Bu iş için finansman Amerikan Kalp Derneği (16SDG29870005) ve North Carolina Devlet Üniversitesi Araştırma ve yenilik tohum finansman ile sağlandı.

1. gün 1: hücre ve reaktif hazırlık Not: tüm hücre ve reaktif hazırlık biyolojik Emanet örneklerinin kontaminasyonu önlemek için kabine gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Sıcak filtre Dulbecco &#39; s modifiye kartal &#39; s orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS), L-glutamine ve penisilin/streptomisin 37 ° C su banyosunda.</li>
	<li>Hazırlama yenidoğan insan dermal fibroblast (HDFn) medya ilave tarafından ısıttı DMEM %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve % 1'l-glutamin.</li>
	<li>Donmuş HDFns ve 200 x g de 8 dk santrifüj dondurma orta kaldırmak için bir şişe çözülme. 1 x 10 6 hücre/mL ve tohum yoğunluğu bir T-75 kültür şişesi içine de hazır HDFn medya hücrelerde resuspend.</li>
	<li>(37 ° C, % 5 CO 2) hücre çoğalması izin vermek için bir kuluçka yer şişeye.</li>
	<li>Mağaza HDFn medya 4 ° C.</li>
	<li>Yanlısı ve anti migratory reaktifler gerektiği gibi hazırlayın.</li>
</ol> 2. 3. gün: Küresel hazırlık <ol><li>bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek.</li>
	Hücrelerin % 80 confluency, geldiğinizde <li>Aspire medya ve % 0.25 5 mL ekleyin tripsin-EDTA. 37 ° C kuluçka tam hücreleri şişesi yüzeyinden ayırmak 5 min için mağaza flask.</li>
	<li>5 mL ılık medya tripsin nötralize etmek için şişe ekleyin.</li>
	<li>Bir microcentrifuge tüp mix 10 μL Trypan mavi ve hücre süspansiyon 10 μL.</li>
	<li>Santrifüj orijinal hücre süspansiyon için 200 x g., 8 dk</li>
	<li>Hücre süspansiyon centrifuged iken, bir hemasitometre için Trypan mavi hücre süspansiyon 10 μL ekleyin ve bir hücre sayısı gerçekleştirmek.</li>
	<li>Hücre Pelet kekii olmadan Santrifüjü, medya Aspire edin. 1,25 10 5 hücre/mL x konsantrasyon, hücre Pelet resuspend.</li>
	<li>5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) altına 10 cm küresel büyüme sırasında sulu bir ortam sağlamak için Petri kabına ekleyin.</li>
	<li>Petri kabına kapağını tersine çevirin. Hücre süspansiyon Petri kabına kapak iç yüzeyinin çeşitli 20 μL damla ekleyin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde kapağı tekrar ters çevir ve çanak asılı damla çıkarmak değil dikkatli olmak, altta geri yerleştirin. şekil 1 gösterir başarıyla kurulan asılı damla.</li>
	<li>Dikkatli bir 37 ° C kuluçka makinesine çanak yerleştirin ve pulcuklarının asılı bir büyümeye izin bırakın kültür 72 h. bir süre için</li>
</ol> 3. 6. gün: Pulcuklarının 3D matris gömme <ol><li>bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek.</li>
	İlk fibrin tabaka oluşumu yaratmak için pıhtı çözüm çok sayıda wells için iyi başına 100 μL eklemek için yeterli hacim bir pıhtı çözüm <li>(iyi başına 1 küresel) gerekli. Pıhtı yüzde 10'u 10 X HEPES tampon hacmi (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl 2, pH 7,4), 2 mg/mL insan fibrinojen ve 0.1 U/mL insan Alfa Trombin tarafından oluşmaktadır. Pıhtı birimin geri kalanını ultrasaf su oluşmaktadır.
	<ol><li>Ekle Trombin son ve hızlı bir şekilde çözüm eklemek istediğiniz wells bir 48-şey plaka için kuyu için eklendi önce polymerizing pıhtıları önlemek için.</li>
	</ol></li> <li>Yavaşça shake/fibrin pıhtısı karışımı de tüm kaplama emin olmak için iyi plaka dokunun ve sonra alt pıhtı tabaka polimerize izin vermek 1 h için kuluçka iyi plaka yer. İyi plaka kabarcık oluşumu ikna etmek zor sallama; Sadece rock plaka kuyu tamamı kaplanır kadar gerektiği gibi. Daha büyük pıhtı birimleri kullandıysanız, bu adım gerekli olmayabilir.</li>
	<li>Fibrin katmana aktarmak pulcuklarının.
	<ol><li>Kaldır iyi plaka ve Petri kabına pulcuklarının asılı içinde içeren kültür kuluçka makinesi bırakın ve pulcuklarının mikroskop altında incelemek. Kültür kapağın çanak yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde erişime izin vermek için Petri kabına kapağını ters çevir'i kültürler için asılı bırakın.</li>
		<li>1 mL şırınga için bağlı 21 G iğne kullanarak dikkatli bir kuyunun kaplama polimerli fibrin tabaka delmek değil dikkat çekici damla ters kapağını her şey, merkezi haline gelen transfer. Etkili bir şekilde açılan aktarmak için yavaş yavaş açılan iğne çek. En kısa zamanda tüm açılan içinde iğne döndü pistonu çekmeyi bırak; damla çok ileri geri çekerek etkili küresel transferi veya sonraki görüntüleme bozabilir hava kabarcıkları tanıtmak.</li>
		<li>İyi plaka pulcuklarının düzgün istenen tüm kuyu transfer var emin olmak için mikroskop altında incelemek.</li>
	</ol></li> <li>İkinci fibrin tabaka oluşumu için yukarıdaki gibi ilk fibrin tabaka (Adım 3.2) oluşturulması için aynı hazırlık kullanarak başka bir pıhtı çözüm oluşturun. Dikkatle her küresel içeren açılan üzerine 100 μL pipet ve tekrar pulcuklarının hala tek parça ve kuyular kenarlarına itti değil emin olmak için mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Kuluçka makinesi iyi plakasına dönmek ve ikinci katman için 1 h. polimerize izin</li>
</ol> 4. 6. gün: Pro-göçmen veya inhibitör faktörleri eklenmesi <ol><li>sıcak HDFn medya 37 ° c</li>
	<li>Bir hood kontaminasyonu önlemek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Uygun konsantrasyonlarda değerlendirilmek üzere pro/anti-migratory ajanları dahil olmak üzere her grubu için ortam hazırlamak.</li>
	<li>Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür kukuIeta yerde iyi plaka kaldırmak.</li>
	<li>Ekle 500 μL standart medya denetim küresel grubunun her şey için 500 μL geçiş inhibe küresel grubunun her şey için inhibitör medya ve geçiş gelişmiş küresel grubunun her şey için pro-göçmen medya 500 μL.</li>
	<li>İyi plaka da kuluçka için iade.</li>
	<li>Değişim medya her 48 h.</li>
</ol> 5. Gün 6-9: hücre göç değerlendirme ve nükleer silahların yayılmasına karşı <ol><li>görüntü pulcuklarının aydınlık alan mikroskobu hemen medya (0 h) ve sonra her 24 h eklenmesinden sonra 72 h. isteğe bağlı kullanarak: her zaman noktası, z-yığın görüntü almak olup olmadığını belirlemek amacıyla geçiş odak birincil alan dışında uçaklarda meydana gelen. Deneyimlerimize göre bu oluşmaz; Ancak, bu her deneme durumda olduğundan emin olmak yararlıdır.</li>
	<li>Kullanım için her küresel alanda yüzde artış her küresel her her başarılı zaman noktasında için hücre kenarlığı izleme ve kullanarak analiz ederek hücre yapılan her iyi belirlemek için ImageJ &#34; ölçü &#34; alanı elde etmek için işlev.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
<li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619(2015).</li>
<li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+Lead+the+Way%3A+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li>
<li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-00534-3_12">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2221-3759/2/4/198">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li>
<li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+collagen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li>
<li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li>
<li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+signaling+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+REs+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li>
<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
<li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin-based+biomaterials%3A+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li>
<li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem%2Fprecursor+cells+%28MSCs%29+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).</li>
<li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yara iyileşmesinde hücre göç incelenmesi ECMs bir vitro 3D modeli ile ilişkili bu iletişim kuralı sağlar. Çok önemli bir adım olarak uygun yordam yürütülmesini fibroblast pulcuklarının uygun gelişmedir; hücre toplama hazırlık sırasında 2.500 hücreler/damla, ilk bir konsantrasyon vermek için optimize edilmiş pulcuklarının formu için güvenilir bir 72 h kuluçka döneminde izin. Hücreleri yetersiz sayıda kullandıysanız, pulcuklarının etkili toplamak değil ve transfer ve fibrin ka...

Yara iyileşmesi yaralanma takip doku bütünlüğü restorasyon sonuçları karmaşık bir süreçtir. Bu işlem içine hemostazın, inflamasyon, yayılması ve remodeling, tarafından çevrelenmiş dört örtüşen aşamaları olan her düzenlenmektedir çözünür cues, hücre-matris etkileşimleri ve hücre-hücre iletişim karmaşık bir kombinasyonu tarafından bozuldu. 1 , 2 bu cues orkestrasyon hücresel yanıt-e doğru dahil, önemlisi, hücre göç yara iyileşmesinde çok sayıda kontrol eder. 3 , 4 hücre geçiş bağımlı hücresel fenotipleri ve hücre dışı matriks ortamın Biyokimya ve biyofizik özelliklerini üzerinde son derece dinamik bir süreç değil. 5 hücreler sürekli hücre dışı matriks çevreleri integrin aracılı yollar aracılığıyla araştırma; Bu süreci hücreleri matris özellikleri topografya, sertlik ve hapsi de dahil olmak üzere geniş bir anlamda verir. İki boyutlu (2D) analizi hücre göç göç öncü aktin filaman demetleri nesil aracılığıyla, lamellipodia formasyonu tarafından tahrik edilmektedir gösterir. Öncü kasılma ve retraksiyon firar kenarında tahrik actomyosin ile birlikte, odak yapışıklıklar sonraki oluşumunu hücrenin ileri sürüyor. 6 boyutlu üç (3D) hücresel geçiş şu anda iyi anlaşılamamıştır, ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda 3D geçiş daha belirgin farklı olduğunu ispat yukarıda adı geçen mekanizması 2D açıklanan ve büyük olasılıkla değiştirici mekanizma ile tahrik edilmektedir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda Petrie ve arktarafından. ECM özelliklerine bağlı olarak, 3D Matris hücrelerinde lamellipodium geçiş mekanizmalarının tahrik lobopodium arasında geçiş yapabilirsiniz, gösterdi. 7 hücre geçiş yanıt şifa yara, kritik bir bileşeni olduğundan hücre göç 3D modelleri yara iyileşmesi sırasında çeşitli uyaranlara fizyolojik yanıtlarını anlamak için kritik önem taşımaktadır. 2D yüzeylerde hücre göç davranışı büyük ölçüde göç 3D matrisler farklı olduğu gösterilmiştir, ancak en güncel vitro modelleri hücre göç sırasında köklü sıfırdan tahlil dahil olmak üzere işlem, şifa yara 2D kullanmak monolayer kültürler. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 deneyleri daha son zamanlarda geliştirilen 3D matris kullanılan, ama hala böylece yeteneği gerçekten hücre çevre three-dimensionality özetlemek için sınırlama monolayer matrix, üstüne hücrelerde kültür içinde vivo. 15
Burada açıklanan yöntemin amacı ile uygulanan uyaranlara ilişkili geçiş yanıt daha sağlam bir anlayış kazanmak için hücre göç fizyolojik ilgili bir 3D modeli yerine bir 2D yüzey incelemektir. Bu yöntem, hücre geçiş etkinleştirmek veya hücre geçiş ile ilişkili yollar engelleyen faktörleri varlığında bir 3D fibrin pıhtısı matris içinde değerlendirilmesi için sağlar. Fibrin matris nedeniyle kritik rol fibrin yara iyileşmesi erken aşamalarında, bu yöntem için seçildi; Aşağıdaki yaralanma, fibrin pıhtısı yara ortamlar içinde kan kaybı kök oluşturduğu ve ilk hücre infiltrasyonu sırasında doku onarım ve tadilat için bir iskele olarak hizmet vermektedir. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 Ayrıca, fibrin cerrahi bir mastik olarak klinik olarak kullanılır ve Mastikler bileşimi hücre göç ve nihai sonuçları şifa için bağlı olmuştur. Cox ve arktarafından önceki bir çalışma. fibroblast geçiş değişen fibrin ve fibrin dolgu macunu en iyi duruma getirme amacıyla Trombin konsantrasyonları oluşan fibrin pıhtısı ile araştırıldı. Bu çalışmalarda, plastik yemekleri üzerine fibrin pıhtısı hücreleri geçirilmesi sayısal. 20 burada miktar göç 3D fibrin ortamı içindeki hücreleri için izin veren bir yöntem mevcut. Bu protokol için özel olarak açıklanan yöntemi fibrin kullanırken, bu model alternatif matris malzeme kullanmak istediğiniz gibi kollajen veya diğer 3B matrisleri gibi için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, biz fibroblast geçiş yara yatağına büyük önem hücre dışı matriks sentezi ve doku onarım/tadilat olduğundan bu tahlil fibroblast pulcuklarının kullanımı mevcut. Ancak, onarım sırasında süreç nötrofiller makrofajlar tarafından takip yara yatağa geçirmek için ilk hücre tipi vardır. Fibroblastlar sonra yaklaşık 48 saat sonra ilk yaralanma, yara iyileşme süreci proliferatif faz başında yara ortamı sızmaya başlar. 19 bu tahlil kolayca nötrofil, makrofajlar veya fibrin pıhtısı yapısındaki değişiklikler geçiş bu hücre tiplerinin nasıl etkiler değerlendirmek için diğer hücre tipleri eklemek için değiştirilmiş olabilir. 21
Bu tahlil uygulamak için ilk olarak, fibroblast küresel bir değişiklik kök hücre kültürü için daha önce açıklanan teknikleri kullanarak oluşturulur. 22 fibroblast küresel daha sonra 3D fibrin matris aktarılır ve sonucu sonra kolayca izlenebilir ve birkaç gün içinde sayılabilir. Bu iletişim kuralı dikkate fizyolojik sistemleri 3D 3D cep pulcuklarının fibrin matris içinde katıştırma tarafından alır böylece sınırlamaları hakkında getirdiği bir 2D büyüme yüzeyi ile bir hücre monolayer model göç davranışı için kullanarak alaka içinde kaçınarak, süre hala hücre davranışı son derece kontrollü vitro ortamda değerlendirilmesi için izin.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Materials&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM already containing L-glutamine can also be used</td></tr><tr><td>100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Dishes of any size can be used for hanging drop culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Can be replaced with other cell type of interest</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2&#039; needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Syringes of any volume can be used</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td><td>VWR</td><td>82051-004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Can be replaced with matrix protein of interest</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>May not be necessary depending on matrix protein of interest</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 cell culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with 10X objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

Şu anda, en vitro model, iyileşmesi gibi köklü sıfırdan deneyleri, hücre göç ve yara kapatma iki boyutlu yüzeyler eğitim içerir. Ancak, yer alır şifa hangi vivo içinde yara fizyolojik ortamında üç boyutlu tercihan--dan iki boyutlu. Hücre davranışı büyük ölçüde olarak farklı olduğunu giderek daha açık hale geliyor iki boyutlu ve üç boyutlu ortamlarda; Bu nedenle, yara kapatma hücre geçiş davranışları eğitim için daha fizyolojik ilgili vitro modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan yöntemi daha iyi daha önce kurulan iki boyutlu sıfırdan deneyleri fizyolojik şartlarda yansıtan bir üç boyutlu model hücre göç çalışmanın olanak sağlar. Hücre akıbet hücre göç pro veya anti migratory faktörlerin varlığında fibrin matris içinde gömülü bir küresel gövdesinden çekin incelenmesi yoluyla değerlendirmek için bu model amacı budur. Bu yöntemi kullanarak, hücre yapılan üç boyutlu bir matris küresel vücuttan gözlenen ve aydınlık alan mikroskobu ve küresel gövde alanı analizi ile zaman içinde kolayca ölçülebilir. Pro-göçmen ve/veya inhibitör faktörleri etkisi hücre göç de bu sistem içinde değerlendirilebilir. Bu yöntem araştırmacılar hücre göç ilişkili üç boyutlu yara matrisler vitroanaliz basit bir yöntem sağlar, böylece artan alaka içinde in vitro hücre önceden in vivo hayvan kullanımı için çalışmalar modelleri.

Küresel kültür başarıyla fibroblast geçiş tüp bebek yanlısı ve anti-göçmen aracıları etkisini değerlendirmek için kullanılması gereken 3D fibroblast pulcuklarının açılan kültür 72 h (şekil 1) bir süre içinde asılı yolu ile oluşturulabilir. Kültür dönemi pulcuklarının pıhtı matris içinde gömülü ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) kullanarak yansıma. (Resimde beyaz ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments at JoVE.com

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K Görüntüleme.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

Video: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Kanser Araştırmaları

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 oyuklu bir plaka içerisinde hücre gücü / yara iyileşme gerçekleştirmek için bir cihaz

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Biyomühendislik

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Tıp

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biyoloji

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Granül Hidrojel Biyomalzemeler İçinde ve İçine Üç Boyutlu Hücre Migrasyonunun Ölçülmesi

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...