Bu çalışma PD ve GL verilen bir Wellcome Trust Projesi Grant (089236/Z/09/Z) tarafından finanse edildi. SG Bir Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Doktora öğrencilikle tarafından desteklenmiştir. Biz neuroblast nucleofection değerli tavsiye için ShRNA vektör ve Jennifer Shieh tür hediye için Matthieu Vermeren teşekkür ederim.

Bu prosedür, İngiltere İçişleri Bakanlığı Yönetmeliği (Hayvan Bilimsel Usul Yasası, 1986) ile uyumludur. Bilim adamları kurulan ve kendi kurumsal ve ulusal hayvan düzenleyici kuruluşlar tarafından onaylanan yönergeleri takip etmelidir. 1.. Diseksiyon ve Rat RMS neuroblasts Ayrılma <ol><li> RMS diseksiyon ve ayrışma için gerekli çözümleri hazırlayın: </li></ol> Diseksiyon ortamı (100 mi) Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) - 98.5 mi 5 M HEPES pH 7,4-0,5 mi Penisilin-streptomisin (10.000 ünite / ml ve 10,000 ug / ml) - 1 mi Ayrışma ortamı (2 ml) HBSS - 1.760 ml Tripsin 10x (% 2.5) - 200 ul DNAse1 (1 mg / ml) - 40 ul Dulbecco&#39;nun Eagle Vasatı (DMEM) +,% 10 Fetal Buzağı Serumu (FCS) (40 mi) Modifiye DMEM -36 mi FCS - 4 mi Komple ortam (12 mi) Neurobasal orta - 11.46 ml B27 Supplement - 250 ul L-Glutamin (200 mM) - 125 ul Glikoz (45%) - 165 ul 2. DMEM +% 10 FCS ve tam orta filtre-sterilize ve bir 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde onları preequilibrate. <ol><li> Teşrih <ol><li> Servikal dislokasyon ile P6-P7 sıçan çöp (yaklaşık 12 yavru) Kurban ve makas ile başını kesmek. </li><li> Bir neşter ile beyinciğe burun orta sagital sütür boyunca deride bir anteroposterior kesi olun. Deri soyulabilir ve kafatası boyunca aynı kesi tekrarlayın. </li><li> Forseps ile yavaşça kranial kanatlara çıkarın ve dikkatli koku ampuller dahil özen, bir spatula ile beyin kaldırmak. </li><li> Beynin en kaudal üçüncü kesme ve atın. </li><li> Inci doğrayınBir doku kıyıcı kullanarak 1.4 mm kalınlığında koronal dilimler halinde e beyin dokusu. </li><li> Soğuk diseksiyon orta içeren yemekler dilimleri yerleştirin ve dikkatli bir iğne kullanılarak ayırın. </li><li> RMS bir üçgen, OB bölme merkezinde ve daha kaudal beyin dilimleri küçük bir dairesel alanı olarak yarı saydam bir alan olarak görünür. Çevre doku dahil önlemek için özen, bir mikrocerrahi bıçakla her dilimin dışında RMS kesin. P7 sıçan yavrular, genellikle (OB dahil) ~ 8 en rostral dilim RMS içerir. </li><li> Bir plastik Pasteur pipeti ile RMS parçalarını toplamak ve buz üzerinde soğuk diseksiyon orta içeren küçük bir tabak koyun. </li><li> Diseksiyon tamamlandığında, plastik bir pipet ile bir 15 ml tüp içine RMS parçaları aktarın. Tüpün alt kısmında yerleşmeye parçaları bırakın. </li></ol></li><li> Ayrışma <ol><li> Ayrışma ortamına 2 ml ile diseksiyon orta değiştirin. </li><li> Yavaşça p RMS parçaları toz haline getirinyukarı ve yaklaşık 10x P1000 pipet kullanarak aşağı fragmanı süspansiyon ipetting. </li><li> 2 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde doku parçaları ile tüp bırakın. </li><li> Tekrar 10x çözümü Pipet ve fragmanları (süspansiyon bulutlu haline gelmelidir) ayrışmış emin olunuz. </li><li> Önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS eklenerek 5 ml tripsin etkisiz hale getirirler. </li><li> 5 dakika boyunca 433 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Bu arada bir alikotu, Eppendorf tüpleri içine siRNA / DNA gerekli miktarda (genellikle 3-5 ug DNA / shRNA veya Nucleofection başına 5-9 ug oligo siRNA, ancak DNA / siRNA miktarı optimizasyon gerektirebilir). </li><li> Aşırı Ortamı çıkarın ve önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS içinde, 5 ml hafif bir pipetleme hücre pelletini. </li><li> Bir hücre sayımı gerçekleştirmek. Sıçan yavrusuna beyin başına ~ 1 x 10 6 hücre bekliyoruz. Ise 2.5 x 10 6 hücre az, her Nucleofection için gereklidiren iyi sonuçlar Nucleofection başına 3-4 x 10 6 hücreleri kullanılarak elde edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 433 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. Mümkün olduğunca orta kaldırmak için emin olun. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Önce oda sıcaklığında inkübe nöron Nucleofection çözeltisi (Fare hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen halinde veya fare) hemen sıçan hücre pelletini. Nucleofection başına 100 ul kullanın Not:. Genellikle 12 yavru sıçan çöp 4 nucleofections gerçekleştirmek için yeterli olduğunu ve bir fare çöp (12 yavru) 2 nucleofections gerçekleştirmek için yeterlidir. </li><li> SiRNA / DNA içeren her bir Eppendorf tüpüne, hücre süspansiyonu 100 ul aktarın ve bir P200 pipet ile pipetleme ile yavaşça 2-3x karıştırın. </li><li> Kabarcıklarını önlemek için dikkat ederek, nucleofectioncuvette altına örnek (cell-DNA/siRNA süspansiyon) ilave edin. </li><li> Nucleofect programı G-013 (fare hücreleri) kullanılarak ya da O-005 için (Fare hücreleri). Bir nucleofection yaklaşık 5 sn sürer. </li><li> Çabuk nucleofected örnek, önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS içinde 1 ml. </li><li> Tekrar 2.4 ve diğer tüm numuneler için 2.5 adımları. Not: En iyi sonuçlar için, tüm nucleofection işlem 5 dakika daha uzun sürmelidir. </li><li> Nucleofection kiti ile sağlanan plastik pipet kullanılarak önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS içinde 5 ml ihtiva eden bir 15 ml tüp için her bir örnek aktarın. Tüpe bir hücre kalıntıları aktarma kaçının. </li><li> 5 dakika boyunca 433 x g Santrifüj örnekleri. </li><li> Dikkatle tüm aşırı orta kaldırmak ve P20 pipet kullanarak önceden ısıtılmış DMEM +% 10 FCS 25-30 ul pelletini. Ortamın fazla 30 ul kullanmayın. </li><li> Bir p35 çanak kapağın iç tarafı üzerine bir damla olarak süspansiyonu pipetle. </li><li> (Şekil 1 &#39;e de bakınız) tam ortam 2 ml ihtiva eden p35 yemeğin kapağı ters çevirin. </li><li> De (37 ° C /% 5 CO2) inkübatör bırakkadar 7 saat için en az 5 saat ve. Daha uzun inkübasyon süresi hücre kümelerinin iyi reaggregation sağlar. </li><li> Bir kesme ucu ile bir P1000 pipet kullanarak çanak tam ortam içine kapak arasındaki asılı damla aktarın. </li><li> DNA nucleofections ve siRNA / shRNA nucleofections boyunca 48 saat boyunca 24 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. </li></ol> 3. Katıştırma <ol><li> Komple ortam (25 ml) hazırlayın ve bir kaç saat için 37 ° C /% 5 CO2 azından preequilibrate. </li><li> -80 ° C dondurucu bazal membran matris donmuş hacimde çıkarın ve soğuk odada buz çözülme. </li><li> Her sekiz 13 mm steril coverlips kadar içeren 6 cm yemek hazırlamak nucleofection için. </li><li> Ince film kaplı bir buz kutuyu yemekler yerleştirin. Bu gömme işlemi sırasında matris katılaşmayı önlemek için soğuk lamelleri tutmak önemlidir. </li><li> Nem korumak için, 15 cm çanak içinde nemli doku şeridi yer whasta gömülü neuroblasts içeren üç 6 cm yemekleri kadar tutmak için kullanılır. </li><li> 1:3 oranında çözülmüş matrise tam orta ekleyin. Örneğin, pipetleme matris 120 ul komple ortam içinde 40 ul karıştırın. Matrisin Bu miktar sekiz ila 12 mm kapak agrega gömmek için yeterlidir. </li><li> Bir 15 ml santrifüj tüpü ve at reaggregated hücre kümeleri aktarma 5 dakika boyunca 433 x g. </li><li> Aşırı Ortamı çıkarın ve tam ortam içinde 10 ul pelletini. </li><li> Her steril lamel üzerine hücre agrega süspansiyonu 2 ul yerleştirin ve matris / tam orta karışımı 18 ul ekleyin. Tüm lamel üzerine matrisi yaymak için pipet kullanın. </li><li> Hemen 15 cm tabak lamelleri içeren 6 cm çanak koyun ve 15-20 dakika boyunca (37 ° C /% 5 CO2) inkübatör bırakın. Matris katılaşmış sonra, hafifçe itmek için her 6 cm çanak alarak bakımına 5 ml tam orta eklemekBir pipet ile herhangi bir yüzen lamel aşağı. </li><li> Nöro-blastlar hücre agrega üzerinden geçiş sağlamak için 37 ° C /% 5 CO2 &#39;de 24 saat süreyle inkübe edilir. </li></ol> 4. 3D Geçiş Deneyi <ol><li> Immün için gerekli çözümler hazırlayın. <ol><li> Blok çözüm hazırlayın: Keçi bloğu çözeltisi (50 mi) Fosfat Tamponlu Salin (PBS) - 5 mi Keçi serumu - 7.5 ml % 10 Triton X-100-1,5 mi BSA - 50 mg H 2 O - 36 mi </li><li> 4 ° C&#39;de filtre ve mağaza </li><li> Sabitleme çözeltisi hazırlayın: (100 mi) çözeltisi Tespit Paraformaldehit (PFA) - 4 gr UYARI: bir başlık altında ele PFA Sakaroz - 20 g (isteğe bağlı) PBS kadar 100 ml </li><li> Sıcak bir levha üzerinde ve sabit karıştırma altında, 80 ml PBS PFA çözülür 65 ° C de muhafaza </li><li> PFA çözündükten sonra, 20 g sükroz ilave edin. </li><li> PH ayarlama7.4 (genellikle solüsyonun 100 ml başına ~ 60 ul 1 M NaOH ilave edilerek). </li><li> PBS ile 100 ml arasında bir toplam hacme kadar getir. </li></ol></li><li> İmmünoboyama <ol><li> , 24 oyuklu bir plaka içerisinde lamelleri yerleştirin. </li><li> PBS 2x ile lamelleri durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca sabitleme çözeltisi ile, RMS neuroblast agrega düzeltildi. </li><li> PBS 3x lamelleri (- sallanan bir platform üzerinde 5 dak / yıkama) durulayın. </li><li> Keçi blok solüsyonu ile 30-60 dakika boyunca engelleyin. </li><li> Keçi blok çözeltisi içinde seyreltin primer antikorlar ile 4 ° C de bir gece inkübe (Arzu edildiği takdirde, floresan phalloidin (1:400) ve Hoechst boya (1:10,000) ve ayrıca filaman tarzı aktinin çekirdekleri görselleştirmek için birincil antikor çözeltisine ilave edilebilir). </li><li> PBS 3x (5 dak / yıkama) ile lamelleri durulayın. </li><li> Keçi blok çözeltisi içinde sekonder antikor seyreltin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Coversli durulayınPBS 3x ps (5 dak / yıkama) </li><li> Montaj floresan montaj ortamı ile lamelleri ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> Geçiş Analizi <ol><li> 10X objektif kullanılarak bir floresan mikroskop ile sabit RMS neuroblast agrega görüntüler yakalayın. Bir örnek görüntüde bir ölçek bar bulunmaktadır. </li><li> , Ölçümü için ölçek kurmak ImageJ araç çubuğunda &#39;Düz çizgi&#39; aracını seçerek resimdeki ölçek çubuğu ölçmek için. </li><li> &#39;Analiz&#39; seçeneğini seçin ve &#39;set ölçekte&#39; üzerine tıklayın. </li><li> Ölçek pencerede &#39;bilinen mesafeyi&#39; ayarlanır ve tüm ölçümler için aynı ayarları korumak için &#39;küresel&#39; kutusunu işaretleyin. </li><li> Tüm agrega (Şekil 3B) yaklaşık 6 farklı sektörlerde uzak göç neuroblast için agreganın kenarından mesafeyi ölçmek için ImageJ araç çubuğunda &#39;Parçalı satır&#39; aracını kullanın. Sadece izole ag düşününanalizi için gregates. </li><li> Her bir agrega için elde edilen 6 değerlerden ortalama göç mesafesi hesaplayın. </li><li> Üç bağımsız deneyden en az her bağımsız deney sonuçları ve havuz, her durum için 10-20 agrega ölçün. Her zaman nucleofection kontrol (örn.. GFP veya bir kontrol sh / SiRNA) bulunmaktadır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Mammalian+Brain:+Significant+Answers+and+Significant+Questions.">Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adult-born+neurons+facilitates+learning+and+and+memory.">Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory.</a> Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Jin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Kim, Y., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+subventricular+zone+stem+cells+after+neuronal+injury.">Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury.</a> Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).</li><li>Massouh, M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-routing+neuronal+precursors+in+the+adult+brain+to+sites+of+injury:+Role+of+the+vasculature.">De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature.</a> Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Neuronal+Migration+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li><li>Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+migration+of+neuronal+precursors.">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Neuronal+Migration+Changes+the+Fate+of+Developing+Neurons+in+the+Postnatal+Olfactory+Bulb.">Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Battista, D., Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polysialic+Acid+Triggers+Dispersion+of+Subventricularly+Derived+Neuroblasts+into+Surrounding+CNS+Tissues.">Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues.</a> J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).</li><li>Conover, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Eph/ephrin+signaling+affects+migration+and+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone.">Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone.</a> Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).</li><li>Mobley, A. K., McCarty, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta+8+Integrin+is+Essential+for+Neuroblast+Migration+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream.</a> Glia. 59, 1579-1587 (2011).</li><li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+slits+in+the+control+of+cell+migration+in+the+rostral+migratory+stream.">Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).</li><li>Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+regulates+migration+of+olfactory+interneuron+precursors+in+the+rostral+migratory+stream+through+Met-Grb2+coupling.">Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling.</a> J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).</li><li>Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+signaling+in+postnatal+neurogenesis:+The+first+leg.">Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg.</a> Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).</li><li>Dityateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+electroporation-based+gene+transfer+into+primary+dissociated+neurons.">Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons.</a> J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).</li><li>Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Regulates+Cell+Soma+Translocation+and+the+Distribution+of+Adhesion+Proteins+in+Migrating+Neurons.">Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons.">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e2373 (2011).</li><li>Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+primary+neurons.">Nucleofection of primary neurons.</a> Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).</li><li>Causeret, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21-Activated+Kinase+Is+Required+for+Neuronal+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).</li><li>Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+knockdown+of+neuropilin-1+in+the+developing+chick+nervous+system+by+siRNA+hairpins+phenocopies+genetic+ablation+in+the+mouse.">Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse.</a> Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li><li>Ward, M., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+neuronal+migration+in+the+central+nervous+system.">Investigations of neuronal migration in the central nervous system.</a> Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Selection+for+High-Expression+Transfectants+with+a+Novel+Eukaryotic+Vector.">Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Acute+Slices+of+the+Adult+Mouse+Forebrain.">Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Vis. Exp. , e4061 (2012).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling.">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Vessels+Form+a+Migratory+Scaffold+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li><li>Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Postnatal+Electroporation+and+Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Mouse+Acute+Brain.">In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain.</a> J. Vis. Exp. , (2013).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

OB nihai konuma RMS boyunca neuroblasts göç postnatal nörojenezindeki temel bir adımdır. Ancak, bu karmaşık süreci kontrol eden moleküler mekanizmalar kadar tam olarak anlaşılmamıştır olmaktan vardır. Burada tarif edilen deney prosedürü, in vitro neuroblast göç çalışma sağlar. Biz erken doğum sonrası fare veya sıçanın 25 RMS neuroblasts izole etmek için daha önce yayınlanan bir protokol adapte var. Bir asgari diseksiyonu ve nucleofection arasındaki zaman aralığını tutmak için çok önemlidir, çünkü en iyi sonuçları elde etmek için bu, diseksiyon adım master için önemlidir. Nucleofection sonra nöro-, reaggregated edilebilir üç boyutlu bir matris içine gömülmüş ve bir 24 saat süre boyunca ilerlemesine izin verilir. Seçenek olarak ise, taşıma (örneğin imüno-veya western blot analizi) başka amaçlar için, hücreler hemen polyornithine/laminin- on Nucleofection sonra kaplı olabilir4-5 güne kadar hayatta kaplı lamelleri. Fare ve sıçan nöro benzer ölçüde Matrigel göç, ancak fare hücreleri fare hücrelerinden daha zincirleri geçirmek için güçlü bir eğilimi göstermektedir. Çalışmanın amacı bağlı olarak, nöro-floresan proteinleri veya ilgi duyulan vahşi tip / mutant proteinleri kodlayan farklı plazmitler ile nucleofected edilebilir. (CMV arttırıcı ve β-globin poli-A kuyruk ile β-aktin promoter) bir CAG promotör ile en iyi protein sentezleme plasmidleri için 26 derece tavsiye edilir. Ayrıca, siRNA veya oligos shRNA plasmidlerinin ilgilenilen hedefleri demonte nucleofected edilebilir. Etkin protein tükenmesi bağışıklık veya western blot (genellikle standart liziz tamponu 50 ul 1 sıçan yavru gömülü agregalar yokedici) ile görselleştirilebilir. Nucleofection, birincil neuroblasts transfekte edilmesi için nispeten basit bir yöntemdir vi için daha kolay ve daha hızlı bir alternatifral vektör-aracılı transfeksiyon, ve yüksek (~% 70-80) transfeksiyon verimi elde edilebilir. Bu, büyük ölçüde hücre canlılığını azaltır uzun bir süre boyunca çözelti içerisinde Nucleofection neuroblasts bırakarak bu yana, Nucleofection işlem sırasında hızlı bir şekilde çalışması için önemlidir. RMS diseksiyon ikinci ortalama hücre verimi P7 farelere kıyasla (~ 5 x 10 5 hücre / beyin) P7 fareler için nispeten düşüktür (~ 1 x 10 6 hücre / beyin) ve Nucleofection başına en az 3 x 10 6 hücre gerekmektedir % 50 verim ~ ile transfeksiyon elde etmek. Ayrıca, sıçan Nöroblastlar fare nöroblast göre nucleofection daha karşı görünür. Bu nedenle erken doğum sonrası (P6-P7) sıçan yavrular ayrıca fare ve sıçan RMS organizasyonu oldukça simi olduğunu düşünüyor, uygun bir neuroblast kaynağını temsil edebilirlar 27 ve in vitro olarak, sıçan ve fare neuroblast göç ölçüde da karşılaştırılabilir. Bu hücre morfolojisi ve göç (yayınlanmamış gözlemler) anormal etkileri önlemek için 48 saat daha uzun süre süspansiyon nucleofected neuroblasts reaggregated kümelerini tutmak için değil tavsiye edilir. Burada tarif edilen deney, 3 boyutlu bir matris (örneğin,. 24 saat) gömme sonra sabit bir zaman noktasında neuroblast göç ölçmek için kullanılabilir. Agrega boyutu ve göç mesafesi (yayınlanmamış gözlemler) arasında anlamlı bir ilişki olduğu için farklı boyutlarda agrega, analizinde kullanılabilir. Görselleştirmek ve daha neuroblast göç dinamiklerini incelemek için, zaman atlamalı görüntüleme kullanılabilir. Bu neuroblasts hızı büyük ölçüde uzun zaman noktalarında (yayınlanmamış gözlemler) azaltmak için görünür beri, gömme sonra 24 saat aralığında göç analizi yürütmek için tavsiye edilir. &lt;/ P&gt; Bu protokol için bazı sınırlamalar vardır. Viral vektörler ile enfeksiyon yetişkin neuroblasts 28 için en etkili transfeksiyon yöntemi kalırken İlk olarak, Nucleofection kadar, erken doğum sonrası kemirgen neuroblasts için kullanılabilir. İkinci olarak, in vitro göçü deneyi tam olarak, in vivo olarak gözlenen RMS karmaşık mimarisini yeniden değildir. Gerçekten de, bu tür nöro da hareketliliğini 9,29 düzenleyen katkı astrositler ve kan damarları gibi diğer RMS bileşenlerle etkileşimi eksikliği burada açıklanan deney sisteminde, in vivo meslektaşları benzer bir şekilde geçirmek için yeteneğini korumak da, 30. Bu sorun üç boyutlu kokültürü modeli sistemlerinin optimizasyonu ile gelecekte ele alınabilir. Sonuç olarak, 3D göç deneyi ile nucleofection birleştirerek daha altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için değerli bir aracı temsilneuroblast göç. Bu deneysel prosedür ayrıca in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve beyin dilim kültürlerin time-lapse görüntüleme gibi diğer yaklaşımlarla valide edilebilir neuroblast göç aday regülatörleri, rolünü değerlendirmek için bir başlangıç, hızlı ve nispeten basit bir yöntem sağlar 28,31,32 .

Yeni nöron (nöron) ve postnatal memeli beyin, nesil yaşam boyunca oluşur ve iki nörojenik nişler sınırlıdır: lateral ventriküllerin subventricular bölgesi (SVZ) ve hipokampus 1 kıvrımlarının subgranular bölge. Yapılan yeni çalışmalar, öğrenme ve hafıza görevleri 2,3 kolaylaştırmada yetişkin nöron önemli rolü olduğunu göstermiştir. Ayrıca, beyin hasarı 4-7 aşağıdaki sinir atalarıdır çoğalması ve işe kanıt nöral tamir nöron farmakolojik aktivasyon olasılığını yükseltir. Doğum sonrası nöron kesinlikle nöral progenitör proliferasyon, göç, farklılaşma, hayatta kalma ve yeni doğan nöronlar 8 final sinaptik entegrasyon dahil tüm aşamaları, düzenlenir. SVZ&#39;unda kök hücrelerinden elde edilen nöral atalarıdır (nöro) rostral göç ile büyük bir mesafe üzerinde göçişlevsel nöronlara 9 içine olgun koku ampul (OB) doğru akım (RMS). Göçmen Nöroblastlar tek bir lider süreci uzatılmış bir hücre gövdesi, ağırlıklı olarak tek kutuplu vardır. Bu hücreler bir başka 10 üzerinde kayar, toplu bir şekilde zincirleri hareket. Göç fonksiyonel nöronlar 11 içine SVZ&#39;una türetilmiş atalarıdır sonraki olgunlaşması için çok önemli bir adımdır ve dahil olmak üzere birçok faktöre ve rehberlik moleküller tarafından kontrol edilir: polisialilatlanmış nöral hücre adezyon molekülü (PSA-NCAM) 12, Ephrins 13, 14 integrinlerin, yarıklar 15, büyüme faktörleri 16 ve 17 nörotransmitörlerinin, ancak bu sürecin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Neuroblast göç düzenleyen hücre içi sinyal yollarını araştıran yetişkin nöron daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır değil sadece, aynı zamanda yeni tedavi gelişmesine katkı sağlayacakbeyin onarımı teşvik yaklaşır. Bu makale Nucleofection ve 3D göç deneyi kullanılarak in vitro neuroblast göç aday düzenleyici rolünü incelemek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Nucleofection elektroporasyon için geliştirilmiş bir yönteme göre, bir hücre transfeksiyon tekniktir. Hücre tipi özel elektrik akımı ve Nucleofection çözelti izin doğrudan hücre çekirdeği ve yavaş yavaş bölünmesi veya mitoz şeklinde memeli embriyonik ve nöron 18 gibi hareketsiz hücreleri içine transfeksiyonu izin bu DNA ve shRNA vektörler ve siRNA oligonükleotidler gibi polianyonik makromoleküllerin transferi. Bu yöntem, hızlı gerçekleştirmek için nispeten kolay ve primer neuroblasts ve nöron 19-21 dahil olmak üzere hücre tiplerinin geniş bir alanda yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu transfeksiyon ile sonuçlanır. RMS doku ayrışma başarıyla DNA / SHR ile nucleofected olabilir göçmen neuroblasts izolasyonu sağlar,NA vektörler veya siRNA oligolar ilgi genleri hedef. Nucleofection sonra, nöro damla askıdaki reaggregated ve daha sonra üç boyutlu bir Matrigel matriksi içinde gömülü. Bu koşullar, böylece neuroblast göç katılan sinyal yolları araştırmak ve bu hücrelerin motilitesi üzerinde farmakolojik tedavilerin etkisini değerlendirmek için mükemmel bir model sistemi sağlayarak, nöro-vivo gözlenen göç modu yansıtan hücre agrega üzerinden geçiş için izin verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

Lateral ventriküllerin lateral duvarında bulunan bölge subventricular (SVZ&#39;una) yetişkin nöron temel bir rol oynar. Beynin bu kısıtlı alanda, nöral kök hücreler çoğalır ve sürekli koku ampul (OB) ulaşmak için rostral göçmen akışı (RMS) boyunca zincirlerinde teğet göç neuroblasts oluşturmak. Bir kez OB, Nöroblastlar radyal göç geçmek ve daha sonra önceden var olan nöronal ağ içine dahil etmek mümkün olgun nöronların içine ayırt. Uygun neuroblast göç yenidoğan nöronlarının fonksiyonel doğru olgunlaşmasını sağlamak, nöron temel bir adımdır. Hareketliliğini yatan hücre içi mekanizmaları araştıran, beyinde yaralı alanları hedef SVZ&#39;una türetilmiş neuroblasts yeteneği verilen nöron anlayış geliştirmek değil, aynı zamanda nörorejeneratif stratejilerinin geliştirilmesini teşvik edebilir. Bu el yazması ayrıntılı açıklarBirincil kemirgen transfeksiyonu için protokol sonrası neuroblasts ve in vivo olarak gözlenen göç bunların hareket mod yansıtan 3B, in vitro göçü deneyi kullanarak motilite analizi RMS. Her iki sıçan ve fare nöro plazmid DNA, küçük bir saç tokası (sh) RNA ya da kısa RNA oligo ilgi duyulan gen hedefleme (si) müdahale ile ya Nucleofection ile hızlı ve verimli bir şekilde transfekte edilmiş olabilir. Göç analiz etmek için, hücreler, nucleofected &#39;asılı damla &quot;in reaggregated ve daha sonra üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Nucleofection başına anlamlı neuroblasts göç zarar vermez. Nucleofected ve reaggregated neuroblasts farmakolojik tedavi de neuroblast göç dahil sinyal yolları rolünü incelemek için yapılabilir.

Nöroblastomun başarılı Dissected RMS doku (Şekil 1A) izole edilir ve üç boyutlu bir matris içine gömülü olabilir. Sıçan veya fare postnatal RMS ya izole hücreler gibi doublekortin (DCX), βIII tubulin veya PSA-NCAM (Şekil 1B-C) gibi göçmen neuroblast belirteçleri için immünopozitif vardır. Ayrılmış nöro verimli DNA ile nucleofected (örn.. Bir GFP kodlayan plazmid, Şekil 2) western blot analizi ile tespit edilebilir protein azalmasını elde etmek için ya da shRNA plasmidler (Şekil 4), (Şekil 4B) ve immünoflüoresan (gösterilmemiştir) . GFP-kodlayan plazmidlerle nucleofected hücreler reaggregated neuroblast kümeleri (Şekil 3A) üzerinden radyal olarak değiştirmektedir. (Şekil 3B) gömme göreli Taşınan mesafe 24 saat yazılan Kantitasyonu GFP-varsaymak arasında göç hiçbir farklılık gösterir<html> Nucleofection başına göç bozmayan gösteren hücreler ve GFP-negatif, nonnucleofected hücreleri (Şekil 3C) ive. Doğrudan RMS eksplantlarından (veriler gösterilmemiştir) üzerinden göç nucleofected nöroblast ve neuroblasts arasındaki göç ölçüde anlamlı bir fark vardır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Şekil 1. RMS neuroblasts diseksiyonu. RMS neuroblast diseksiyonu (A) şematik gösterimi. Ayrıntılı bilgi için metne bakınız. (B) İzole sıçan RMS hücreleri göç neuroblast yapımcıları DCX ve βlll Tübülin için immünopozitif vardır. Fare RMS eksplantlarının üzerinden göç Bar, 20 mikron. (C) Hücreler göç neuroblast DCX ve PSA-NCAM işaretleri ifade. Bar, 20 mikron.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2. Fare neuroblast nucleofection. Disosiye fare RMS Nöro-blastlar, Pmax-GFP ile nucleofected reaggregated, üç boyutlu bir matris içine gömülü ve 6 saat boyunca göç bırakılmıştır. Bir reaggregated hücre küme dışına göç nöroblastomun (üst, faz kontrast resim) yüksek transfeksiyon verimliliği (alt, GFP kanal resim) gösterir. Sağ sütun panelleri sol sütun panellerinde vurgulanır ilavelerde karşılık yüksek büyütme resimleri göstermek. Barlar, 20 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:c<html> ontent-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Şekil 3,. 3D göç deneyi. (A) Rat nöro-Pmax-GFP (GFP) veya pCAG-IRES-EGFP reaggregated 22 (EV), bir matris içine gömülü ve 24 saat boyunca geçiş için sol nucleofected edilmiştir. Hücreler daha sonra sabit ve GFP (yeşil) ve βIII tubulin (kırmızı) için boyama yapıldı. Bar, 50 mikron. (B) ImageJ kullanarak göç mesafe ölçme. Reaggregated zigot 6 eşit sektöre ayrılmıştır. Kümenin (noktalı çizgi) ve uzak göç hücrenin kenarı arasındaki mesafe, her bir sektör için ölçülmüştür. Göreceli mesafe (C) miktarının nucleofected göre göç eden hücreler (GFP-pozitif) ve kontrol, nonnucleofected hücreleri (GFP-negatif) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="&lt;/ Html">Fo &quot;Şekil 4&quot;: İçerik-width = src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; genişliği &quot;6in&quot; = &quot;500px&quot; /&gt; Şekil 4. ShRNA nucleofection sonra neuroblast göçü izlenmesi. (A) Rat nöro-(aynı zamanda 23 EGFP ifade pCA-b-EGFPm5 susturucu 3) bir kontrol shRNA vektör ya da bir shRNA fascin hedef, aktin-donatılacak proteini 24 içeren aynı vektör ile nucleofected edilmiştir. Hücreler, 48 saat boyunca reaggregated matris içine gömülü ve 24 saat boyunca göç bırakılmıştır. Büyüklükleri daha sonra sabit ve GFP (yeşil) ve βIII tubulin (kırmızı) için boyama yapıldı. Bar, 50 mikron. (B) Etkili fascin tükenmesi western blot analizi ile shRNA Nucleofection 50 saat sonra tespit edilebilir. Aktin bir yükleme kontrolü olarak burada gösterilir (C) fascin tükenmesi anlamlı neuroblast göç bozar gösteren göreli göç mesafesi kantitatif analizi. (Ortalama ± SEM; ** p &lt;0.01, n = 3 bağımsız deneyler). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro at JoVE.com

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K Görüntüleme.  King's College London.  Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir. 

Video: Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Nörobilim

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...