Wir danken George Giudice und Steven Eliason für die Unterstützung menschlicher dermaler Fibroblasten und Ramesh Raghupathy für die Hilfe beim Dehnungsverfolgungsalgorithmus. Unterstützung für diese Arbeit wurde von einem U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071)bereitgestellt.

1. Schablonenvorbereitung
Bereiten Sie eine Schablone auf Parafilm vor, um die Position jeder Explant nach der gewünschten Geometrie(Abbildungen 1A und 1B) zu erstellen. Raum jeder Explant ca. 1-2 mm auseinander. Dieser Abstand entspricht einem idealen Abstand zur Erzeugung der Faserausrichtung zwischen Explants. Befestigen Sie die Schablone unter dem Bereich des Deckglases, wo die Probe mit Klebeband vorbereitet wird.
2. Sterilisation
Reinigen Sie alle Komponenten des Bioreaktors mit 70% Ethanol gründlich und sterilisieren Sie vor dem Experimentieren 2-3 Stunden unter UV-Licht. Wenn anstelle eines Bioreaktors ein alternatives Gefäß verwendet wird, sollten geeignete Sterilisationstechniken verwendet werden. Siehe Schritt 4.12 für Kommentare zur Verwendung einer Glasboden Petrischale.
3. Fibrin Gel Zubereitung
Nachdem die Komponenten des Bioreaktors sterilisiert wurden, werfen Sie eine dünne Schicht Fibringel auf die Oberfläche des Deckglases. Einzelheiten zur Herstellung von Fibrinogen- und Thrombin-Stocklösungen zur Herstellung von 6,6 mg/ml Fibringelen sind in Sander et al.beschrieben. 13 Ein ähnliches Protokoll von Ye et al. 19 zur Herstellung von 3,3 mg/ml Fibringelen können auch auf der JoVE-Website eingesehen werden.
<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von fluoreszierenden Mikroperlen in DMEM in einer Konzentration von 10 Millionen Perlen/ml vor. Die Perlen werden verwendet, um Gelverschiebungen zu verfolgen. Um diese Konzentration zu erreichen, kombinieren Sie 0,017 ml Mikroperlenlagerlösung und 0,149 ml DMEM in einem Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Sonicate diese Suspension für 10 min, um die Perlen zu zerstreuen und die Lösung zu homogenisieren.</li>
	<li>Fibrin Solution — In einem 15 ml c-Tube 0,22 ml Fibrinogen-Stammlösung mit 0,44 ml 20 mM HEPES-Puffer mischen. Fügen Sie die 0,1667 ml DMEM mit Mikroperlen in Schritt 3.1 erstellt.</li>
	<li>Thrombinlösung — In einem separaten 15 ml c-Tube 0,0328 ml Thrombin-Lagerlösung, 0,131 ml 20 mM HEPES-Puffer und 0,00246 ml 2 M CaCl2mischen.</li>
	<li>Mischen Sie die Thrombinlösung (Schritt 3.4) vorsichtig mit der Fibrinogenlösung (Schritt 3.3), indem Sie 5-10x nach oben und unten pfeifen, bis die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Vermeiden Sie das Einführen von Blasen so weit wie möglich. Um die Menge der produzierten Blasen zu reduzieren, achten Sie darauf, die Pipette beim Mischen nicht vollständig zu entladen.</li>
	<li>Die Zugabe von Thrombin bewirkt, dass die Lösung schnell geliert wird (ca. 30 Sek.). Die Mischlösung so schnell wie möglich auf das Deckglas pfeifen. Lassen Sie das Gel bei RT polymerisieren.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Bioreaktor, setzen Sie die Heizblöcke ein und schließen Sie die Thermoelemente an den Temperaturregler an. Inkubieren Sie das Gel bei 37 °C für 15-30 min.</li>
</ol>4. Zellexplant-Vorbereitung
<ol><li>Entfernen Sie das Medium aus dem T-75-Kolben, der die menschlichen dermalen Fibroblastenzellen enthält.</li>
	<li>Spülen Sie die Oberfläche vorsichtig mit ca. 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) ab, um Serumproteine zu entfernen. Fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA hinzu und brüten Sie 3 min, oder bis die Zellen angehoben haben.</li>
	<li>Nachdem die Zellen angehoben wurden, drehen Sie die Suspension in einer Zentrifuge bei 200 x g für 5 min nach unten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Volumen von DMEM wieder aus, das eine Endkonzentration von 20 Millionen Zellen/ml ermöglicht.</li>
	<li>Während sich die Zellen in der Zentrifuge drehen, trennen Sie den Bioreaktor von den Heizblöcken und den Thermoelementen. Übertragen Sie den Bioreaktor in einen Biosicherheitsschrank und entfernen Sie den Deckel nach asskeptischen Techniken vorsichtig.</li>
	<li>Erstellen Sie Explants, indem Sie 0,3 l der Zellsuspension auf das polymerisierte Fibringel pipetieren, und folgen Sie dem Muster auf der Schablone. Jede Explantation sollte etwa 6.000 Zellen enthalten. Stellen Sie sicher, dass Mikropipettespitzen mit geringem Volumen verwendet werden (0,1-10 l).</li>
	<li>Zellen absetzen lassen und 1 Stunde bei 37 °C an der Fibrinmatrix anheften.</li>
	<li>Wenn der Bioreaktor noch geöffnet ist, fügen Sie ca. 5 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 0,1% Amphotericin B und 10 mg/ml Aprotinin direkt in die Bioreaktorkammer. DMEM ist bicarbonatgepuffert und benötigt 5%CO2, um einen neutralen pH-Wert zu halten. Da der Bioreaktor nicht mitCO2versorgt wird, konditionieren Sie das Medium in einem Inkubator mit 5%CO2 für 2-3 Stunden vor Gebrauch. Aprotinin ist ein Serin-Protease-Inhibitor, der weit verbreitet ist, um die Rate des Fibrinabbaus zu reduzieren20.</li>
	<li>Den Bioreaktor wieder versiegeln. Verwenden Sie eine Spritze, um zusätzlich 5 ml CO2-konditioniertes Medium über die Stachelbefestigung am Einlassanschluss zu liefern. Geben Sie das Medium langsam ab und stellen Sie sicher, dass das gesamte Volumen der Bioreaktorkammer gefüllt ist. Entfernen Sie vorsichtig Blasen, die sich im Bioreaktor bilden.</li>
	<li>Versorgung des Bioreaktors mit frischem, um 5 %CO2-konditioniertem Medium während des gesamten Experiments, um den pH-Wert zu erhalten, Nährstoffe zu liefern und Abfallprodukte zu entfernen. Richten Sie eine Spritzenpumpe mit einer 10 ml oder 30 ml Spritze auf, die mit 5% CO2-Konditioniertem Medium gefüllt ist. Schließen Sie die Spritze direkt an den Einlassanschluss am Bioreaktordeckel mit Luer-lock-montierten sterilen Schläuchen an. Entfernen Sie die männliche Armatur und befestigen Sie den Schlauch am Stachelbeschlag am Bioreaktor (siehe Abbildung 1C).</li>
	<li>Stellen Sie die Perfusionsrate auf 0,01 ml/min ein. Verbinden Sie modifizierte Schläuche an beiden Auslassöffnungen und legen Sie die Enden in ein 100 ml Becherglas, um Abfall zu sammeln.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Laborbuchse, um die Höhen der Ein- und Auslasszuführungen so einzustellen, dass sich im Bioreaktor kein Druckdifferenzial entwickelt (siehe Abbildung 1D als Referenz).</li>
	<li>Wenn kein Bioreaktor verfügbar ist, bereiten Sie Proben in 35 mm Glasboden Petrischalen mit Glasplatten vor. Verwenden Sie eine mit einer Deckbedeckungsgröße, die für den spezifischen Satz von zu verwendenden Zielen optimiert ist. Proben, die in Petrischalen zubereitet werden, sollten in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2gehalten werden. Hinweis: Polystyrol depolarisiert Licht und stört die DIC-Bildgebung, so dass Glasplatten verwendet werden sollten, wenn DIC-Bildgebung durchgeführt wird. Phasenkontrast ist eine geeignete alternative Bildgebungsmodalität. Die Übertragung von Geschirr zwischen Inkubator und Mikroskop erschwert die Bildregistrierung. Wenn Bilder nicht ordnungsgemäß registriert sind, ist die in Abschnitt 6 berechnete Belastung nicht korrekt.</li>
</ol>5. Zeitraffer-Bildgebung
<ol><li>Nachdem die Probe vorbereitet ist, den Bioreaktor wieder versiegeln, die Heizblöcke und die Thermoelemente wieder anschließen und die Temperatur des Bioreaktors auf 37 °C einstellen.</li>
	<li>Stellen Sie den Bioreaktor auf die vom Mikroskop montierte motorisierte Stufe. Positionieren Sie das 20X DIC-Ziel unter dem View-Port. Ein niedrigeres Vergrößerungsziel ist akzeptabel, insbesondere wenn keine präzisionsmotorisierte Stufe zur Verfügung steht. Stellen Sie sicher, dass Polarisator, Analysator und Prisma alle vorhanden sind. Alternativ können Samples auch mit Phasenkontrast abgebildet werden.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware.</li>
	<li>Konzentrieren Sie das Ziel auf den Bereich zwischen den drei Explants.</li>
	<li>Speichern Sie die Koordinaten (x, y und z) dieser Position in der Bildverarbeitungssoftware.</li>
	<li>Um den gesamten Bereich zwischen und um die Explants abzubilden, wählen Sie die Option zum Abrufen eines großen Bildes und angeben der Größe der Fläche. Dies ermöglicht die Erfassung mehrerer Bilder um den angegebenen Bereich und erstellt ein gekacheltes Bild, das einen größeren Bereich des Beispiels darstellt.</li>
	<li>Stellen Sie die Belichtungszeit und die Lichtintensität auf die niedrigsten Werte fest, um den zelltoxischen Zelltod zu vermeiden, während gleichzeitig eine ausreichende Auflösung für die Unterscheidung zwischen Zellen, Mikroperlen und Fibrinfasern zur Verfügung steht.</li>
</ol>6. Strain Tracking
Einzelheiten und Anweisungen zur verwendeten Dehnungsverfolgungssoftware (Abbildung 2) finden Sie unter Raghupathy et al. 21 Der Algorithmus ist ein benutzerdefinierter MATLAB-Code, der von <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>heruntergeladen werden kann. Beachten Sie, dass DIC-Bilder oft genügend Textur für die Dehnungsverfolgung haben. Die Mikroperlen werden als Kontrolle der berechneten Dehnungsfelder einbezogen. Wenn die Dehnungsverfolgung durchgeführt wird, ist es wichtig, dass die erhaltenen Bilder genau am selben Ort aufgenommen werden, so dass die Bilder registriert werden. Nicht registrierte Bilder erzeugen falsche Belastungen.

<ol>
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Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li><li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases.">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li><li>PaszeK, M. 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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Mechanik des zellvermittelten ECM-Umbaus zu beobachten und zu quantifizieren. Solche Prozesse liegen einer Reihe von biologischen Phänomenen zugrunde und haben wichtige Auswirkungen auf das technische Gewebe2,22, die Verringerung der Narbe1,23und das Verständnis pathologischer Gewebeumgestaltung12,24. Der Einsatz der zeitrafferigen DIC-Mikroskopie ermöglicht es, die Verschiebung und Ausrichtung von Fibrinfasern, die als Folge von Zellzugkräfte...

Ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen ist das zellbevölkerte Kollagengel1,2. Das Gel bietet eine 3D-Umgebung, die näher am In-vivo-Charakter des Gewebes ist und besser zum Verständnis des Zellverhaltens geeignet ist, als es traditionelle 2D-Kulturen3bieten. Frühe Studien, in denen Fibroblasten homogen in einem Kollagengel verteilt wurden, ergaben, dass die Zellen die Kollagenfasern schnell konsolidieren und das Gelverdichten 4,5. Die kontraktilen Fibroblasten in frei schwebenden Gelen übergehen dann in einen Ruhezustand, kurz nachdem das Gel die Verdichtung vollständig erreicht hat1,6,7. Die Fibroblasten in Gelen, die an den Grenzen eingeschränkt sind, verbleiben in einem aktiven, synthetischen Zustand8 und erzeugen faseralignment in einer Weise, die von der Gelgeometrie und externen Abhängigkeiten abhängig ist5,9. Unterschiede in der Zellaktivität scheinen eine Folge der inneren Spannung (oder des Fehlens davon) zu sein, die sich entwickelt, wenn die Zellen Zugkräfte über Integrine auf die Kollagenfasern im Gel ausüben.
Eine Variante dieser Technik besteht darin, Fibroblastenexplanten(d.h. Zellklumpen) einen Abstand innerhalb eines Kollagengels zu platzieren und Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu beobachten und die allmähliche Entwicklung der Faserausrichtung zwischen den Explants (manchmal auch bänderähnliche Riemen genannt)10-12zu beobachten. Der Hauptvorteil des Explantationssystems besteht darin, dass es ermöglicht, die Zellen in einfache geometrische Muster anzuordnen, was es einfacher macht, die Mechanismen, die der zellgesteuerten Faserneuausrichtung zugrunde liegen, zu visualisieren und zu untersuchen. Diese Ausrichtungsmuster, die in erster Linie vom Zusammenspiel von Zellzugkräften, zellräumlicher Verteilung, Gelgeometrie und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängen, sind wichtig zu verstehen, da sie eine zentrale Rolle in der globalen Gewebeorganisation, der mechanischen Funktion und der lokalen mechanischen Umgebung13spielen.
Im Bereich der Tissue-Engineering, eine Strategie für die Herstellung von mechanisch funktionalen, technischen Geweben beinhaltet die Kontrolle der Faserausrichtung Muster, die aus der Zellverdichtung entwickelt, so dass das technische Gewebe besitzt Faserausrichtung, die die des nativen Gewebesimitiert 14,15. Eine solche Ausrichtung wird für technische Gewebe als notwendig angesehen, um das komplexe mechanische Verhalten nativer Gewebe zu replizieren. Eine Änderung dieser Strategie ist es, das Kollagengel durch ein Fibrin-Gel zu ersetzen16. Das Fibrin-Gel entwickelt ein ähnliches Ausrichtungsmuster wie ein Kollagengel während der Verdichtung. Im Laufe der Zeit wird das Fibrin abgebaut und durch zellsynthetisiertes ECM ersetzt, das dem anfänglichen Fibrinfaserausrichtungsmuster folgt. Das resultierende konstruierte Konstrukt hat die mechanischen Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen-Gel-abgeleiteten Konstrukten deutlich verbessert17.
Der Ausrichtungsprozess und die anschließenden Umbauereignisse in Fibringelen verlaufen auf komplizierte und schlecht verstandene Weise. Um diese Wechselwirkungen und ihre Auswirkungen auf das Zellverhalten und die ECM-Umgestaltung besser zu charakterisieren, haben wir ein Verfahren entwickelt, das auf der Explant-Methode basiert. Bei dieser Methode werden Fibroblastenexplants auf einem Fibringel in verschiedenen geometrischen Mustern positioniert. Die Gele werden in einem umweltgesteuerten, mikroskopisch montierten Bioreaktor18gehalten und der Prozess der Verdichtung und Faserneuausrichtung wird mit der Zeitraffer-Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) überwacht. Verschiebungsfelder werden mit benutzerdefinierten Algorithmen quantifiziert. Die aus diesen Experimenten gewonnenen Daten haben weitreichende Auswirkungen auf eine Reihe von Prozessen, einschließlich der Optimierung von Tissue-Engineering-Strategien, der Verbesserung der Wundheilung und der Behandlung pathologischer Gewebeumbauten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Invitrogen</td>
			<td>3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lonza</td>
			<td>DE14-701F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Probes</td>
			<td>F8858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GIBCO</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GIBCO</td>
			<td>11430-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisher-Scientific</td>
			<td>SS264-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3428-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Biotense Bioreactor</td>
			<td style="width:85px;">ADMET</td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti-Eclipe Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"># 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"># 0 35 mm Glass Top Petri Dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GTOP-0-20-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30600-65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing and quantifying fibroblast-mediated fibrin gel compaction

Zellen, die in Kollagen- und Fibringelen eingebettet sind, befestigen und üben Zugkräfte auf die Fasern des Gels aus. Diese Kräfte können zu einer lokalen und globalen Reorganisation und Neuausrichtung der Gelmikrostruktur führen. Dieser Prozess verläuft auf komplexe Weise, die zum Teil vom Zusammenspiel zwischen der Position der Zellen, der Geometrie des Gels und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängt. Um besser zu verstehen, wie diese Variablen globale Faserausrichtungsmuster erzeugen, verwenden wir die DIC-Mikroskopie (Time-lapse Differential Interference Contrast) in Verbindung mit einem umweltkontrollierten Bioreaktor, um den Verdichtungsprozess zwischen geometrisch verteilten Explants (Cluster von Fibroblasten) zu beobachten. Die Bilder werden dann mit einem benutzerdefinierten Bildverarbeitungsalgorithmus analysiert, um Karten der Sorte zu erhalten. Die aus dieser Technik gewonnenen Informationen können verwendet werden, um die Mechanobiologie verschiedener Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen, was wichtige Implikationen für das Verständnis von Prozessen in der Wundheilung, Krankheitsentwicklung und Gewebetechnik-Anwendungen hat.

Die Gewebeumgestaltung ist ein komplexer Prozess, der zum Teil durch reziproke physikalische Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden Matrix angetrieben wird. Die Zellen organisieren die umgebenden Fasern neu und erzeugen Spannung im Fasernetz. Die Ausrichtung von Fasern und mechanischer Umgebung steuert wiederum das Zellverhalten, sodass sowohl Zellen als auch Matrix global neu organisiert werden, um remodelliertes Gewebe zu erzeugen. In diesem Experiment begannen sich die Zellen der Explanten, zunächst in der ...

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Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.9K Aufrufe.  University of Iowa. Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Serie: Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Forschung

Biotechnik

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral surgery. Unlike platelet rich plasma (PRP) that is a gel or a suspension, Leukocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) is a solid 3D fibrin membrane generated chair-side from whole blood containing no anti-coagulant. The membrane has a dense three dimensional fibrin matrix with enriched platelets and abundant growth factors. L-PRF is a popular adjunct in surgeries because of its superior handling characteristics as well as its suturability to the wound bed. The goal of the study is to demonstrate generation as well as provide detailed characterization of relevant properties of L-PRF that underlie its clinical success.

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) represents an FDA cleared preparation of autologous platelet concentrates that possesses unique fibrin architecture, enriched platelets and abundant growth factors. Here, we present a protocol for chair-side generation of L-PRF as well as evaluate its mechanical properties including uniaxial testing and suture retention strength testing.

Charakterisierung von Leukozyten-Thrombozyten-Rich-Fibrin, ein neuartiges Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Forming Gigantismus Polymersome Mit Gel-unterstützte Rehydrierung

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...