara haberciler, çalışmalarımız epidermal yara uyarımlı gen 9&#39;un lokalize ekspresyonu için gerekli olan genlerin yeni bir dizi belirledik. Yara yanıt raportör yönteminin esası bir sonuçları sinyalleri, komşu hücrelere yaralanma sitesinden transduse nasıl bir mekanizma daha fazla bilgi sağlar olmasıdır. Ancak, yara yanıt raportör yöntemin dezavantajları biri sonuçları doğrudan yara iyileşmesi veya tamir fenotiplere bağlantı kalmamasıdır. Genetik ve kimyasal ekranlarında temiz yara delinme protokolünün daha geniş kullanımı transkripsiyonel yanıt yeni düzenleyiciler tespit edilmesi yaralama epidermal ve yaralanma tedavileri memeli modelleri içine yara iyileştirici keşifler çeviri ilerletmek için izin verecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

Drosophila embriyo her iki sert bir dış ortamdan iç hücreleri korumak için hem de hücre homeostazının muhafaza edilmesi işlevini güçlü bir epidermal tabaka geliştirir. Cam iğne ile delinmesi yaralanma canlı embriyolar veya larva lokalize bir raportör sinyali ile görselleştirilebilir yara transkripsiyonel raportörler, aktive hızlı bir epidermal yara yanıt tetiklemek için doğrudan bir yöntem sağlar. Delinme veya lazer zedelenmesi aynı zamanda yara bölgesine hemocytes alımı teşvik sinyalleri sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, geç dönem embriyo ağır (baştan sona) ponksiyon hasarı, sadece nadiren bu yaralı embriyoların% 90 daha embriyolar delinme sitelerinden hemolimf hemen sızıntısını en aza indiren, bir yağ ortamı içinde enjekte edildiği zaman yetişkinliğe hayatta olduğu gibi, normal embriyonik gelişme bozar . Yara prosedür ag üzerinde embriyo manuel ayarlama dahil olmak üzere Drosophila embriyoların Mikromanipülasyondan, gerektirirar plakaları ve slaytları mikroskop hizalanmış embriyoların transferi. Drosophila epidermal yara tepki deney yara iyileşmesini yanı sıra, yara iyileşmesini teşvik potansiyel kimyasal bileşiklerin taranması için bir yöntem geliştirmek biyolojik fonksiyonları çeşitli genetik gereksinimlerini test etmek için hızlı bir sistem sağlar. Kısa yaşam döngüsü ve kolay bir kültür rutin Drosophila güçlü bir model organizma olun. Drosophila temiz yara iyileşmesi düzenleyici korunmuş bulmak için mükemmel bir sistem sağlar soruşturma kapsamında halen şekillerde, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ile, epidermal rejeneratif yanıtı koordine görünüyor Drosophila ve memeli epidermal yaralama ortak mekanizmaları.

Bu yöntemde de gösterilen sonuçlar elde etmek için, yeşil floresan proteini (GFP) ve açık okuma çerçevesi dopa dekarboksilaz (DDC) ve DsRed (tirosin hidroksilaz Bir yara arttırıcı sekansına kaynaştırıldığı bir yükseltici / arttırıcı yara kaynaklı sekansına kaynaştırılır ple) 4,6. Canlı bir Drosophila embriyo olarak, floresan yara raportör proteininin uygun olgunlaşma 4-6 yeterli protein birikimi görselleştirmek için zaman sağlar: yaralama sonra saat, hem de floresan durumuna 15 oksitlemek için flüoresan protein için zamanı. Muhabir yerelleştirme gözlemlemek için, bir bileşik floresan mikroskop yeterlidir. Raportör lokalizasyonu daha yüksek bir büyütme gözlemlemek için, konfokal mikroskop birden fazla optik bölme maksimum çıkıntı (Şekil 1) oluşturmak için en uygunudur. Drosophila embriyoların in vivo görüntüleme konfokal ra karmaşıklaşırEmbriyonun pid düzensizlikleri. . Embriyonun tam bir görüş 20X objektif ile elde edilebilir ve yara yerinin bir close-up görünümü 40X amacı ile elde edilebilir. Epidermal yara muhabiri lokalizasyonu bir üst-bakış 10 ardışık 1 Pm&#39;lik optik bölümleri ile görüntülü olabilir. Epidermal yara muhabiri lokalizasyonu lateral-view 40 ardışık 1 mikron optik bölümleri ile görüntülü olabilir. Standart genetik geçiş yöntemleri kullanılarak, genetik mutasyonlar ile yara gazetecilere birleştirmek mümkündür. Bu çalışmada sunulan bir örnek flotillin-2 (Flo-2), çünkü (P-element ekleme ile oluşturulan boş alel) zarar işleve ve kazanç fonksiyon-(tüm hücrelerde her yerde ifade ile üretilir fazla ifade) mutanları flo-2 Flo-2 gen ürünü gazetecilere 9 yara DDC-GFP lokalizasyonunu inhibe etmek için gerekli ve yeterli olduğunu göstermektedir (Şekil 2A ve 2B). MI kullanmacroinjection protokol, kimyasal çözeltiler superactivates tanıtımı veya yara gazetecilere lokalizasyonu inhibe olmadığını test etmek mümkündür. Kimyasal-yaralanmış embriyolar, aynı zamanda yaralı ve% 1 toluidin mavisi ve çözündürülmüş bileşiklerin bir 1:4 oranında enjekte edilmiştir. Toluidin mavisi boya vücut boşluğu içine enjekte edilen çözündürülmüş bileşiklerin görsel doğrulanması için izin verdi. Kontrol embriyolar kimyasal olmadan% 1 toluidin mavi boya ve çözünen 1:4 oranını içeren bir kırık iğne ile yaralandı. Bu çalışmada sunulan iki örnek hidrojen peroksit (H 2 O 2) ve metil-β-siklodekstrin (MβCD), hem de kimyasal çözümler küresel Ddc-GFP lokalizasyonu gazetecilere yara aktifleştirmek için yeterli çünkü 9 (Şekil 2C ve 2D) . Hidrojen peroksit (H 2 O 2) H içerisinde seyreltildi 2 O M. metil-β-siklodekstrin (MβCD) 0.6 1 m içinde solubilize edildiM NaOH 3 mm. Embriyo tespit protokolü kullanılarak, bir yara alanını çevreleyen, bir lokalize etki yara tepki genlerinin transkripsiyon aktivasyonunu tespit etmek mümkündür. Bu çalışmada sunulan bir örnek, ddC ve ple transkript 4,6,9 (Şekiller 3A ve 3B) tespit etmek için RNA sondalarının in situ hibridizasyon bulunmaktadır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. DDC-GFP ve ple-DsRed (B). (A) Ddc-GFP yara muhabiri Top-görünümü. Yaralı vahşi tip embriyolar muhabiri yerelleştirme. Aydınlık ve floresan görüntüleri yara ple-DsRed Top-görünümü muhabiri yara. Tüm görüntüler 20X amacı ile, bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde toplanmıştır. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panelinde Kesik çizgilers embriyoların ana hatlarını işaretlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2. Genetik mutant geçmişleri ve kimyasal mikroenjeke embriyoları. Aydınlık ve yaralı flotillin-2 (Flo-2) mutant embriyo floresan görüntüler de Ddc-GFP muhabiri yara lokalizasyonu. (A) Kayıp fonksiyon-Flo-2 {} KG00210 mutantlar, Tüm epidermal hücreleri boyunca raportör etkinliğinin genişlemesi. (B) Kazanç fonksiyon-Flo-2-(armadillo-GAL4, UAS-Flo2) mutantları, her epidermal hücreleri boyunca raportör etkinliğinin engellenmesi. (C) hidrojen peroksit (2 H O 2 ) çözeltisi mikroenjeksiyon, rep genişlemesiÖrter aktivitesi tüm epidermal hücreleri boyunca. (D) Metil-β-siklodekstrin (MβCD) çözeltisi mikro enjeksiyon, epidermal hücreleri boyunca her raportör etkinliğinin genişlemesi. Tüm görüntüler 20X amacı ile, bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde toplanmıştır. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panellerde kesik çizgiler embriyoların ana hatlarını işaretlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Şekil 3,. Yara tepki gen RNA transkriptlerinin saptanması. Yaralı vahşi tip embriyoların in situ hibridizasyon ve RNA tespiti floresan ve görüntüler. Ddc (A) ve ple (B) RNA transkriptleri yara etrafında birikir. Tüm görüntüler toplama vardı20X amacı ile bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde ted. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panellerde kesik çizgiler embriyoların ana hatlarını işaretlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Tablo 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tablo 1. Epidermal yara tepki gazetecilere özeti. Dört yara tepki gazetecilere (Ddc, ple, msn, KKV) ve Eklemeler hem ikinci ve üçüncü kromozom mevcuttur. Yara tepki habercilerin tüm yabani tip arka (örneğin, &quot;lokal&quot; fenotip) in lastik yaralanma alanını çevreleyen epidermal hücrelerin sınırlı sayıda floresan gen (GFP veya DsRed) aktive eder. Ddc msn ve yara tepki muhabir için gerekli GRH FLORESAN aktivasyonudelinme yaralanma (örneğin, &quot;none&quot; fenotip) sonra ce gen. Yara gazetecilere tüm delinme yaralanma (örneğin &quot;küresel&quot; fenotip) sonra floresan genin lokalizasyonu için Flo-2 gerektirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.3K Görüntüleme.  The City College of New York.  Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir. 

Video: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Biyomühendislik

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

Kantitatif, Deri Yara Yönetimi için bir konformal Cilt benzeri elektronik Sistemi İmalat ve Karakterizasyonu

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...