Bu çalışma HHMI 56006760 dan (GM45735, JDV, DMAW için Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) (2 1 TL RR 24.158-6), ve Ellison Tıp Vakfı (AG-SS-2.465) ve NIH ödül tarafından desteklenen GM45735S1 ve GM096445) LP. GM45735S1 Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası 2009 altında NIH yayınlandı. Bu çalışmalar için kullanılan mikroskoplar bir NIH / NCI hibe (5 P30 CA13696) ile kısmen desteklenmiştir.

1. Biyosensörler ile Maya Hücreleri Dönüşüm <ol><li> Lityum asetat yöntemi 27 kullanarak plazmid taşıyan mito-roGFP veya mitGO-ATeam2 ile istenilen maya suşu Transform. </li><li> Plazmid kaynaklı biyosensör ile dönüşüm onaylamak ve plazmid kaybını önlemek için, seçin ve uygun seçici sentetik tam orta (mito-roGFP için SC-Ura, veya mitGo-ATeam2 için SC-Leu) üzerinde transformantlar korumak. Floresan prob burada tarif edilenden farklı bir plazmide alt klonlanmıştır ise, uygun seçici orta kullanın. Onlar floresan biyosensör ifade onaylamak ve normal mitokondriyal morfoloji sergilemek floresan mikroskobu ile transformantlar gözünüzde canlandırın. </li></ol> 2. Görüntüleme için Hücreler ve Hazırlık Büyüme Hücre fonksiyonu ve ilaç tedavisine yanıt hücre yoğunluğu ve metabolik aktivite son derece bağlıdır. En iyi sonuçlar elde edilir; hücreaktif (- 1 x 10 7 hücre / ml orta-log fazı, ~ 0.5) bölünmesi vardır. Tutarlı yoğunluğu orta log fazı kültür oluşturmak için en güvenilir yolu sabit bir faz öncesi kültürden aşılamak için. <ol><li> Bir sabit faz ön-kültür hazırlanması: bir tabaktan dönüştürülmüş hücrelerin tek bir koloni almak ve seçici sıvı ortam (50 ml konik bir tüp içinde alt-5 mi) inoküle. 600 nm (OD 600) de kültürün optik yoğunluk bir plato (24-48 saat) ulaşıncaya kadar 225 rpm&#39;de sallayarak ile 30 ° C de büyür. </li><li> Gözlem için bir orta log fazı kültürü hazırlanması: 50 ml konik bir tüp içinde alt-seçici ortam 5 ml inoküle etmek üzere ön-kültür, uygun hacmi kullanın. YPD ortamı autofluorescent ve bu çalışmalar için kullanılmamalıdır. Sentetik tam, glukoz tabanlı, bırakma (SC-Ura) ortamları kullanın. Onlar orta-log fazı (- 1 x 10 7 hücre / ml ~ 0.5) ulaşana kadar, 4-16 saat, 225 rpm sallayarak, 30 ° C&#39;de hücreleri büyütün. Hücre yoğunluğu belirlenebilirOD 600 ölçerek, doğru OD 600 okuma belirlemek için spektrofotometre kalibre. Bizim Beckman DU530 (IN Beckman Coulter, Indianapolis,) On, orta-log fazı 0.1-0.3 bir OD 600 karşılık gelir. </li></ol> Mito-roGFP1 metabolik değişimler nedeniyle organelde duyuları dalgalanmalar. Örneğin, bu deneyde, mitokondriyal redoks durumu değişiklikleri maya fermente edilebilir karbon kaynağı (örneğin glükoz, SC medya gibi) karşı olmayan fermente edilebilir karbon kaynağı (örneğin, gliserol gibi SGlyc medya) büyümeye ne zaman ve hatta aynı farklı kısımlarındaki medya. Bu nedenle, tüm deneyler için aynı ortam toplu kullanın. <ol start="3"><li> Hiçbir tedavi yapılıyorsa Hücreler konsantrasyon hazır (adım 2.4) ve görüntüleme vardır. Hücreleri tedavi ediliyor, uygun tedavi ile hücreleri inkübe ve bir sonraki adıma geçin. </li><li> 15 saniye boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile kültüre 1 ml konsantre veOrtam 20 ul hücre pelet yeniden süspanse. Bu koşullar, görüş alanında ayırt hücrelerin sayısını en üst düzeye çıkarmak. </li><li> Bir slayt için yeniden süspanse hücre 2 ul uygulayın. Bir lamel (No 1.5, tercihen yüksek performanslı 170 ± 5 mikron kalınlığında) ile kaplayın, ve net oje veya valap (Reaktifler bakınız) ile lamel kenarları mühür. Valap ile mühür, lamel kenarları boyunca küçük bir miktar yayılır sonra, bir Bunsen beki alev üzerinde tutarak bir metal spatula üzerinde küçük bir miktar eritebilir. </li><li> Görüntüleme sırasında 30 ° C&#39;de hücreleri koruyun. Görüntüleme için kullanılan 100x immersiyon yağı lens hakkında objektif bir ısıtıcı bu uygulama için iyi çalışır. Bu koşullar altında, mitokondriyal morfolojisi, redoks durumu ve ATP seviyeleri 10-15 dakika boyunca görüntüleme sırasında değişmeden kalır. </li></ol> 3. Görüntüleme Kurulum <ol><li> Bir geniş alan floresan mikroskop görüntüleme mito-roGFP1 için Kurulum Burada adımlar AxioObse uyarlanmışrver.Z1 mikroskop bir Colibri LED uyarma kaynağı, bir geniş alan Orca ER kamera ve Axiovision toplama yazılımı ile donatılmıştır. Mito-roGFP1 okside her iki kanal ve Fotoçevrim photobleaching cıva ark lambası aydınlatma (bkz. aşağıda) ile karşılaştırıldığında LED aydınlatma kullanılarak önemli ölçüde azalır. Sinyal ve çözünürlük en üst düzeye çıkarmak için, amacı mümkün olan en yüksek sayısal diyafram ve yeterli uzaysal çözünürlük sağlayan en düşük büyütme kullanın. Buna ek olarak, mito-roGFP görüntüleme için, objektif 365 nm de iletir doğrulayın. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar objektif (Zeiss) bu uygulama için iyi çalışır. Yükseltgenmiş ve indirgenmiş mito-roGFP1 tür yakalamak için toplama yazılımı yapılandırın. Biz şu şartları kullanılabilir. <ol><li> Dahil excitatio ile, mito-roGFP gibi HE (Zeiss) set filtre 38 olarak 365 nm (% 100 LED güç) ve GFP için uygun bir emisyon filtresi, de uyarma kullanmak okside için kanal yapılandırman filtre küp kaldırıldı. Eksitasyon filtresi çıkarılması böylece ulaşılabilir zaman çözünürlüğü artan, filtreleri geçmek için gerek kalmadan 365 nm ve 470 nm hem de uyarma sağlar. </li><li> Yukarıda da belirtildiği gibi, 470 nm (% 100 LED güç) de uyarma kullanımı ve düşük mito-roGFP için kanal yapılandırma, aynı emisyon filtresi küp okside mito-roGFP için kullanılır. Uzaysal çözünürlüğü optimize etmek için 1x1 binning için kamera ayarlayın. </li><li> Her z pozisyonda kanalları hem toplama, 0.5 mikron aralığı ile 11 dilim oluşan az yığını elde etmek için yazılım ayarlayın. Satın alma Bu mod da her z yığını elde daha yavaş, ama yükseltgenmiş ve indirgenmiş kanal satın arasındaki mitokondriyal hareket kaynaklanan eserler önler. </li><li> Görüntü birkaç hücreleri güçlü değil doyurarak sinyal üreten, uygun bir pozlama süresi belirlemek için. Tüm deney için okside ve mito-roGFP1 azaltılmış için pozlama süreleri oranı korumak için önemlidirs. Örneğin, için pozlama süreleri okside ve mito-roGFP1 mito-roGFP1 okside için maruz kalma süresi, daha sonra sırasıyla, 300 ve 100 milisaniye olan azaltılmış ise 3 kez olması gerektiğini tüm deneyler için mito-roGFP azaltılmış için. </li></ol></li><li> Bir spektral konfokal mikroskop görüntüleme mitGO-ATeam2 için Kurulum MitGO-ATeam2, GFP (emisyon maksimum 510 nm) floresan kullanarak ATP düzeylerini ölçmek için OFP (emisyon maksimum 560 nm) gelen bu ayırt edilmelidir. Bu fluorophores yayılan floresan çözmek floresan filtre setleri vardır. Ancak, konfokal mikroskoplar tarama birçok lazer geçerli bir spektral dedektör,, bu uygulama için en uygun bulmak. Bir spektral dedektör dalga boyuna göre çok bileşen (genellikle 32 veya daha fazla) içine floresan emisyon ayırır. Birkaç komşu dalga boyu bantları bir resim kanal birleştirilebilir. Birleştirilmek üzere dalga boylarında çok deneysel G sinyali en yüksek olarak seçilirKarıştırabileceklerinden sinyalinin çapraz kaçınarak FP ve OFP ölçüm FRET. Mevcut en yüksek sayısal açıklık objektif kullanın. Bir 100x/1.49 veya 60x/1.49 Apo-TIRF objektif kullanın. Biz NIS Elements yazılımı çalıştıran Nikon A1R konfokal mikroskop kullanın. ATP bağlı ve ATP-ilişkisiz mitGO-ATeam2 tür yakalamak için toplama yazılımı yapılandırın. Biz şu şartları kullanılabilir. <ol><li> Sistemimizde yaklaşık 0.42 mikron az çözünürlüğe karşılık 1.0 Airy birimleri (AU), için iğne deliği ayarlayın. </li><li> Görüntüdeki mekansal bilgi en üst düzeye çıkaracak Nyquist örnekleme sınırı, yaklaşım tarama zoom ayarlayın. Sistemimizde piksel boyutu 0.12 mm. </li><li> Mitokondri görüntüleme sırasında hareket edebilir, çünkü 512 x 256 piksel alanı kırpma tarafından görüntüleme hızını artırmak için yararlı olabilir. Sistemimizde görüntü bir kare için gereken toplam süre 2 kat tarama ortalama dahil olmak üzere, 1.0 sn. İstenen uzaysal çözünürlüğü bağlı olarak, alanında daha da increas kırpılmış olabilire zaman çözünürlüğü. </li><li> 488 nm&#39;de Excite ve 500 emisyon toplamak - GFP için 520 nm ve 550 - OFP için 580 nm. Gerçek en iyi değerleri görüntüleme sistemi özellikleri ile değişebilir. </li><li> Sistemimiz için en uygun lazer gücü 6.0 ve% 6.4 arasındadır. En uygun lazer gücü her mikroskop sistemi için değişir, ama yine de bir yorumlanabilir görüntü üretirken ideal mümkün olduğunca düşük olacaktır. Herhangi bir optik sistem zaman içinde normal meydana lazer güç değişiklikleri, izlemek için bir dahili veya harici güç ölçer kullanın. </li><li> Piksel değerlerinin tespit aralığı en üst düzeye çıkarmak ancak mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak için, doyurarak sinyal önlemek için dedektör kazanç ve aydınlatma ışık yoğunluğunu ayarlayın. % 1&#39;den fazla doymuş piksel içeren herhangi bir hücre analiz yok. Aynı amaç, lazer gücü, tarama zoom, piksel boyutu, kazanç ve ofset kullanarak görüntü tüm örnekler. </li></ol></li></ol> 4. Resim Alma <ol><li> Odak pla bulun<html> floresan prob beyazlatma en aza indirmek için iletilen ışık kullanarak ilgi hücrelerinin ne. </li><li> Ilgi çekici bir veya daha fazla hücre bulduktan sonra, 0.5 mikron arasında bir adım boyutu ile tipik bir cep (yaklaşık 7 um), bütün derinliği boyunca z-dizi toplamak. </li><li> Resim diğer slayt faiz hücreleri, ancak görüntü 15 dakikadan fazla tek bir slayt yok. Slayt üzerinde 15 dakika sonra, hücre canlılığını kaybeder. </li></ol> 5. Analiz Mitokondrial ATP seviyesinde 510 nm &#39;de olduğu için 560 nm&#39;de mitGO-ATeam2 emisyon oranını ölçerek belirlenir 27 organel redoks durumu Mito-roGFP bölgesinin (T / O) okside oranı düşürülür olarak ölçülür;. Yani 365 nm uyarma üzerine 510 nm emisyon bölünmesiyle 470 nm uyarma üzerine 510 nm emisyon. Oranı hesaplamadan önce, biz arka plan çıkarma ve floresan mitokondri ait piksel için bir eşik değerini belirlemek. çadır &quot;&gt; Kamu malı (örneğin ImageJ 30) veya yazılım mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam2 analizi. görüntü elde etmek için kullanılan yazılıma bağlı olarak ve analiz için kullanılabilir (örneğin Volocity, Perkin-Elmer) ticari, görüntüleri İlk analiz yazılımı onları açmadan önce, TIFF gibi, başka bir biçime dönüştürülmesi gerekebilir. görüntüler dönüştürülür, bu piksel değerleri dönüşüm sırasında değiştirilmez doğrulamak için gereklidir. mito-roGFP1 veri analizi kullanarak her iki program aşağıda açıklanmıştır. her menü içinde seçmek için Program menüleri ve seçenekleri koyu ve italik olarak vurgulanır. 5.1 ImageJ analizi <ol><li> Açık görüntüleri ve değişim tipi 32 bit için: Görüntü → tipi → 32 bit. </li><li> Hiçbir hücre vardır bir alanda ilgi (ROI) bir bölge çizin. Bu yatırım getirisi ortalama yoğunluğu hesaplayın: → Tedbir analiz edin. </li><li> Yığından hesaplanan ortalama arka plan çıkarma: Süreç → Matematik → Çıkart. </li><li> Çıkarılır z-yığını kullanarak, mitokondri üzerinde orta dilim ve eşik bulmak: Resim → Ayarla → Eşik ve Eşik penceresinde Uygula&#39;yı tıklatın. Yığın tüm dilimleri için geçerlidir. NaN arka plan pikseller ayarlayın kontrol edin. </li><li> Oranı oluşturma z yığını: Süreç → Görüntü Hesaplama mito-roGFP1 analizi için okside z yığını tarafından azaltılmış yığını bölün. MitGO-ATeam2 analizi için (ATP ilişkisiz) görüntü 510 nm ile 560 nm (ATP bağlı) görüntü bölün. </li><li> Ilgi alanı etrafında bir ROI çizin. → Araçlar → ROI Müdürü analiz seçin ve ROI kaydetmek için Ekle&#39;yi tıklatın. Birden fazla bölge yöneticisi saklanabilir. ROI Yöneticisi, tüm ROI seçin, sonra M seçincevher → Tüm yığın dilimleri ölçmek için Birleştirilmiş. Analiz için bir elektronik tabloya veri verir. </li></ol> 5.2 Volocity analizi <ol><li> Bir Volocity kütüphaneye görüntüleri aktarmak ve 2 kanallı bir görüntü dizisi oluşturun. </li><li> Hiçbir hücre vardır bir alanda ilgi (ROI) bir bölge çizin. Seçin: Araçlar → Oranı. </li><li> ROI itibaren alın: arka hesaplamak için Volocity kullanın. </li><li> Mitokondriyal yapıları içerecek şekilde eşik ayarlayın. </li><li> Oranı kanala bir gökkuşağı LUT uygulamak için seçeneğini işaretleyin. Yoğunluk ayarlı kanal sunum için daha az gürültülü görüntüleri oluşmasına neden olabilir, ama ortalama oranı kantitatif için kullanılmamalıdır. </li><li> Ölçüm sekmesini seçin bu oran kanalı seçin ve ilgi alanı etrafında bir ROI çizin. Sıfır değerleri hariç oranı kanal ölçün. Çoğul bölgeler ve ölçülebiliraynı zamanda. Analiz için bir elektronik tabloya veri verir. </li></ol>

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada, maya hücreleri canlı mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini değerlendirmek için biyosensör olarak mito-roGFP1 ve mitGO-ATeam2 kullanımı yöntemleri açıklanmaktadır. Biz nicel mitokondriyal morfolojisi veya dağıtım veya hücresel büyüme oranları üzerinde herhangi bir belirgin etki olmadan, mitokondri için hedef olarak plazmid kaynaklı mito-roGFP1 veya mitGO-ATeam sonuçlarının bu ifade bulabilirsiniz. 3 Mito-roGFP1 yüksek gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri...

Mitokondri amino asitler, yağlı asitler, heme, demir sülfür, kümeleri ve pirimidinlerin ATP üretimi, biyosentezi için gerekli organellerdir. Mitokondri de kalsiyum dengesinin önemli rol oynarlar ve apoptoz düzenlenmesinde. Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı, Amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığı gibi yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklara mitokondri Artan 1 kanıt bağlantılar. 2 kişi ile bütün hayatlarını yaşarken nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili protein, mitokondriyal mutasyonlar, hastalık semptomları ileri yaşlarda ortaya çıkar. Bu değişiklikler ortaya hastalık patolojisi izin yaşla birlikte mitokondri meydana gösterir. Gerçekten de, mitokondriyal spor genel hücre sağlığı ve ömrü maya ve memeli hücreleri ile ilişkilidir. Burada 3,4, biz mitoc iki kritik özellikleri değerlendirmek için genetik olarak kodlanmış, rasyometrik floresan biyosensörler nasıl kullanılacağı açıklanmaktadırmaya hücreleri canlı hondria: redoks devlet ve ATP seviyeleri. Aerobik enerji seferberlik içinde mitokondriyal fonksiyonu iyi bilinmektedir. Mitokondriyal redoks devlet NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatyon / glutatyon disülfit (GSH / GSSG) ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) dahil olmak üzere, organel türlerin azaltılması ve oksitleyici bir ürünüdür. Mitokondri veya hipoksi ayrılması mitokondriyal solunum faaliyeti etkiler ve NAD oranı + organelde NADH için değiştirir. Iç mitokondriyal zarın bir elektron nakil zincirinin kompleksleri, hem de aminlerin deaminasyon gelen dış mitokondriyal membranın monoamin oksidaz ile 5, hasar lipidler, proteinler ve nükleik asitler arasındaki yetersiz elektron transferinden imal edilmiştir ve ROS 6,7,8 yaşlanma ve yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. ROS, aynı zamanda m sinyal transdüksiyonu bir rol oynayabiliritochondria, GSH oksidasyonu ile. Örneğin, NADH dehidrogenaz ROS üretimine katkıda değil, aynı zamanda glutatyon havuzu 9,10 ile etkileşim yoluyla düzenlenir. α-Ketoglutarat dehidrogenaz ve asonitaz, TCA döngüsü bileşenleri, ortamlar 11,12 oksitleyici azalmış aktivite gösterirler. Gerçekten de, asonitaz faaliyet redoks bağımlı düzenleme bakterilerden memelilere 13,14 için korunur. Böylece, redoks devlet ve mitokondri ATP seviyeleri izleme hastalığı patoloji kendi işlevini ve rolünü anlamak için çok önemlidir. Biyokimyasal yöntemler redoks devlet veya tüm hücrelerin ATP düzeylerini değerlendirmek için kullanılan ya da mitokondri izole edilmiştir. Bütün hücrelerde ya da redoks durumunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan yöntemler mitokondri izole redoks çifti GSH / GSSG 15 seviyelerinin ölçülmesi dayanmaktadır. Lusiferin-lusiferaz sistemi yaygın mitokondriyal ölçmek için kullanılırMitokondri permeabilize bütün hücreler veya izole edilmiş ya da ATP seviyeleri. 16,17,18,19,20 Bu deneyde, lusiferaz orantılıdır ATP ye bağlanan ve oksitlenmesi ve luciferase ikinci kemilüminesans katalize eder. 21 yayılan ışık şiddeti Reaksiyon karışımı, ATP. 22 Bu yöntemler, örneğin Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, anormal derecede düşük olan hastalarda ATP seviyeleri bulgu da dahil olmak üzere, mitokondriyal fonksiyonu, ilgili temel bilgiler ortaya konmuştur. 23 Bununla birlikte, görüntü canlı, sağlam hücreler için kullanılamaz. Ayrıca, tüm-hücre analizine dayalı yöntemler redoks durumu ya da hücrenin tüm bölümlerinde ATP seviyelerinin bir ortalaması sağlar. Mitokondriyal redoks devlet veya ATP seviyeleri hücre içi fraksiyon sırasında değişebilir çünkü izole organeller ölçümler potansiyel sorunlu. Son olarak, laboratuar ve diğerlerinden son çalışmalar gösteriyor kitek tek hücreler içinde mitokondri da anne ve yavru hücrelerin ömrünü etkiler, fonksiyon heterojendir. 3 Bu nedenle, hücre içi çözünürlüğe sahip canlı hücrelerde mitokondriyal ATP seviyeleri ve redoks ölçmek için bir ihtiyaç vardır. Her iki GFP dayalı mitokondriyal fonksiyon için biyosensör Burada anlatılan. Redoks-duyarlı GFP (roGFP) 24,25 yüzeye maruz kalan sisteinler molekülüne ilave edildiği bir GFP çeşididir. roGFP, yabani tip GFP gibi, iki uyarma tepeler (~ 400 nm ve 480 nm &#39;de ~) ve ~ 510 nm&#39;de emisyon tepe vardır. ~ 400 nm&#39;de eksitasyon artışa roGFP sonuçlarında sistein kalıntıları oksidasyonu. Bu sistein azaltılması ~ 480 nm uyarma yanadır. Böylece, 480 nm ve 400 nm dalga boyunda roGFP uyarma üzerine 510 nm emisyon oranı fluorofor en ortamının redoks durumunu yansıtan azalır ve okside roGFP, göreli miktarını ortaya koymaktadır. İki versroGFP iyonları yaygın olarak kullanılır: roGFP1 ve roGFP2. Her ikisi de aynı sistein eklemeleri içerir. roGFP1 yabani tip GFP esas alınmaktadır ve roGFP2 wtGFP 24 göre 400 nm ile 480 nm ve daha az etkili bir uyarma daha verimli bir uyarım var S65T GFP esas alınmaktadır. roGFP1 roGFP2 ve dinamik aralığı düşük bir kapsama alanı içine daha fazla genişletir daha duyarlı daha az pH olduğunu. Böylece, roGFP1 daha azaltılması gibi mitokondri gibi bölmeleri veya sitoplazmada ve bu endozomlar gibi değişken pH, ile bölmeleri izlenmesi için daha yararlı olabilir. roGFP2 parlak sinyal ve, bazı çalışmalarda, roGFP1 24,26 daha büyük bir dinamik aralık sunuyor. Arabidopsis thaliana çalışmalar redoks değişikliklere yanıt için gereken zaman her iki sensörden (t ½ oksidasyonu için, 65 ve 95 sn ve t ½, sırasıyla roGFP1 ve roGFP2 için azaltılması, 272 ve 206 saniye,) için benzer olduğunu gösterir. 26 MitGO-ATeam2 minimal invaziv, güvenilirtomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae mitokondriyal ATP ölçer sensör. GO-ATeam donör ve alıcı floresan proteinleri (GFP ve turuncu (OFP) protein floresan, sırasıyla) FRET F o arasında sıkışmış F 1-ATP sentaz ε alt birimi oluşan bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) prob. 27 getirmek proteinin konformasyonel değişiklikler ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama alıcı yakın FRET donör ve alıcı vericiden enerji transferini sağlar. GO-ATeam, GO-ATeam1 ve GO-ATeam2 iki türevleri vardır. GO-ATeam2 genellikle daha düşük mitokondride sitoplazmada karşılaştırılmıştır [ATP]. 27 ölçüm için daha uygun hale GO-ATeam1 daha MgATP için daha yüksek bir afiniteye sahiptir Mitokondriyal redoks araştırmak için, bir lider dizisi ATP9 kaynaşmış roGFP1 oluşan bir füzyon proteini (mito-roGFP1) inşand güçlü gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (gpd) promoteri (p416GPD, Addgene) kontrolü altında, bir sentromer plazmid bazlı (düşük kopya sayısı) maya ekspresyon eksprese. Bu model mantar, Saccharomyces cerevisiae yaşlanma bağlamında mitokondri redoks statüsü araştırmak için kullanılan roGFP1. Biz roGFP1 yaşlanma sırasında ve besin durumu tepki olarak ortaya ama maya hücreleri üzerinde belirgin bir olumsuz etki yapar mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak bulabilirsiniz. Biz de tek tek canlı maya hücrelerinin içinde mitokondri redoks durumu değişkenlik, hücre içi mekansal çözünürlükte bir biyosensör önemini vurguluyor bir bulgu bakın. MitGO-ATeam2 GO-ATeam2 en amino ucunda takılı sitokrom c oksidaz alt ünite VIIIA en mitokondriyal sinyal dizisi vardır GO-ATeam2, bir çeşididir. 27 Biz mitGO-ATeam2 prob (lütfen H. laboratuvar tarafından sağlanan modifiye Noji, Enstitüsü of Bilimsel ve düşük kopya plazmid olan maya ifade vektörü pAG415GPD-ccdb (Addgene, Cambridge, MA, USA) içine Xba1 ve HindIII bölgeleri yoluyla alt klonlama ile Mayada kullanım için endüstriyel araştırma, Osaka Üniversitesi, Japonya), güçlü kurucu GPD organizatörü içeren. Biz tomurcuklanan maya mitGO-ATeam2 ifade ve mitokondriyal ATP düzeylerinde fizyolojik değişiklikleri ölçmek için etkili bir prob olarak hizmet vermektedir bu mitokondri için sadece lokalize DNA bağlayıcı boya DAPI,, ile counterstaining tarafından, bulabilirsiniz. roGFP ve GO-ATeam genetik olarak kodlanmış her ikisi de. Sonuç olarak, ortaya ve sabit bir şekilde tutulmuş sağlam hücreler ve redoks durumu ya da tek tek, canlı hücrelerdeki ATP seviyeleri hakkında bilgi alınabilir. Ayrıca, her iki biyosensör fizyolojik koşullar altında redoks devlet veya meydana ATP seviyelerinde değişiklikleri izlemek. 28 Her iki prob da rasyometrik bulunmaktadır. Bunun sonucu olarak, bu sonda ile yapılan ölçümler Cha etkilenmezbiyosensör konsantrasyon veya numune aydınlatma veya kalınlığında nges. Son olarak, her iki biyosensör hücre içi uzaysal çözünürlüğü sağlar. Gerçekten de, roGFP mitokondri, ER için hedeflenmiştir, endozomlar ve 24 peroksizomlar, ve pH büyük ölçüde bağımsız Bu parçaların her birinin redoks durumu değişiklikleri, algılayabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

Mitokondri enerji metabolizması ve hücre ömrü ve programlanmış hücre ölümü kontrol etmek için kalsiyum homeostazı, birçok hücresel süreçlerde rol oynarlar. Bu süreçler etkiler ve redoks durumu ve mitokondri tarafından ATP üretimi etkilenir. Burada, maya hücreleri canlı hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeyini algılar iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör kullanımını tarif. Mitokondriyal redoks devlet mitokondrial matriks hedeflenmektedir redoks duyarlı Yeşil floresan proteini (roGFP) kullanılarak ölçülür. Mito-roGFP da protein uyarma spektrumu değiştirebilir geri ve çevre-bağımlı oksidasyon ve redüksiyon, tabi pozisyonlar 147 ve GFP 204, de sistein içerir. MitGO-ATeam F o ε altbirim F 1-ATP sentetaz arasına sıkıştırılmış olduğu bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) probu, donör ve alıcı Fluo FRETrescent proteinler. Getirmek protein konformasyonunun olarak ε altbirim sonuçlarına ATP bağlama yakın verici ve alıcı ve verici FRET gelen alıcı için floresans rezonans enerji transferi için izin verir.

Mito-roGFP ile mitokondriyal redoks devlet Ölçme Burada, mito-roGFP1 maya hücre büyümesi veya mitokondriyal morfolojisi etkilemeden, maya hücreleri canlı azalmış tamamen okside gelen mitokondriyal redoks devlet değişiklikleri algılamak için dinamik menzile sahip olduğunu göstermektedir. İlk olarak, mitokondri hedefli GFP ve roGFP1 ifade hücreleri normal tarifeler (Şekil 1A) büyümesi bulabilirsiniz. Olarak log-faz büyüme ve maksimum büyüme oranı ulaşmak...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Biz canlı maya hücrelerinde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini izlemek için, GFP temel alan iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör, kullanımı açıklanmaktadır.

Yaşam Maya Hücreleri Mitokondriyal Redoks Devlet ve ATP ölçün oranlı metrik Biyosensörler

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K Görüntüleme.  Columbia University. Biz canlı maya hücrelerinde hücre içi çözünürlükte mitokondriyal redoks devlet ve ATP düzeylerini izlemek için, GFP temel alan iki rasyometrik, genetik olarak kodlanmış biyosensör, kullanımı açıklanmaktadır.

Video: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Nükleik Asitler, Proteinler ve Küçük Moleküller Reagentless Algılama Elektrokimyasal DNA Biyosensörler Fabrikasyon

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Biyomühendislik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Multiplexed Transdermal Elektrokimyasal Algılama Hollow microneedle tabanlı Sensör

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...