Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Heping Cheng, onların yararlı yorumlarından ve bu yöntemi geliştirerek teknik destek için Huiliang Zhang ve Stephen Kolwicz. Bu çalışma NIH hibe ve Amerikan Kalp Derneği WW Scientist Kalkınma Grant tarafından desteklenmiştir.

1.. Deney Hazırlama <ol><li> 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, in vivo görüntüleme için iskelet kası (pH 7.2) ihtiva eden izotonik bir dengelenmiş tuz çözeltisi (50 ml) hazırlayın. </li><li> 118 mM NaCI, 5.3 mM KCI, 1.2 mM MgSO 4, 0.5 mM EDTA ve 25 mM NaHCO 3: içeren Krebs-Henseleit tamponu (KHB) 1 L hazırlayın. </li><li> Kabarcık gaz ihtiva eden% 95 O 5/2 önceden 2 mM CaCl2 eklenmesinden 10-15 dakika boyunca% CO2 ile KHB. Metabolik substratlar (örn., 10 mM glükoz ve 0.5 mM piruvat) eklenir. </li><li> % 70 etanol içinde kelepçe, makas ve forseps sterilize edilmesi ve daha sonra steril GKD 2 O. durulama ile cerrahi aletler hazırlanması </li><li> , Kalp perfüzyon sistemine açın su banyosu ve sirkülasyon üzerinde sıcaklığını ayarlamak, 6 ml / dak peristaltik pompanın hızını ayarlamak. </li><li> % 95 O 2 ile kabarcık KHB/% 5 CO2 gaz ve çıkış maddesi akış oranı ve (a fiber optik sıcaklık probu ile 37 ° C,) sıcaklığını izlemek. Sistem, gaz ve ısı dengelenmesi için yaklaşık 20 dakika gerektirir. </li></ol> 2. In Vivo İskelet Kaslar konfokal Görüntüleme <ol><li> Pentobarbital (80 mg / kg, ip) ile fare anestezisi. Hayvan, 10-15 dakika içinde cerrahi anestezi (ayak tutam hiçbir yanıt) ulaşmak ve iskelet kaslarının in vivo görüntüleme için yeterli 1-1.5 saat, bu durum kalır. </li><li> Arka ayaklarında biri tüyleri ve% 70 etanol ile cilt sterilize. </li><li> Gastroknemius kasları ortaya çıkarmak için kolun dış kenarı boyunca deride bir kesi olun. </li><li> Keskin bir forseps ile yavaşça epimysium pick up ve makas ile ile bir kesi yapmak. Dahası epimysium kaldırmak ve onun altındaki kas lifleri maruz teşrih. </li><li> Iskelet içine TMRM bölgesinin in vivo olarak yüklenmesi içinkas, 30 dakika boyunca kas sokmak ve daha sonra gösterge içermeyen çözeltisi ile yıkamak için izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde TMRM (500 nM) içerir. </li><li> Konfokal mikroskop (Zeiss LSM 510) aşaması ile ilgili yan fare koyun ve açıkta kalan iskelet kası, odacığın alt kısmını oluşturan lamel karşı karşıya olan bir pozisyonda, arka uzuv kısıtlamaktadır. Lamel kas dokusu ve ters objektif (40X yağ) arasında yer almaktadır. </li><li> Doku ve lamel arasında sıkı bir temas sağlamak için hafifçe aşağı bacak basın. Izotonik dengeli tuz çözeltisi içinde açıkta kalan kaslar bırakın. </li><li> Kare başına bir saniye bir örnekleme hızında kayıt iki boyutlu (2B, xy) konfokal görüntüler. Her pikselin şiddeti 8-bit derinliği dijitalize edilir. Genellikle, bir seri tarama 100 kare içerir. </li><li> &gt; 505 nm de ilk 405 nm&#39;de heyecanlı ve toplayarak ardışık görüntüleri toplayın sonra 488 nm&#39;de çift dalgaboyu excitatio için&gt; 505 nm toplanırkenmt-cpYFP n görüntüleme. Mt-cpYFP ve TMRM üçlü dalga boyu uyarım görüntüleme için, sırasıyla 405, 488 ve 543 nm sıralı uyarma kullanın, ve, 505-545 de 505-545 emisyon toplamak, ve&gt; 560 nm. </li></ol> 3. Perfüze Fare Kalp Eşodaklı Görüntüleme <ol><li> Hemen iskelet kaslarının in vivo görüntüleme ile, heparin (ip) 200 birim ile fare enjekte edilir. On dakika sonra, torakotomi fare euthanize ve hızlı bir şekilde ona bağlı akciğerler ve timus ile kalp kaldırmak. </li><li> Hızla buz gibi soğuk tampon maddesi içinde akciğer çıkarın. Timus lobları belirlenmesi ve yavaşça çıkan aort maruz geri soyma. </li><li> Timus çıkarın ve dikkatle herhangi bir çevre doku kaldırarak aorta izole. </li><li> Aort arkın ilk dalı öncesinde çıkan aorta üst ucunda bir kesim olun. </li><li> Lümen maruz iki mikro dikiş forseps ile yavaşça aort duvarı tutun ve dikkatle ca üzerine aorta yerleştirinnnula (PE50 tüp). Dikiş hızla aort etrafında bağlı ise aorta bir mikro damar kelepçe ile yerinde tutulur. </li><li> Kanül ucu aort kökü üzerinde olduğundan emin olmak için forseps ile kanül dikkatle kontrol edin, kelepçesini sökün. Ek bağları yerine kalp tutmak için gerektiğinde eklenir. </li><li> Peristaltik pompa açın ve 1 ml / dk da kalp serpmek. Kalp perfüzyon üzerine yenerek devam edecektir. </li><li> Perfüzyon sistemi konumunu ayarlayın ve mikroskop sahnede kalp koydu. Sahne kalbi tutan odasının ısıtılmasını sağlayan bir adaptörü vardır. </li><li> Kısmen kalp daldırın odası içinde KHB perfüzyon çözeltisi 1 ml ilave edilir. 37 ° C de, bölmenin sıcaklığını izlemek Peristaltik bir pompa kullanılarak odasından çıkış maddesinin çıkarın. </li><li> Giderek kalp için yeterli akımı (yaklaşık olarak 2 ml / dak) elde etmek için peristaltik bir pompa hızını artırmaktır. </li><li> Stabilizasyon 10 dakika sonra hea perfüze10 uM Blebbistatin ve 100-500 nM TMRM ile oda sıcaklığı. Kalp atışı 10 dakika sonra yavaşlar. </li><li> Bölmenin altındaki lamel ile kalbin sıkı bir temas sağlamak için ve ayrıca kalp atışı bastırmak için kalp üzerine hafif bir basınç uygulanır. </li><li> Yukarıda adım 2.8 &#39;de açıklandığı gibi sağlam miyokardiyumun konfokal görüntüleme için aynı prosedürü uygulayın. Dikkatle mümkün net bir görüntü ortaya odak düzlemi ayarlayın. </li></ol> 4. Görüntü İşleme ve Veri Analizi <ol><li> Tek mitokondriyal yanıp söner ve membran potansiyeli değişiklikleri analiz etmek konfokal yazılımın &quot;Fizyolojik Analizi&quot; modülü tarafından sağlanan araçlarını kullanın. Bu modül, genellikle konfokal sistemin görüntü edinme yazılım dahil ve görüntüde belli alanların belirlenmesi hem de zaman etiketleri ile floresan yoğunluğunun çıkış izin verir. </li><li> Veritabanı ve analiz edilecek daha sonra seri 2D görüntü dosyasını açın. </li><li> &quot;Bölge tıklayınFaiz (ROI) ortalama İB&#39;nin &quot;geçmek için&quot; anlamına ortalamaları İB&#39;nin &quot;modunda&quot; geçmek için &quot;Region of Interest (ROI) demek&quot; modunda. tıklayınız. &quot; </li><li> Yanıp seçmek için cpYFP 488 nm kanal hariç diğer kanalların ekranını kapatın. </li><li> Görüntü ve manuel zoom seri 2D görüntüleri oynatmak için kaydırma çubuğunu hareket ettirin. </li><li> Nerede floresan sinyal artar geçici siteyi bularak tek mitokondriyal süperoksit yanıp tanımlayın. Yanıp işaretlemek için uygun ROI aracını kullanın. Her ROI zaman bağımlı floresan değişimi gösteren iz görüntünün yanında görünecektir. </li><li> Tüm yanıp seçtikten sonra, diğer kanalların ekranda açın. Arka sinyal çıkarma için hücre dışında görüntü üzerinde bir ROI seçin. Birlikte zaman etiketleri ile çıkış her ROI ortalama floresan. </li><li> Tarama zaman ve alan ile birlikte seri tarama görüntü dosyasının her basması sayısını kaydedinHücre. Excel kullanın 100 sn / 1,000 mikron 2 hücre alanının başına yanıp sayısı olarak flaş frekansı hesaplamak için. </li><li> Her flaş (genlik, zirve için zaman ve çürüme zaman) parametrelerini hesaplamak için Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) yazılı geliştirilmiş özel bir program kullanın. IDL yazılım ticari olarak mevcuttur ve flaş parametre analizi için özel olarak geliştirilen program, istek üzerine yazar elde edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium,+ATP,+and+ROS:+a+mitochondrial+love-hate+triangle.">Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).</li><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria. , (2008).</li><li>Rosca, M. G., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+heart+failure.">Mitochondria in heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).</li><li>Griffiths, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+heart+disease.">Mitochondria and heart disease.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Pieczenik, S. R., Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+molecular+pathways+of+disease.">Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease.</a> Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).</li><li>Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+utilization+for+calcium+uptake+and+force+production+in+different+types+of+human+skeletal+muscle+fibres.">ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 531, 393-403 (2001).</li><li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+human+heart.">Mitochondria in the human heart.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state.">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).</li><li>Lambert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+by+mitochondria.">Reactive oxygen species production by mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Robinson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+fluorescent+imaging+of+superoxide+in+vivo+using+ethidium-based+probes.">Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).</li><li>Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-targeted+fluorescent+probes+for+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).</li><li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).</li><li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).</li><li>Belousov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Flashes+in+Single+Mitochondria.">Superoxide Flashes in Single Mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li><li>Wei-Lapierre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+Contribution+of+Mitochondrial+Superoxide+and+pH+to+Mitochondria-targeted+Circularly+Permuted+Yellow+Fluorescent+Protein+(mt-cpYFP)+Flash+Activity.">Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity.</a> J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+superoxide+flash+and+metabolism-coupled+mitochondrial+permeability+transition+in+living+animals.">Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals.</a> Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+superoxide+flashes:+metabolic+biomarkers+of+skeletal+muscle+activity+and+disease.">Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease.</a> FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).</li><li>Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+illuminating+new+insights+into+cardiac+ischemia/reperfusion+injury.">Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury.</a> Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).</li><li>Wei, L., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+SGP+symposium+on+mitochondrial+physiology+and+medicine:+mitochondrial+superoxide+flashes:+from+discovery+to+new+controversies.">Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies.</a> J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).</li><li>Johnson, I., Spence, M. T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.2.">Ch. 12.2.</a> The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes:+elemental+events+of+mitochondrial+ROS+signaling+in+the+heart.">Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+reveal+novel+properties+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+excitability+in+cardiomyocytes.">Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes.</a> Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).</li><li>Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+calcium+waves+and+redox+changes+precede+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+in+the+intact+heart+during+hypoxia+and+reoxygenation.">Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation.</a> Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Canlı hayvan veya perfüze organ tek mitokondriyal olayları görüntüleme mitokondrial fonksiyon değerlendirme 17,19,21,22,24,25 için geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaja sahiptir. Burada anlatılan teknik, hücre içi çözünürlükte gerçek bir fizyolojik duruma mitokondriyal fonksiyon in situ tespiti gerçek zaman elde edilebilir. Sistemik olarak, in vivo olarak belirli bir organ veya hücre tipinde normal fonksiyonu, mitokondri rolünü incelemek için, diğe...

Mitokondri hücre Bioenerji merkezi rol, serbest radikal sinyalizasyon, redoks hemostazını, iyon düzenlenmesi ve hücre kaderinin belirlenmesi 1,2 oynamaktadır. Mitokondri disfonksiyon sıklıkla eşlik eder ve hastalık 3-6 patogenezi yatmaktadır. Özellikle bu kalp ve iskelet kasları gibi kas sistemlerinde, mitokondriyal solunum hücre içi kalsiyum ve sağlam, güç geliştirme 7,8 zamanında düzenleme desteklemek için ATP çoğunluğu içerir. Bu kaslar, genellikle, toplam hücre hacmi% 20-40 kadar işgal myofilaments 2 arasında &quot;sabit&quot; olan mitokondri içinde çok sayıda sahiptirler. Çok sayıda araştırmaya rağmen, özellikle in vivo ve fizyolojik ilgili koşullar altında mitokondriyal fonksiyon yönetmelik, anlayışımız, sınırlıdır. Bunun nedenlerinden biri, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için geliştirilmiş yöntemlerin çoğunluğu vitr olarak itimato ya da eski tür yapay substratlar ile takviye izole mitokondri oksijen tüketimi ve morfoloji yoluyla mitokondriyal fonksiyonun belirlenmesi dolaylı (örneğin elektron mikroskopisi), enzim aktivitesi (örneğin akonitaz aktivite) ya da hücre içi ATP seviyeleri 9-11 izlenmesi gibi vivo yaklaşımlar, . Son zamanlarda, göreceli mitokondriyal zenginleştirme ile küçük molekül floresan göstergeler sağlam hücrelerde zar potansiyeli, kalsiyum ve reaktif oksijen türlerinin (ROS), dahil olmak üzere 11-13 mitokondriyal sinyallerin bir belirti sağlamak için uygulanmıştır. Ayrıca, çok sayıda yeşil floresan protein (GFP) redoks bazlı ve ROS göstergeleri bölümlere hücre içi redoks veya ROS 14-16 sinyal daha özel bir değerlendirme elde etmek için geliştirilmiştir. Bu arasında, bir genetik olarak kodlanmış süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan protein ve targete gelişmişmitokondri (mt-cpYFP) 17 içine d o. mt-cpYFP 515 nm &#39;de iki emisyon tepe ile 405 ya da 488 nm&#39;de uyarıldığında edilebilir. 488 nm eksitasyon emisyon in vitro ve in vivo kalibrasyon 17,18 önceki ile gösterildiği gibi, süperoksit özellikle duyarlıdır. 405 nm uyarma emisyon (çeşitli koşullar altında mt-cpYFP emisyon ve uyarma spektrumları hakkında detaylı bilgi için Ref 17 Şekil 1&#39;e bakınız), iç kontrol olarak kullanılmıştır. Time-lapse konfokal görüntüleme ile bu gösterge sağlam hücreler tek mitokondrilerinde süperoksit yanıp adlı süperoksit üretimi olayları, patlama algılar. Süperoksit flaş mitokondrial solunum, ekli geçici mitokondriyal membran depolarizasyon ve ROS üretiminin 17-20 bir bileşik fonksiyonu olarak hizmet vermektedir. Son zamanlarda, biz pUC&#39;den CAGGS-mt-cpYFP vektör C57/BL6 arka planda 17,19 kullanarak pan-doku mt-cpYFP transgenik fareler üretilen ve güçlü Expres doğruladıktankalp, iskelet kasları ve diğer dokularda (Şekil 2) Bu göstergenin sion. Transgenik fareler istek ve Washington Üniversitesi tarafından MTA onayıyla ilgilenen akademik araştırmacılar için geçerli olacak. Bu çalışmada, in situ Langendorff perfüze kalp süperoksit basmaları görüntüleme gibi anestezi uygulanmış mt-cpYFP transgenik farelerin 17,19 iskelet kaslarında flaş etkinlikleri in vivo görüntüleme açıklar. Bu teknoloji fizyolojik ilgili bir durum veya in vivo 21,22 tek mitokondriyal ROS üretim olayları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Böyle uygun floresan gösterge ile membran potansiyeli ve kalsiyum gibi diğer tek mitokondriyal parametrelerini izlemek için sistemi kullanmak da mümkündür. Hücre içi olaylar (örn. kalsiyum geçici) veya kalp fonksiyonu (mitokondriyal fonksiyonu daha fazla, aynı anda ya da paralel değerlendirme örn.. Ejeksiyon fraksiyonu) elde edilebilir. Böyle iskemi reperfüzyon gibi patolojik tedirginlikler, sağlam miyokardiyumda tek mitokondriyal fonksiyonu üzerindeki stresin etkisini değerlendirmek için perfüze kalp uygulanabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitokondri ökaryotik sistemlerde enerji üretimi ve hücre içi sinyal sorumlu kritik bir hücre içi organel. Mitokondriyal işlev bozukluğu, genellikle eşlik eden ve insan hastalığına neden olur. Mitokondriyal işlev bozukluğu ve değerlendirmek için geliştirilmiştir yaklaşımlar çoğunluğu in vitro ya da ex vivo ölçümler dayanmaktadır. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar, in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonu belirlenmesinde yeteneği sınırlıdır. Burada, in vivo olarak, gerçek zamanlı bir şekilde, tek bir mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak tanır, canlı aminaller sağlam dokuların görüntülenmesi için, konfokal tarama mikroskobu kullanan yeni bir yaklaşımı tarif eder. İlk olarak, mitokondriyal hedeflenen süperoksit göstergesi, dairesel sırası değiştirilmiş sarı floresan proteini (mt-cpYFP) ifade eden transjenik fareler üretir. Anestezi mt-cpYFP fare ısmarlama bir sahne adaptörü ve zaman atlamalı görüntüler f alınır sabittirhindlimb açıkta kalan iskelet kasları rom. Fare daha sonra kurban edilir ve kalp 37 ° C&#39;de fizyolojik çözümleri ile Langendorff perfüzyon için ayarlanmış Perfüze kalp konfokal mikroskop sahnede özel bir odasında konumlandırılmış ve hafif basınç kalp hareketsiz ve kalp atışını kaynaklı hareket yapaylığı bastırmak için uygulanır. Süperoksit yanıp saniyede bir çerçeve frekansında gerçek zamanlı 2D konfokal görüntüleme ile tespit edilir. Perfüzyon çözüm farklı alt tabakaların solunum ya da diğer floresan göstergeleri ihtiva edecek şekilde modifiye edilebilir. Perfüzyon, aynı zamanda, iskemi ve reperfüzyon gibi hastalık modeller üretmek için ayarlanabilir. Bu teknik, sağlam dokularda ve in vivo olarak bir mitokondri fonksiyonunu belirlemek için benzersiz bir yaklaşımdır.

Bu protokole göre, tek mitokondriyal olayların in vivo görüntüleme anestezi farelerin iskelet kaslarında yapılabilir perfüze kalp yerinde görüntüleme (Şekil 1) izledi. Görüntüleme koşulları optimum ayarı bozulmamış kas dokularının net görüntüler sağlamak ve tek mitokondri çözünürlük (Şekil 2) ile olacaktır. TMRM genellikle mt-cpYFP konumunu kontrol etmek için kullanılır ve mt-cpYFP sinyali ile tam bir üst üste desen <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo at JoVE.com

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar.

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

confocal-imaging-single-mitochondrial-superoxide-flashes-intact-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K Görüntüleme.  University of Washington.  Konfokal mikroskopi taraması, canlı bir hayvanda perfüze kalp ya da iskelet kaslarında bir mitokondriyal etkinlik görüntülenmesi için uygulanır. Süperoksit basması ve membran potansiyel dalgalanmalar gibi tek mitokondriyal süreçlerinin gerçek zamanlı izleme fizyolojik ilgili bir bağlamda ve patolojik tedirginlikler sırasında mitokondrial fonksiyon değerlendirilmesini sağlar. 

Video: Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Biyoloji

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocal peptit Y-pHluorin, görüntüleme: insülin granül ekzositozu olduğu gibi fare ve insan adacıkları görselleştirmek için bir teknik

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Mitokondriyal Membran Potansiyeli ve Süperoksit Seviyelerinin Miktar Tayini

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

Yazar Gündemi: HeLa Hücrelerinde Canlı Görüntüleme Kullanılarak Mitokondriyal Membran Potansiyelinin ve Süperoksit Seviyelerinin Floresan Tabanlı Miktar Tayini  

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...