Bu araştırma Hibe sözleşmesi No SAĞLIK-F2-2009-241778 için altında hibe sayısı FO 315/4- altında Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) tarafından desteklenmiştir CF.

1. Peki Tabaklar içine Endotel Hücreleri tohum <ol><li> Izdiham ulaşılana kadar, iki kez ortamı (DMEM,% 10 FCS, 50 U / ml penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin ihtiva eden) bir hafta değiştirme, T75 kültürü şişesi fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) yetiştirilir. (.; Förster ve diğerleri, 2005 21.19. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin üretimi ve ölümsüzleşme için, burek ve arkadaşları, 2012 e bakınız). </li><li> Fosfat hücrelerin yıkayın tuzlu su (PBS). PBS çıkarın ve 2 ml ılık tripsin-EDTA çözeltisi ile hücrelerin trypsinize. </li><li> Hücre tabakası dağılana kadar 5 dakika boyunca ya da 37 ° C &#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Hücrelere 8 ml kültür ortamı ekleyin. Hücreleri ayırmak için şişeyi birkaç kez dokunun. </li><li> Şişesi tam dekolmanı sağlamak için mikroskop altında hücreleri göster. </li><li> Müstakil hücreleri yukarı ve aşağı ile pipet orta. Hücre suspensi karıştırmak için girdap şişeyiüzerinde. </li><li> , Hücre süspansiyonu 20 ul alın Hemasitometre koymak ve hücrelerin sayısını. </li><li> Hücre yoğunluğu ve tohum 20.000 hücre / kuyu içine cm2 belirler. </li><li> Collagen1 hücre süspansiyonu içine aktarın, 3 ml / iyi bir toplam hacim içinde 6-esnek dipli bir kültür plakaları (57,75 cm 2) önceden kaplanmış. Her iyi 9.62 cm 2 lik bir alana sahiptir. </li><li> Birleşik kadar bir hafta boyunca 37 ° C&#39;de hücreleri büyütün. Haftada iki kez kültür ortamı değiştirin. </li></ol> 2. Önce Stretch bağlı Sakatlık hücre farklılaşması <ol><li> Farklılaşma ortamı (DMEM, serum soyulmuş fetal dana serumu (ssFCS)% 1, 50 U / ml penisilin / streptomisin içeren) ile, hücre kültür ortamı değiştirin. </li><li> 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> 3. Endotel Hücreleri esnetilebilir-kaynaklı yaralanma <ol><li> Hücre hasarı kontrol cihazı açın. </li><li> 50 msn için gecikme ayarlayın. </li><li> Regülatör basıncı 15 psi olarak ayarlayın ve kayıtlı tepe basıncı stabil hale gelinceye kadar tetiği birkaç kez basın. </li><li> Istenen değere regülatör basıncını ayarlayın. Gerilme yaralanması, çeşitli derecelerde üretmek için bir kılavuz olarak Tablo 1 kullanın. </li><li> Tepsi tutucu içine 6-iyi esnek tabanlı bir kültür plaka (57.75 cm 2) yerleştirin. De seçici doğru iyi boyutu (yani büyük bir iyi) olarak ayarlanmış olduğundan emin olun. </li><li> Sıkıca aşkın adaptörü yerleştirin. Öte yandan tetiği iter ise bir elinizle sıkıca yerine fişi tutun. </li><li> Oluşturulan tepe basıncı kaydedin. </li><li> Hemen zaman istenilen uzunlukta için 37 ° C inkübatör geri plaka koymak veya deney veya değerlendirme başarı için hemen kullanın. </li></ol> 4. Boya Alımı Testi ile Stretch Yaralanma Değerlendirilmesi <ol><li> Hücrelerin str alındıktan hemen sonra,kazınmış (adım 3.7), canlılığı leke bir 1 mg / ml solüsyon 30 ul eklediğiniz hücre kültür ortamı (Not bir sitotoksisite işaretleyici (malzeme ve ekipman ek tabloya bakınız lütfen) gibi davranır: boya çözüm 10 ul ) hücre kültür ortamı, her ml için kullanılacak. </li><li> Hücrelere boya ilavesi üzerine, hemen bir floresan mikroskobu altında görüntüle. </li></ol> 5. Laktat Dehidrogenaz tarafından Stretch Yaralanma Değerlendirme (LDH) Sürüm <ol><li> Hemen hücrelerinin (adım 3.7) gerilmesinden sonra, iyi bir hücre kültür ortamı, 200 ul çıkarın. Eğer LDH sürümü sizin soruşturma dahil etmek istiyorum her zaman noktası sonrası yaralanma için de yapın (yani örneğin 30 dakika, 1 saat, 2 saat, vb.) </li><li> Herhangi bir hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için 5 dakika boyunca bir mikro bölgesinin yüksek ayarda hücre kültürü ortamı santrifüjleyin. Süpernatantı ve sonraki adımları için kullanabilirsiniz. </li><li> Eğer h kezave adım 5.1 bitmiş ve size, araştırmak LDH tahlil kiti (malzeme ve ekipman ek tabloya bakın) dahil lizis çözüm kullanarak hücrelerin lyse istiyorum çeşitli zaman noktalarından istiyorum gerekli örnekleri almış. </li><li> Kit sağlanan bir 96-kuyu plaka her iyi tahlilinde Kitto dahil tahlil ortamı 100 ul koyun. </li><li> Deney kiti içinde yer alan bir 96-kuyu plaka iki paralel kuyulara hücre içermeyen hücre kültürü aracı maddesi içinde 100 ul koyun. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> 492 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Astrositleri, nöronlar, glial hücreler ve aortik endotel hücreler 8, 9, 22 in vitro olarak mekanik hasar etkileri incelenmiştir ve yöntem kurulmuştur. Hala kültürlenmiş beyin endotelyal hücrelerinde streç yaralanma in vitro model bilinmektedir Ancak şimdiye kadar, yoktur. Travma Hücresel modelleri hücrelerin mekanik ortamı tam 6 kontrol edilebildiğinden dolayı, hayvan modelleri üzerinde önemli avantajlar sağlar. Bu nedenle, bir kültür endotel beyin hücreleri kullanarak gerilme yaralanması ile travma için in vitro model böyle bizim protokol hediyeler yararlı olduğu ortaya çıkabilir ne gibi kan beyin bariyeri (KBB) modeli olarak hareket. Bu protokol cend hücrelerin kullanımı, laboratuvarımızda kurulu bir BBB modeli yapar. BBB arıza genellikle TBI hastalarda belgelenmiştir ve TBI genellikle ödem oluşumu 23, 24 neden olabilir BBB bozulması ile bağlantılı olduğundan, yöntem presBurada özellikle ented TBI ile ilgili olarak BBB yürütülmesinde kullanılan olabilir. Bu modelde, bu streç yaralanma derecesi hücrelerine uygulanan ne kadar dikkat çekmek için önemlidir. Hücreler, herhangi bir durumda, ve uygulanan basınç ne olursa olsun miktarı ile yaralandı kadar olarak, endotel hücreleri etkileyebilir yaralanma derecesi diğer hücre tiplerinde de son derece çok farklıdır. Aort endotel hücreleri astrositlerin veya karışık glial hücreler 9 daha yaralanma germek için daha dayanıklıdır. Diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında ek olarak, yaralanma sonrası daha hızlı onarım. Bu nedenle, beyin endotelyal hücrelerinde, özellikle cend hücreleri, streç yaralanma daha büyük bir miktarda bir yaralanma yüksek derecede üretmek için gereklidir. Bir Tablo 1 &#39;de gösterilen ilgili basınç uygulayarak yaralanma istenilen ölçüde elde olabilir. Cend hücreler için, ancak, ciddi yaralanma zorlanma onların direnci nedeniyle tercih edilir. LDH yapılan deneyler göstermiştirstreç artar derecesi olarak, daha fazla LDH süpernatanı içine salgılanır. Bunun aksine, gerilme yaralanması, düşük miktarda verilen hücreler kontrol etmek için benzer bir miktarda LDH üretti. Protokolde belirtildiği gibi, bir orta, uygun miktarda ortam miktarında bir artış veya azalma yuvalara uygulanmış tepe basıncı farklılıklara neden olabilir çünkü kullanılan dikkat edilmelidir. 45 psi basınç uygulandığında boş de 3.8 psi&#39;lik bir ortalama kaydeder Örneğin, bir sıvı de içeren 5 ml 4.0 psi ortalama bir tepe basıncı kaydeder. Bu nedenle, elde edilecek tepe basıncı istenen miktarına karşılık gelen sağlamak için iyi bir kontrolü üzerinde tetikleyici birkaç kez itmek için en iyisidir. Deneylerimizde bir canlılığı, hücre zarının geçirgenliği streç etkisini belirlemek için leke kullanılır. Kullandığımız esnek dipli kültür plakaların optik bize vi sağlarew doğrudan mikroskop altında boyanan hücrelerin. Ancak, bir doğrudan streç-yaralanma sonrası immünoişaretleme çalışmalar yapmak istediğinde, zorluklar ortaya çıkabilir. İlk olarak, plaka boyutu ve kalınlığı bazı mikroskop görüntüleme platformları ile ilgili bir sorun oluşturabilir. İkincisi, kuyunun esnek membran optik görüntüleme temizlemek için bir engel olabilir. Yukarıda belirtilen sınırlı rağmen, tarif edilen prosedüre BBB in vitro mekanik yaralanmaya için bir model olarak kullanılabilir. Travmatik beyin hasarı (TBI) olmak üzere iki bileşen, iskemi ve travma içerir. İskemi düşük kan basıncı ya da beyin sonucu çıkan ciddi kan kaybı olduğunda örnekleri TBI&#39;dan ardından beyne oksijen kaynağını şişkinlik sınırlayan ikinci bir yaralanma olarak oluşabilir. Bu yaralanma 25 şu anda başlatılan ardışık patolojik süreçleri temsil eden bir gecikmiş, Mekanik olmayan hasar olarak kabul edilir. Hipoksi bir oluşumuFrangoulis ciddi travmatik beyin hasarı sık 26 olduğunu. Oksijen glikoz yoksunluğu (OGD) güncel in vitro modeli iskemi için kullanılan bir yöntemdir. Bu nedenle, germe sonra hücreler için ikincil bir hakaret olarak OGD hücre tabi iskeminin ardından TBI sıklığı taklit edebilir. Bu nedenle, bir in vitro modelinin mevcut geliştirmek TBI ve mümkün olduğunca yakın gerçek bir TBI için in vivo olarak ortaya çıkar deseni, gelecekte daha da gerilme travması ile bir arada OGD kullanacaktır.

Travmatik beyin hasarı (TBI) dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Yaklaşık 10 milyon insan önemli bir sağlık ve tıbbi sorunu 1 yaparak TBI tarafından yıllık olarak etkilenir. Bu nedenle, in vivo ve in vitro TBI modellerinde çeşitli kurulan ve mekanizmaları 2,3,4 incelemek için geliştirilmiştir. TBI daha iyi anlaşılması, hasta tedavisi geliştirmek ve ilgili mortalite, morbidite ve maliyet azaltmak yardımcı olabilir edilmiştir. In vivo ve in vitro yöntemler hem kullanmak beyin hasarı için birçok model var. Vivo modellerde kafa travması gerçek olay taklit olabilir. Ancak, in vivo durumda karmaşıklığı, ilgi dokuya erişilebilirlik nedeniyle 2 sınırlı olur. Vurulur hasarının bir sonucu olarak, tek tek hücrelerin fizyolojik tepki anlamada, bu hücrelerin izole edilmesi önemlidir sistemik etkileri hangikendi cevap 5 inhibe veya değiştirebilir. Bu nedenle, travma hücre modellerinin hücrelerin mekanik ortamı tam 6 kontrol edilebildiğinden dolayı, hayvan modelleri üzerinde önemli avantajlar sağlar. Yaralanma Böyle bir yöntem ile oluşturulan değişikliklerini saptamak için hücreler veya dokular, mekanik yükün kullanımı istihdam in vitro sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, hücreler, mekanik hasar etkisini incelemek için bir yöntem astrositleri, nöronlar, glial hücreler ve aortik endotel hücreleri 7,8,9 kurulmuştur. Kemirgen ve bizim model için kullandığınız aynı bir basınç kontrol cihazı kullanılan insan astrosit Tepkime 10 çalışma için kurulan in vitro travma modelinde. Aynı yöntem, fare beyin mikrovasküler endotelyal hücreleri (bEnd3) 11 ve kortikal nöronlar gibi 12,13 yanı sıra, beyin endoth gerilme ile hasara yol uygulandıYeni doğmuş domuz 14 elial hücreler. cihaz böylece mekanik gerilme yaralanması 10 üretiminde de kültür alt deforme eder. Bu hücreler üzerinde hava basıncı uygulanması ile kültürlenmiş hücreler üzerinde hasar uğratan. Bu basınç, böylece hücreler uzanan, hücreler artan edildiği membran saptırmak olabilir. Streç çeşitli derecelerde (&quot;, yani&quot; düşük &quot;, orta&quot; ya da &quot;ağır) uygun şekilde hava basıncı darbe süresi ve yoğunluğu ayarlayarak elde edilebilir. Esnetilebilir-kaynaklı yaralanma Bu yöntem, in vivo 7 travması ile ilişkili olmuştur. Dahası , yaralanma bu yöntem, hücre dışı ortamın hassas kontrolünü sağlar ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir. Benzer bir yaklaşım, bEnd3 de dahil olmak üzere pek çok diğer beyin hücre türleri için kullanılabilir olmasına rağmen, bizim modeli fare beyin mikrovasküler endotel hücre (cend) oluşturulur kılan bir avantajdırLaboratuvarımızda. Bu hücre hattı, kan beyin bariyeri (KBB) bir çok uygun bir modeldir. BBB model olarak kullanılan in vitro hücre kültürlerinde onları geçirgenliği ekran olarak hizmet sağlayacak özelliklere sahip olmalıdır. KBB geçirgenliğinin bir belirleyici olarak in vitro hücre modelinde için önemli bir kriter fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi 15 sahip gerektiğidir. BEnd3 hücreleri görüntülemek rağmen farklı iğ gibi onlar yerine fibrin jel 17 düzenli tübüler yapılar daha kist benzeri boşluklar oluşturur sayede kültür 16 skuamöz morfolojisi, onlar in vitro düzensiz morfogenetik davranışlar. Ayrıca, hücreleri embriyonik ve yeni doğmuş farelere enjekte edildiğinde, bunlar ancak yeni doğmuş ve genç farelerde embriyonik mice öldürücü hızlı büyüyen tümörlerin neden olmuştur. Bu nedenle, normal endotelyal büyüme, göç, ve farklılaşma yöneten bir veya daha fazla işlem değiştirilmiş veya elimine edilmiş önerilmektedirBu hücre hattı, 18 ed. Öte yandan, endotelyal ve BBB işaretleyici ifade, biyo ve paraselüler akı ölçümlerini morfolojik, immünositokimyasal değerlendirme eden BBB modeli cend gerçekten BBB 19 uygun bir model olduğunu göstermektedir. In vivo olarak beyin endotel trans-endotel elektrik direnci (TEER) Ωcm 2 2,000-5,000 kadar olan son derece sıkı bir geçirgenliği ile karakterize edilir. Ilaç, beyin mikrovasküler bariyer özelliklerini çalışmaları için, hücreler arasında paraselüler sıkılık ve sızdırmazlık dikkate alınmalıdır. En çok beyin kapiller endotel hücreleri (BCEC), bu hücreler sergi TEER 50-100 Ωcm 2 20 arasında değişen olarak korunur. Ölümsüzleştirilmiş beyin endotelyal hücre hattı bEnd3 hiçbir büyük 15 2 Ωcm 60 den daha TEER değerleri oluşturur. Ihtiva eden ortam ile cend hücrelerinin aksine farklılaşma serum ekran azaltılmış300-500 Ωcm 2 19,21 arasında değişen TEER değerleri. Bugüne kadar, kültür beyin endotelyal hücrelerinde streç yaralanma in vitro modeller azdır. Bu nedenle, BBB modeli olarak hareket kültürlü beyin endotel hücreleri kullanarak gerilme yaralanması ile travma için bir in vitro model yararlı olduğunu kanıtlayabilir. Bu protokol, beyin hücreleri, BBB özellikle beyin mikrovasküler endotel hücreleri, TBI alınan kabul edilmiş gerçek etkisi taklit ederek bir in vitro model sunuyoruz. Bu modelin avantajı yaralanma miktarı hücreleri hem de hücre dışı ortamda kolayca deneysel kurulum kolay tekrarlanabilirlik sağlayan hassas bir şekilde kontrol edilebilir uygulanabilir olmasıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

Travmatik beyin hasarı (TBI), bir daha bu sürece dahil olan altında yatan mekanizmalar sağlayacak yöntemlerin getirdiği yüksek ölüm olayı nedeniyle tedavi etmek için yararlıdır. In vivo ve bu amaçla kullanılabilir in vitro yöntemler de vardır. Bu TBI sırasında oluşur gibi in vivo modeller gerçek kafa travması taklit edebilir. Ancak, in vivo teknikleri hücre fizyolojisi düzeyinde çalışmalar için yararlanılamaz. Bu düzenleme için, hücreler ve hücre dışı ortama daha kolay erişim sağlamak beri Dolayısıyla, in vitro yöntem, bu amaç için daha avantajlıdır. Bizim protokol beyin mikrovasküler endotel hücreleri TBI&#39;dan kullanılarak streç yaralanma bir in vitro model sunmaktadır. Bu esnek dipli bir kuyu kültürlenen hücrelere uygulanan basınç kullanır. Basınç kolaylıkla kontrol edilebilir uygulanan ve düşük şiddetli aralıkları bu hasara neden olabilir. SıçangilLaboratuvarımızda oluşturulan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) böylece benzer bir teknik istihdam diğer sistemler için bir avantaj sağlayan kan beyin bariyeri (KBB) için çok uygun bir modeldir. Buna ek olarak, yöntem, basitliği nedeniyle, deney grubu-up kolayca çoğaltılır. Dolayısıyla, bu model BBB TBI dahil hücresel ve moleküler mekanizmalarının incelenmesi de kullanılabilir.

Kollajen kültüre Hücreler ben hücre sedye cihaz kullanarak streç yaralanma çeşitli derecelerde maruz kaldılar 6-iyi esnek dipli kültür plakaları (57.75 cm 2) kaplanmış. Yaralanma hücreleri tabi sonra, hücre morfolojisi için streç bağlı yaralanma etkilerini mikroskop altında incelendi. Bu esneme gibi daha yüksek derecede hücre bozulma daha büyük bir ölçüde de gözlenebilir hücreleri (Şekil 1) uygulandı olduğu gözlenmiştir. Şekil 1A gösterildiği, yaralanma tabi değildi kontrol hücreleri hücre şişme veya bozulma dair herhangi bir gösterge olmadan düzenli olarak şeklinde serebrovasküler endotel hücreleri (cend) görünür. Gerilme yaralanması uygulandı zaman (Şekil 1B-D), deformasyon ışık mikroskobu altında gözlenebilir. 3.5-4.5 psi arasında bir tepe basıncı ile ciddi hücreleri germe sonra cend hücreler belirgin bir şekilde, geri çekilmiş ve şişmiş ile değil deforme çıktı<html> mümkün arası boşluk. Buna ek olarak, leke canlılığı (100 nM nihai konsantrasyon) alımından da streç yaralanma derecesi (Şekil 2) arttıkça artış göstermiştir. Canlılığı kullanılan leke hücrelerin plazma membran bütünlüğü tehlikeye zaman geçirgen hale sağlıklı hücrelere bir boya geçirgenliği olup. Boya gerilmiş hücreleri (Şekil 2B-D) ile karşılaştırıldığında, bu nedenle, hücrelerin sadece birkaç (Şekil 2A) ile boyandı, kontrol hücrelerinin çoğu çıkarıldı. Daha fazla hücre streç yaralanma artan derecesi ile yeşil fluoresced. Laktat dehidrogenaz yaralanma, serbest (LDH) bir biyokimyasal belirteç olarak enzimin aynı zamanda üretici talimatlarına göre incelenmiştir. Şekil artan hücre streç yaralanma artan LDH serbest neden olduğu 3 gösterir. &quot;928/50928fig1.jpg&quot; width = &quot;500px /&gt; Şekil 1. Normal vs yaralı hücrelerin ışık mikroskobu incelemesi. (A) Normal gerilmemiş birleşik hücre tek tabaka istightly dolu ve uzamış. Hücreler daha az kompakt görünür 1.8-2.0 psi (yani düşük streç) bir tepe basınç darbe uygulayarak gergin edildiğinde, boşluk oklar (B) ile gösterilir. Hücreleri orta bir 2.5-3.0 tepe basınç darbe ile yaralandı, bazıları şişmiş ve (C) deforme çıktı. Hücreleri gibi ok (D) ile gösterilen 3.5-4.5 psi, şiddetli streç ile geri çekilmiş olur. 100X büyütme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Şekil 2. Kalsiyum flüorürüNormal vs yaralı hücrelerin çeşitli teda mikroskobik inceleme yaralanma sonrası canlılığı leke 2 hr ile tedavi Hücreleri A: kontrolü gerilmemiş hücreleri BD: gergin hücreleri (B - düşük, C - orta, D - ağır).... 100X büyütme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Şekil 3,. Streç yaralanma sonrası süpernatantı laktat dehidrojenaz (LDH) enzim salınması. LDH kültür ortamına salınan gerilme kaynaklı yaralanma sonrası çeşitli zaman aralıklarında ölçüldü. LDH, toplam serbest bırakılabilir LDH (ortam artı hücre LDH) bir yüzdesi olarak ifade edildi. Değerler ± SEM bulunmaktadır. Her bir zaman noktası için n 0 saat v haricinde 5&#39;tiralue n = 3, şiddetli streç tabi tutulmuştur. Düşük ve orta streç maruz kaldılar hücrelerden LDH serbest gerilmemiş kontrollerin bundan ve birbirinden anlamlı fark yoktu. Ciddi bir şekilde gerilmiş olan hücreler 1 saat de orta uzatılmış numune hariç diğer tüm numuneler, LDH ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha büyük bir miktarda serbest bırakıldı. (P &lt;0.05, bir faktör ANOVA, Holm-Sidak yöntemi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . Tablo 1. Streç yaralanma değişik derecelerde üretmek için Kılavuzu. <table border="1"><tbody><tr><th> Regülatör Basınç </th><th> Tepe Basıncı </th><th> Yaralanma derecesi </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1.2-1.5 psi </td><td> &lt;Düşük </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1.8-2.0 psi </td><td> Düşük </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2.5-3.0 psi </td><td> Orta </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5-4.5 psi </td><td> Ağır </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Şiddetli </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro travmatik beyin hasarı modelleri in vivo beyin deformasyon yeniden geliştirilmektedir. Streç-kaynaklı yaralanma astrositleri, nöronlar, glial hücreler, aort ve beyin endotelyal hücreler için kullanılmıştır. Ancak sistemimiz in vitro TBI modelinde kurmak için BBB meşru bir modeli oluşturan özelliklere sahip bir kan beyin bariyeri (KBB) modeli kullanır.

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K Görüntüleme.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  In vitro travmatik beyin hasarı modelleri in vivo beyin deformasyon yeniden geliştirilmektedir. Streç-kaynaklı yaralanma astrositleri, nöronlar, glial hücreler, aort ve beyin endotelyal hücreler için kullanılmıştır. Ancak sistemimiz in vitro TBI modelinde kurmak için BBB meşru bir modeli oluşturan özelliklere sahip bir kan beyin bariyeri (KBB) modeli kullanır. 

Video: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Sıçan Modelinde Transkraniyal Odaklanmış Ultrason kullanarak Kan-beyin bariyeri MRG eşliğinde bozulması

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Tıp

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Çocuk Rats için Hafif Travmatik Beyin Hasarı Yeni Bir Model

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Tek ve Tekrarlayan Hafif Travmatik Beyin Hasarı İçin Bir Fare Modeli

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...