Name: studying mitochondrial structure and function in drosophila ovaries
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries at JoVE.com

We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.

Drosophila 1. Hazırlama (Şekil 2A&#39;da tasvir edilmiştir gerekli araçlar) <ol><li> Tarif edilen deneylerin herhangi biri için, Drosophila toplama eclosion 5 gün içinde (oda sıcaklığına ya da 25 ° C &#39;de muhafaza) ve 5 ile doldurulmuş bir şişeye koyun - en fazla 25 olan 7 mL Drosophila gıda (Malzeme Tablo) her flakon uçar; 2 erkek oranı: bir kadın korumak 1. </li><li> Drosophila yumurta üretimini uyarmak için granül maya az miktarda serpin. 4 gün - 2 içinde deneysel manipülasyon gerçekleştirin. </li></ol> Drosophila Yumurtalıkların 2. Diseksiyon (Şekil 2A tasvir edilmektedir gerekli araçları) <ol><li> Sıcak böcek kesme ortamı oda sıcaklığına 25 ° C (Malzeme Tablo). Sekiz oyuklu cam kesme çanak üç kuyu doldurmak her ortamın 200 uL de. </li><li> CO ile Drosophila uyutmak <sub&gt; 2 flakon fiş altında darbe silahın iğne koyarak. Bir sinek pad üzerinde yerleştirin. , Sıralamak 5 kadın Diseksiyon mikroskop kullanarak ve diseksiyon çanak ilk kuyuda koyun. Canlı mikroskopisi yaparken her seferinde bir Drosophila anlaştım. </li><li> Diseksiyon mikroskop mercek aracılığıyla bakarken, forseps iki çift kullanarak karın göğüs kafesi sever. forseps kullanarak, dikkatli bir çanak ikinci kuyusuna karınlarını aktarın. </li><li> forseps diğer çifti ile (diğer karın içeriği ile birlikte) yumurtalıkların dışarı itmek yavaşça arka sonunda karın tutmak için forseps bir çift kullanın ve. Bu girişim başarısız olursa, dikkatle yumurtalıkların serbest bırakmak için ön ucunu forseps takarak karın dış iskelet kaldırın. </li><li> Forseps kullanarak, (yani, sarısı dolu, ileri evre yumurta) opak arka sonuna kadar tek bir yumurtalığı tutun ve çanak üçüncü kuyunun dikkatle taşımakCanlı mikroskobu (adım 3) için işlemek için alay veya immün (adım 7) gerçekleştirmek sabitlemek için. </li><li> Dikkatle forseps bir çift ile arka sonuna tutarken her yumurtalık ön ucuna posteriorundan hafifçe alay iğne süpürülerek yumurtalıkların etrafında koruyucu kılıfı alay. NOT: alay sırasında zararı en aza indirmek iğne ucu bükün ve mikroskop (Şekil 2A) büyütme artırarak her yumurtalık yakınlaştırmak için. Alay kılıf kırmak için yeterli etkili olmalıdır, ama aynı zamanda dikkatli ovaryolden bütünlüğünü korumak için gerçekleştirilmelidir. </li></ol> Canlı doku Mikroskopi 3. Hazırlık NOT: Şekil 2A tasvir edilmektedir gerekli araçları. <ol><li> Drosophila diseksiyonu önce, poli-I-Lizin kaplı odaları hazırlamak. Bu amaçla, covergl ilgili poli-I-lisin (0.1 mg / mL), iki adet 20-uL damla yerleştirmekeşek damla birleştirme önlemek amacıyla birbirinden uygun bir uzaklıkta bulunan bir cam tabanlı bir petri (35 mm) (14 mm, No. 0). 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca levhalar hava kuru ve silinebilir marker ile plakanın alt beyaz poli-I-Lizin filmin kenarları işaretleyin. Not: poli-I-lisin ile kaplanmış oda, bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. Daha önce kaplanmış odacığı kullanılarak durumunda, Drosophila diseksiyon başlamadan önce, oda sıcaklığına kadar getir. </li><li> Örnek olarak aşağıda, diseksiyon ve montaj tamamlandıktan sonra hemen görüntülü olabilir emin olmak için konfokal mikroskop tarama parametrelerini ayarlayın. </li><li> bir disseke ve yumurtalık alay (aşağıdaki adım 2 ve adım 5 Aşağıdaki gerekirse, lekeli) belirgin bir poli-I-Lizin kaplı bölgeye yerleştirin ve ovaryolden ayırmak için alay iğne ile yumurtalık yayıldı. t karşılamak için emin olun, yumurtalık üstünde böcek diseksiyon orta 10 ul damla yerleştirinO tüm alanı poli-I-Lizin kaplı. petri örtün. </li><li> Hemen oda sıcaklığında monte numunenin konfokal mikroskopi gerçekleştirin. Not: Sadece bir Drosophila, parçalara işlenir ve her seferinde görüntülü olmalıdır. Ayrıca, mikroskopi Drosophila doku için bir ısı şoku ortamı taklit eden 37 ° C de yapılan bir işlem değildir. </li></ol> Photobleaching (FLIP) Tahlili 4. Floresan Kaybı Mitokondriyal Matrix Süreklilik değerlendirin NOT: kaynaşmış mitokondriyal yapıda Mitokondriyal matriks süreklilik ara adımlarda bir ilerleme aşağıdaki mitokondriyal iç ve dış membran tam füzyon sonra kurulmuştur. Mitokondri fisyon aynı adımları uygulayın ancak ters yönde (Şekil 3A) olabilir. FLIP mitokondriyal matris sürekliliği değerlendirmek için kullanılabilen bir zaman atlamalı mikroskopi-bazlı yarı-kantitatif bir yöntemdirCanlı Drosophila yumurtalıklarda 9 ex vivo mitokondri nihai sigortalı durumu (Şekil 3A 3. ve 4. adımları). FLIP deneyi düzenli aralıklarla (Şekil 3A FLIP ROI) de photobleached mitokondrial matriks bir floresan molekülü ifade mitokondri ilgi alanları (ROI) küçük bir bölge olarak yapılır. Bunun bir sonucu olarak, (Şekil 3A&#39;da deney ROI) FLIP ROI ile süreklidir herhangi bir çevre mitokondriyal bölgesi nedeniyle, sürekli mitokondrial matris moleküllerin değişimi sinyali kaybeder. Burada gösterilen FLIP deneyleri, bir serbest difüze biçimde mitokondrial matris için hedef YFP ile etiketlenmiş, insan sitokrom oksidaz VIII alt biriminin mitokondriyal hedefleme sekansı ihtiva mitoYFP ifade eden Drosophila üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce rapor edildiği gibi benzer bir deney, Mito pUASP-mito-GFP transgen ile gerçekleştirilebilir &lt;sup&gt; 9. Benzer bir FLIP protokolü dış füzyonundan elde edilen süreklilik tespit edebilmek için mitokondriyal arası zar alanı hedefleyen bir prob ile kullanılabilir ancak değil, iç mitokondriyal membranlar (Şekil 3A&#39;da aşama 2) hazırlandı. <ol><li> Konfokal mikroskop görüntü elde etme yazılımı açın ve &quot;Toplama&quot; sekmesinde (Tablo 1) uygun tarama parametrelerini ayarlamak. Bireysel sekmeleri açmak için &quot;Zaman serisi&quot;, &quot;Bleaching&quot; ve &quot;Bölgeler&quot; kutuları işaretleyin. Her sekmede (Tablo 1) uygun satın alma parametre değerleri koyun. NOT: Bu deney, tek tek hücrelerin bütün mitokondriyal halktan genel sinyali izlemek için tasarlanmıştır olarak iğne deliği, açık bırakılmalıdır. </li><li> Hızlı monte eden canlı dokuda ilgi alanını bulmak için mercek kullanın. NOT: iyi cam bottome yayılır ovaryolden seçind çanak beri konfokal mikroskopi yüzen ovaryolden üzerinde gerçekleştirilemez. </li><li> &quot;Canlı&quot; seçeneğini tıklayın ilgi seçilen alanın canlı bir görüntü elde etmek için. Click canlı taramayı durdurmak için &quot;stop&quot;. </li><li> Gerekirse offset değerlerini ayarlayarak tarafından belirlenen, tanımlanan arka plan ile ( &quot;menzil göstergesi&quot; seçenek işaretlendiğinde kırmızı piksel yokluğu ile gösterilir) tespit floresan sinyal doyma seviyelerinin altında olacak şekilde toplama parametreleri, ayarlayın. </li><li> canlı tarama ile elde edilen görüntü üzerinde photobleaching bölgesini ayırmak için &quot;Bölgeler&quot; sekmesinden Bezier çizim aracını kullanarak küçük bir ROI çizin. NOT: ROI boyutu yaklaşık 20 olmalıdır - hücre içinde toplam floresan mitokondriyal sinyal% 50. </li><li> üzerine tıklayarak görüntü elde etme gerçekleştirin &quot;deney başlar.&quot; </li><li> Malzemeler (bkz floresan özel veya açık kaynak yazılımı kullanarak ölçmekTablo). tekrarlayan ağartma hedeflenen ROI ortalama sinyalini (FLIP) kaydedin; ağartma aynı hücrede gerçekleştirilmemiş ROI (Deneysel); aynı görüş alanında başka ağartılmamış hücreden YG, deney süresi (Bleaching) sırasında genel beyazlatma değerlendirmek için; ve arka plan alanı (arka) üzerine YG. Diğer ROI ortalama sinyalinden elde edilen ortalama arka plan sinyalini çıkartın. İlgili hücre için ilk ön-ağartma sinyali ile flüoresan sinyal normalize. </li><li> herhangi bir standart çizim yazılımı kullanarak normalleştirilmiş verileri çizilir. </li></ol> Floresan Mitokondriyal Boyalar 5. Canlı Boyama NOT: Kararlı durum mitokondriyal yapı ve potansiyel özellikle canlı hücrelerde ve dokularda mitokondri içine dahil boyalar kullanılarak değerlendirilebilir. Canlı Drosophila yumurtalıklar floresan mitokondriyal ile ex vivo olarak boyanabilirlekeleri (mito-ROS) üretimi mitokondriyal reaktif oksijen türlerini değerlendirmek için, mitokondri görselleştirmek için, ve birim kütle başına mitokondriyal potansiyelini değerlendirmek için. Bu mitokondriyal potansiyometrik boya tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ve mitokondriyal kütle temsil uyumlu canlı mitokondriyal leke ile birlikte boyama ile gerçekleştirilebilir (spesifik boyalar için malzemeler Tablo). <ol><li> son çalışma konsantrasyonları orta diseksiyon sıcak böcek lekeleri stokunu: mitokondriyal leke, 250 nM; TMRE, 50 nM; ve mito-ROS leke, 5 mcM. </li><li> diseksiyon ve Aşama 2&#39;ye göre yumurtalık alay sonra, diseksiyon kabına herhangi bir özel boyama çözeltisi 200 uL olarak yumurtalıkların yerleştirin. ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarılmış uygun bir kutu ile kapalı bir çanak ile 10 dakika boyunca inkübe edin. containin 3 ardışık kuyu içine forseps ile dikkatlice taşıyarak lekeli yumurtalık yıkayınleke olmadan gr orta. </li><li> TMRE ve uyumlu genel mitokondriyal leke ile birlikte boyama için, (aralarında herhangi bir yıkama adımları olmadan) genel mitokondriyal leke hemen ilk TMRE ile ve daha sonra leke için yukarıdaki protokol izleyin. </li><li> Aşağıdaki, bir poli-I-Lizin kaplı cam tabanlı çanak aşağıdaki adımı 3 yumurtalıkların monte edin ve uygun tarama parametreleri (Tablo 1) ile konfokal mikroskopi için hazırlık 4.2-4.4 adımları tekrarlayın. NOT: montaj orta lekeli örnekleri monte çalışırken dahil boyalar sinyal sürmedi. </li><li> sekmesini açmak için Z-kesit kutuyu işaretleyin. canlı-taranırken numunenin altına doğru odak tekerleğini döndürün ve en alttaki Z-bölüm tanımlamak için &quot;İlk seti&quot; üzerine tıklayın. üstteki bölümü tanımlamak için diğer yönünde odak tekerleğini hareket ederken aynı işlemi uygulayın. </li><li> üzerine tıklayarak görüntü elde etme gerçekleştirin &quot;deney başlar.&quot;</li><li> (Adım 4.7 gibi) Arka plan sinyali ROI ve tek tek hücreler artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğunu ölçme ve bir çizim yazılımı kullanılarak veri arsa. </li></ol> Drp1 Boş Mozaik 6. Nesil Not: Burada kullanılan klonal stratejisi Drp1 hiçbir mütasyon 9 genotipik heterozigotik olan bir GFP pozitif, fenotipik olarak yabanıl-tip arkaplan ve arka yeşil floresan protein (GFP) negatif Drp1 boş klonlar getirmektedir. Isı şoku kaynaklı flippase-flippase tanıma hedefi (FLP-FRT) aracılı site-spesifik mitotik rekombinasyon fonksiyonel boş drpKG03815 alleli homozigot klonlar oluşturur. Drp1 mutantını taşıyan Drosophila genotip drpKG03815 FRT40A / CYO olan ısı şoku kaynaklı FLP (hsFLP) ve UbiGFP klonal markör hsflp olan taşıyan genotip ise; ubikitin nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A / CYO. se genotipYukarıdaki genotipleri arasında çapraz seçilir ve yavrular hsFLP / + ise; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A. <ol><li> Taze gıda yeni şişeleri her 2 ila 3 gün taşıyarak bakire koleksiyonu için Drosophila eşitleyin. Gelişmekte olan bakire kadın toplamak için günlük pupariating şişeleri izleyin. </li><li> akşam bir kez sabah ve bir kez, her gün Drp1 mutant genotip gelen kırmızı gözlü, kıvırcık kanat bakire kadın toplamak ve ayrı bir şişenin içine koyun. Buna paralel olarak, erkek Drosophila koyu kırmızı gözleri ve eclosion 5 gün içinde hsflp ve UbiGFP taşıyan düz kanatları ile toplamak. </li><li> 2 erkek oranı: Bir kadın ile bakire kadın için erkek ekleyerek bir haç kurmak 1. </li><li> yumurta üretimi uyarmak için granül maya az miktarda serpin. NOT: Dikkatle döl miktarını artırmak için her 2 ila 3 gün medyanın taze flakon için Drosophila taşımak ve flakon kalabalık azaltmak için. </li><li> biresthetize, sıralama ve toplamak düz kanatlı, eclosion 5 gün içinde kırmızı gözlü kadın döl. </li><li> Isı şoku için, (ısı şoku sırasında nemi emmek için) silin, yumuşak, granül maya az miktarda ve küçük boş şişelere toplandı Drosophila yerleştirin. Esas olarak folikül hücresi klonlarını elde etmek için, 1 saat boyunca 38 ° C&#39;de bir su banyosunda Drosophila ile flakon yerleştirin ve iki kez 1 saat boyunca 37 ° C, günde 2 ardışık gün boyunca (2 ısı şoku arasında en az 5 saat sağlayan) , germline ve folikül hücre klonları hem üretmek için. NOT: Flakon tamamen fiş seviyesine kadar su batık olduğundan emin olun. </li><li> Isı şoku Drosophila hareketsiz hale getirebilir. Yine mobil olduğunda ısı ile şoklanmış Drosophila oda sıcaklığında 1 saat süre ile geri izin verin. </li><li> ortada aynı oranda kadın geri erkek ekleyin ve Mediu ile taze şişelere taşıyabilirsinizm granül maya küçük bir miktar ile serpilir. En az 5 gün süreyle Drosophila koruyun. </li><li> Canlı veya sabit deney için gerekli yumurtalıklar teşrih. Not: Ebeveyn Drosophila ifade UbiGFP izole Yumurtalık ısı şoku ile GFP-negatif klonlannın etkin indüksiyonunu teyit etmek için negatif kontroller olarak kullanılır. </li></ol> 7. Siklin E ve mitokondri için Co-immün Not: Drosophila siklin E (dCyclinE) tespit etmek için, özel olarak dCyclinE 9 karşı ortaya çıkartılan bir ticari olarak elde antikor kullanmıştır (Malzeme Tablo). Mitokondriyal işaretleyici olarak, ATP-B&#39;ye karşı bir antikor (mitokondrial ATP sintaz kompleksinin alt-birimi) 9 kullanılır. <ol><li> Sıcak% 4 paraformaldehid, oda sıcaklığına kadar (PFA), 25 ° C. Dikkat! Paraformaldehit toksiktir. NOT: Açılıştan sonraampul, PFA, 4 ° C&#39;de saklandı ve 7 gün içinde kullanılmalıdır. PFA depolama önemli ölçüde tespit sırasında mitokondrial membranlar değiştirecek metanol oksidasyonu izin verebilir, bu da, eser miktarlarda mevcuttur. </li><li> Hemen diseksiyonu sonrası, (alay olmadan) bir cam diseksiyon çanağı bir kuyunun taze PFA 200 uL onları yerleştirerek disseke yumurtalıklar düzeltin. 15 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde bir çanak tutun. 3 ardışık kuyu içine forseps ile dikkatli bir şekilde hareket 1x fosfat tamponlu tuzlu su, her biri 200 uL (PBS) ile tespit yumurtalık yıkayın. NOT: Deney burada durdurulabilir ve numuneler için 1 gün 4 ° C&#39;de bırakılabilir. </li><li> dikkatle antikor ile antijen erişimini engelleyebilir koruyucu fibröz kılıfı çıkarmak için (benzer 2.6 adıma) PBS içinde daha iyice yumurtalıkların Tease. </li><li> 0 yaptı taze 500 ul bir mikrofuge&#39;de tüp yerleştirerek alay yumurtalıklar geçirgenliği.25 rpm&#39;de sallanan ise% 5 PBS-Triton-X100 (PBS-TX) ve 30 dakika için inkübe edilir. NOT: sallanan sırasında tüpler sallanan harekete paralel yerleştirin; böylece doku kaybı ile sonuçlanan, doku tüpler kapağı sopa izin verebilir dik yerleştirerek. </li><li> PBS-TX kaldırmak için, doku tüplerin dibinde yerleşmek için izin rafa mikrofuge&#39;de tüpleri yerleştirin. Gerekirse dibine herhangi bir kayan dokuları getirmek, görsel olarak kontrol edin ve tüpler dokunun. tüplerin alt kısmında doku bozulmamış kalır emin, üstten dikkatlice çözüm aspire. </li><li> % 0.5 PBS-TX içinde eritildi,% 2 sığır serum albümininin 200 uL (BSA) ilave edilerek yumurtalıklar bloke edildi ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında rocker üzerinde inkübe edin. adım 7.5 izleyerek engelleme ajanı çıkarın. </li><li> Taze bloke edici madde, 200 uL primer antikor ekleyin: anti-tavşan dCyclinE antikoru (1: 100) ve anti-fare ATP-B antikoru(1: 100). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca rocker dokuları inkübe edin. </li><li> Aşama 7.5 ardından her biri 15 dakika için PBS-TX ile 3 kez yumurtalıkların yıkayın. </li><li> Taze PBS TX uygun ikincil antikor 200 uL ekleyin: anti-fare-Cy3 (1: 1000) ve anti-tavşan-Cy5 (1: 500). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca rocker üzerinde inkübe edin. </li><li> Aşama 7.5 ardından her biri 15 dakika için PBS-TX ile 3 kez yumurtalıkların yıkayın. </li><li> Nihai PBS-TX yıkama: (1000 seyreltme 1) DNA leke, Hoechst ekleyin. </li><li> Son olarak, 1 x 500 ul PBS doku bırakın. </li><li> 1 ml mikropipet kullanılarak, 200 ul PBS içeren bir cam kesme çanak taze kuyuya mikrofüj tüpü immüno yumurtalıkların alınması. </li><li> Bir cam slayt gliserol tabanlı montaj orta bir damla ekleme montaj ortamına tek immüno yumurtalıklar bir ekleyin. NOT: yumurtalıklar gerçekten montaj ortamına aktarılır emin olun. s yapamadığımızo doku kaybına yol açacaktır. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, hafifçe forseps ile yumurtalık opak kısmını tutarken alay iğne kullanılarak opak olgun yumurta odalarından şeffaf ovaryolden (genç aşamaları) koparmak. montaj orta olgun yumurta odaları çıkarın. </li><li> montaj orta üniform altında yayılır emin olmak için slayt ve hafifçe basın üzerinde coverglass (22 mm, No. 1) yerleştirin. NOT: coverglass basılması da coverglass boyunca doku düzgün hizalama sağlar. bu yüzden en iyi şekilde yapmak, başarısız olan dokuların optimal mikroskopi önlenmesi, küçük aşamaları montaj orta float izin verebilir. </li><li> 15 dakika boyunca örnekleri Hava kurutun ve dikkatle oje ile coverglass kenarları mühür. </li><li> Deneysel ihtiyacı (Tablo 1) göre konfokal mikroskopi gerçekleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Youle, R. J., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission,+fusion,+and+stress.">Mitochondrial fission, fusion, and stress.</a> Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).</li><li>Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fission-fusion+as+an+emerging+key+regulator+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation.</a> Bioessays. , (2013).</li><li>Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+division:+molecular+machinery+and+physiological+functions.">Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).</li><li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+functions+of+mitochondrial+fusion.">Physiological functions of mitochondrial fusion.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).</li><li>Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+nutrient+utilization+and+energy+expenditure.">Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure.</a> Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).</li><li>Hoppins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+mitochondrial+dynamics.">The regulation of mitochondrial dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).</li><li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches.">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li><li>Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRP1-dependent+mitochondrial+fission+initiates+follicle+cell+differentiation+during+Drosophila+oogenesis.">DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis.</a> J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).</li><li>Klusza, S., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+crossroads+of+differentiation+and+proliferation:+precise+control+of+cell-cycle+changes+by+multiple+signaling+pathways+in+Drosophila+follicle+cells.">At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells.</a> Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).</li><li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches.">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li><li>Parker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mitochondrial+pool+of+cyclin+E,+regulated+by+Drp1,+is+linked+to+cell-density-dependent+cell+proliferation.">A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).</li><li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase.">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li><li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia.">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+to+the+Drosophila+follicle+cell+epithelium+produces+&amp;#34;false+clones&amp;#34;+with+apparent+polarity+phenotypes.">Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces &amp;#34;false clones&amp;#34; with apparent polarity phenotypes.</a> Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li><li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila.">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li><li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis.">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li><li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+in+Drosophila:+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation.">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li><li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery.">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar Photobleaching: floresan numunelerin aşırı photobleaching önlenmesi verimli konfokal mikroskopi gerçekleştirmek için kesinlikle gereklidir. Bu nedenle, mercek aracılığıyla numune bulmak için ya da canlı tarama modu ile görüntü elde etme parametrelerini ayarlamak için kullanılan zaman photobleaching en aza indirmek için minimize edilmelidir. Doku hasarı: mitokondri hücresel sağl?...

Onlar farklılaşmış hücrelerin enerji üretiminin ana koltuklar beri Mitokondri klasik, hücresel güç merkezi olarak tarif edilmektedir. Ayrıca, mitokondri metabolizma, ısı üretimi, lipit modifikasyonu, kalsiyum ve redoks homeostazı kritik bir rol, hücre sinyal süreçlerinin orkestrasyon, vb 1 oynarlar. Mitokondri aktif bir hücre ölümü 2 indüklenmesinde rolü hem de hücre döngüsünün düzenlenmesi 3 görüntülemektedir. Böyle çok işlevsellik şu temel soruları gündeme getiriyor: a) nasıl mitokondri aynı anda tüm bu işlevleri yerine ve farklı fonksiyonlar için özel olan belirli mitokondriyal havuzları veya alt bölgeler b) vardır mı? Bu bağlamda, çok fonksiyonlu mitokondri tek tek hücrelerin içindeki şekil, boyut ve yapıda dinamik olduğu ve mitokondri kararlı durum şekil hücre tipleri arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir. Çeşitli laboratuvardan yıllarca araştırmaOratories mitokondriyal şekil, boyut, yapı ve toplu olarak adlandırılan mitokondriyal dinamiklerin değiştirilmesi, çeşitli mitokondriyal fonksiyonları 4,5,6 muhafaza etmek için çok önemli olduğunu düşündürmektedir. Bu bulgular, mitokondrinin kendi yapısal dinamizm sayesinde onların çok işlevi yerine getirmek ihtimalini yükseltmek. Kapsamlı çalışmalar mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini anlamak için çalışmalar devam etmektedir. mitokondriyal yapının hareketlilik esas olarak birbirleri ile füzyon füzyon olayları geçmesi kabiliyetleri ile muhafaza edilmektedir. Iki küçük mitokondri arasındaki füzyon daha büyük bir mitokondriyal eleman 7 içine birleştirir ise büyük mitokondri Bölünme, küçük mitokondriyal elemanları dönüştürür. Ayrıca, iki mitokondri geçici füzyon içerikleri karışmasını sağlamak için oluşabilir. İç ve dış mitokondriyal membran fizyon ve füzyon olayları dikkatle spec tarafından yönetilirIFIC proteinlerinin ayarlar. Çekirdek fisyon makine Drp1 türünü de kontrol edilebilir olsa da, belirli niyetli mitokondriyal protein (ör Fis1 ya Mff1) ile etkileşim yoluyla mitokondri sitoplazmada katılım olur Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) oluşmaktadır mitokondriyal yüzeyi 4 üzerine diğer proteinler bulunmaktadır. Drp1 dış membran üzerinde çalışmasına rağmen, onun fizyon yetenekleri yanı sıra iç zarı etkiler. dış ve iç mitokondriyal membran fisyon düzenleme tam olarak anlaşılamamıştır. Mitofusins dış zar 5 füzyon yöneten Diğer taraftan, iç membran füzyon, OPA1 faaliyetleri ile özünde yönetilir. mitokondri mücadele fizyon ve füzyon olayları dengesi bir hücrede kararlı durum mitokondriyal şeklini belirler. Örneğin, mitokondriyal fisyon bastırılması, tam ve rakipsiz füzyon neden olur mitokondri aşırı aktivitesi sırasındal fisyon mitokondri 3 parçalanmasına neden olur. mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin incelenmesi öncelikle iki ücretsiz yaklaşımları içerir: a) mitokondriyal fisyon / füzyon proteinlerinin genetik manipülasyon sonra hücresel ve organizma fenotip analizi ve b) mitokondriyal yapı ve fonksiyonunun doğrudan değerlendirmeler. Fenotipleri ikincil etkileri nedeniyle ortaya çıkabilecek genetik analizler hep, (bu durumda, mitokondriyal fisyon / füzyon proteinleri olarak) eldeki molekülün doğrudan işlevselliğini ortaya olmayabilir dikkat çekicidir. Bu nedenle, geliştirmek ve doğrudan mitokondriyal yapı ve işlevlerini incelemek için araçları kullanmak için büyük önem taşımaktadır. mitokondriyal yapının herhangi bir değerlendirme çeşitli mikroskopi araçları içerir. mitokondriyal dinamizm hem nitel hem Quantität izlenebilir beri canlı hücre floresan mikroskobu kullanımı büyük ölçüde, mitokondriyal dinamikleri çalışmalar ilerlemiştirUygun floresan mikroskopi araçları ve teknikleri 8 kullanarak ively. Floresan mikroskopi tabanlı araç vivo 9 mitokondriyal dinamizm önemini açıklık, canlı ve sabit Drosophila melanogaster dokularında mitokondriyal yapısını ve işlevini incelemek için geliştirilmiştir. Bu ve ilgili yöntemler Drosophila yumurtalık mitokondriyal yapı ve fonksiyona okuyan amacı ile, burada açıklanmıştır. Drosophila yumurtalık germarium 10,11 bulunan ilgili yetişkin kök hücrelerden ortaya çıkan tohum çizgisi ve somatik soy oluşur. Onaltı sinsityal germ hücreleri (KR) germarium (Şekil 1) ortaya çıktığını bireysel yumurta odaları oluşturmak için somatik folikül hücreleri (FC) tarafından kapsüle olsun. 16 GClerin biri bir oosit olmaya kararlıdır olsun ve kalan 15 GC&#39;ler oosit odasının büyümesini destekleyen hemşire hücrelerine dönüşebilirBu serilir önce yumurtanın olgunlaşmasını kolaylaştırmak. onlar ölümcül ön folikül hücreleri (AFCS), arka folikül hücreleri (PFC) ve ana gövde hücrelerinden oluşan bir desenli epitel hücre katmanı içine ayırt etmek için mitotik hücre döngüsü çıkmadan önce FC&#39;lerin çoğunluğu mitotik bölünmeleri 9 mermi tabi (MBCS) . birbirini takip eden yumurta odaları aynı zamanda erken gelişme FCS türetilen hücreler ayrılır sap hücreleri tarafından bağlanır. Mitokondriyal fisyon protein Drp1 tarafından düzenlenen mitokondriyal şekil aktif Drosophila over FC tabakasının 9,12 normal gelişimi sırasında farklılaşma sürecine dahil edilmektedir. Drosophila folikül hücre katmanı gelişiminde Drp1 katılımını tanımlamak için bu çalışmalarda kullanılan yöntemler burada açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Grace&#039;s Media (Insect Dissecting Medium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyde AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>MitoSox (Mito-Ros stain)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstitute and Aliquot</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Vial Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antibody (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&amp;nbsp;Glass Bottom Mircrowell Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Active Dried Yeast</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analyses software</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Macro Zoom Microscope</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono&amp;nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying mitochondrial structure and function in drosophila ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Tarif edilen yöntemler, canlı ve sabit Drosophila yumurtalık (Şekil 2B) mitokondriyal yapı ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. tarif edilen yöntemlerle elde edilen beklenen sonuçları bazı örnekler sunulmuştur. Drosophila over diseksiyonu: Daha fazla disseke zaman bütün Drosophila (Şekil 3A) kopmuş karnı (Şekil 3B) h...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries at JoVE.com

Drosophila Yumurtalıklarında Mitokondriyal Yapı ve Fonksiyonun İncelenmesi | Biyoloji | Video

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

studying-mitochondrial-structure-and-function-in-drosophila-ovaries

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Cellular Processes

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Cellular Respiration

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

23.9K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper. 

Video: Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genetik

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Gelişim Biyolojisi

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biyokimya

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Davranış

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Biyoloji

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Meyve Sineklerinde Mitokondriyal Fizyoloji ve Biyoenerjetik Analizi

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy metabolism with impairment of mitochondrial functions. Mitochondria are organelles that control both energy metabolism and cellular processes involved in cell survival and death. For this reason, approaches to evaluate mitochondrial function can offer important insights into cellular conditions in pathological and physiological processes. In this regard, high-resolution respirometry (HRR) protocols allow evaluation of the whole mitochondrial respiratory chain function or the activity of specific mitochondrial complexes. Furthermore, studying mitochondrial physiology and bioenergetics requires genetically and experimentally tractable models such as Drosophila melanogaster.
This model presents several advantages, such as its similarity to human physiology, its rapid life cycle, easy maintenance, cost-effectiveness, high throughput capabilities, and a minimized number of ethical concerns. These attributes collectively establish it as an invaluable tool for dissecting complex cellular processes. The present work explains how to analyze mitochondrial function using the Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. The pink1 gene is responsible for encoding PTEN-induced putative kinase 1, through a process recognized as mitophagy, which is crucial for the removal of dysfunctional mitochondria from the mitochondrial network. Mutations in this gene have been associated with an autosomal recessive early-onset familial form of PD. This model can be used to study mitochondrial dysfunction involved in the pathophysiology of PD.

Yazar Spotlight: Drosophila melanogaster Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonu ve Kimyasal Toksisiteyi Keşfetmek 

Here we present a high-resolution respirometry protocol to analyze bioenergetics in PINK1B9-null mutant fruit flies. The method uses the Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) protocol.

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1^B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi