Vect-Horus mali destek Fonds Benzersiz Interministériel (FUI / MEDUL projesi) ve Vect-Horus ve Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, anlık ve PREVENTAD işbirlikçi projeler) den UMR7259 laboratuvar kabul ediliyor . UMR7259 laboratuvar ayrıca CNRS gelen ve Aix-Marseille Üniversitesi&#39;nden İşletme mali destek kabul eder.

Sıçan Astrositler 1. Üretimi Her hazırlık iki cinsiyetten 10 yenidoğan Wistar sıçanları kullanın. <ol><li> Bir makas ile kesme kafası ve bir laminer akış kaputu altında kuru bir Petri kabındaki hemen onları aktarmak tarafından fareleri kurban. Beyincik olmayan kafatası beyin çıkarın ve soğuk diseksiyon tampon içeren bir Petri kutusu içine hemen transfer: HBSS% 1 Sığır Serum Albümini (BSA endotoksin düşük seviyesi), 100 ug / ml penisilin 100 birim / mL ve streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> 2 hemisferdeki ayrı ve buz üzerinde diseksiyon tamponu ile temiz bir petri içine aktarmak için, onları yarısında beyinleri kesin. Optik sinir kesmek ve bir stereo mikroskop altında meninks çıkarın. </li><li> Soğuk diseksiyon tamponu, 50 ml yaygın kortikal parçaları yıkayın. </li><li> 15 ml Falcon tüp içine 3 beyinlerinden kortikal parçaları yerleştirin ve yukarı pipetleme ve bir darbe aşağı ayırmakEDTA, 5 dakika için% 0.02 &#39;den 37 ° C - le,% 0.05 tripsin 6 ml mavi bir ucu ile donatılmış 10 ml&#39;lik bir pipet ile birkaç kez </li><li> 24,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ilave edildi ve aşağıdaki antibiyotikler, penisilin 100 birim / mL ve streptomisin 100 ug / ml, glial hücre ortamı (GCM) adlı bir ortam, ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ekleyin. FBS toplu astrosit cutures büyümesi ve hayatta kalma için seçilmiş ve doğrulanmıştır. </li><li> , 75 cm 2 T-şişeye (T75) içine 10 mi GCM ve plaka içindeki ayrışmış hücreleri içeren pelet yeniden süspanse edin. Hücre artıkları ve DNA kaldırmak için aşağıdaki gün orta değiştirin. Bir haftada iki kez kültür ortamı değiştirin. </li><li> Çoğalma 1 hafta sonra, yavaşça GCM 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca 60 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı ile glial hücreler sallayın. T75 37 ° C nemlendirilmiş atmosfer,% 5 CO 2/95% hava ile bir inkübatör içerisine yerleştirilir edilemiyorsa, 5 mM HEPES ile ortam takviyesi. R hücreler iki kez yıkayınyapışmayan mikroglial hücreleri birikimleri temizlenmelidir. </li><li> Üç hafta sonra tohumlama, kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS hücreleri iki kez yıkayın. Sıcak,% 0.05 tripsin-EDTA% 0.02 3 ml ilave edilir, 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve hücre tabakası (genellikle 5 dakika) dağılana kadar bekleyin. , GCM 10 ml eklenmesiyle tripsin aktivitesi inhibe 8 dakika boyunca 120 x g &#39;de 15 ml Falcon tüpü ve santrifüje hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> % 90 FBS içinde astrosit pelletini -% 10 DMSO, sıvı nitrojen içinde (2 x 10 6 cryovial başına hücre) ve mağaza cryovials içine aktarın. </li></ol> Rat Beyin mikrodamarlar 2. İzolasyonu Bizim deneysel prosedürleri Marsilya Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal ve Avrupa yönetmeliklerine (AB direktifi No 86/609) uygun olan. Tüm hayvan çalışmaları acı en aza indirmek ve kullanılan hayvan sayısını azaltmak için yapılmıştır. <ol><li> Her hazırlanması için, ve bir Experimente içinr, 3, beş haftalık Wistar fareleri kullanır. </li><li> İlk hafta Pazartesi, her iki kültür steril su içinde 1 ug / cm 2 (T75 başına 10 mi), kollajen tip IV ve fibronektin ile kaplanarak 2 T75 şişeleri hazırlar. Mikrodamar tohumlama kadar 37 ° C&#39;de uygun izin verin. </li><li> Ilk hafta Çarşamba sabahı, uyuşukluk neden CO 2 artan akı altında fareleri euthanize, duruş ve nefes kesilmesi kaybı, daha sonra servikal dislokasyon ile izledi. % 70 etanol ile kafaları püskürtün. Bir makas ile başlarını kesip bir laminer akış kaputu altında kuru bir Petri kabı içine aktarabilirsiniz. </li><li> , Buz üzerinde soğutuldu ve soğuk diseksiyon tamponu ile dolu bir Petri kabı içine transfer sonra, beyincik ve optik sinirler olmadan kafatası beyin çıkarın (HBSS,% 1 BSA, penisilin 100 birim / mL ve streptomisin 100 ug / ml ile takviye edilmiş) . </li><li> Için gelen 2 hemisferdeki ve ayrı Ortabeyin ayırmak yarısında beyinleri Cutebrain. Diseksiyon tamponu ile buz üzerinde temiz bir Petri kabı içine forebrains aktarın. </li><li> Dikkatli N ° 5 kavisli forseps ile stereomicroscope altında forebrains gelen meninksler kaldırmak için soğuk diseksiyon tamponu ile yeni bir Petri kabındaki yarıkürelerinin bir çift almak. Sonra, miyelin yorgan kaldırmak ve korteksin bir kabuk elde etmek için beynin içini temizleyin. Bu adımlar doku korunması ve hücrenin hayatta kalabilmesi için en fazla 2 saat almamalıdır. </li><li> Farklı kleransların 2 havan elleri her 10 yukarı ve aşağı felç, 20 um ardından 71 mikron tarafından homojenleştiricisi dounce 7 ml soğuk diseksiyon tampon 6 ml içine 3 beyinlerinden korteks ayırmak. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, 50 ml Falcon tüpü ve santrifüj 1 ml 1 korteks eşdeğerini elde etmek için süspansiyon bölün. Süpernatant atın. </li><li> Kolajenazlar / dispaz karışımı (60 ug / ml ihtiva eden bir enzimatik R çözeltinin 1 ml&#39;si ile 1 korteksinden süspansiyon Digest11; 0.3 U / ml), DNase tip I (35 ug / ml - 20 K birim / ml) ve 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile bir çalkalama içinde gentamisin (50 ug / ml) </li><li> 1 ml 10% 25 BSA / HBSS 1X üzerine ilave edildi ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3600 x g&#39;de santrifüj ile yoğunluk bağlı ayrı 1 korteksinden sindirimi karıştırın. Dikkatli bir şekilde temiz bir 50 ml Falcon tüpü içine, üst disk (miyelin ve beyin parenkimi) ve süpernatant aktarmak ve santrifüj tekrarlayın. 4 ° C &#39;de beyin mikrodamarlar içeren elde edilen pelet Ol </li><li> Dikkatle üst disk ve süpernatant atın. Soğuk HBSS 1X 1 ml beyin mikrodamarlar ihtiva eden hem de elde edilen pelet yeniden süspanse edin ve temiz bir 50 ml Falcon tüpü içine aktarın. </li><li> 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de 20 soğuk HBSS 1X ml ve santrifüj eklenmesiyle mikrodamarlar yıkayın. Süpernatant atın. </li><li> Bundan başka, bir sh, 37 ° C&#39;de, 1 saat boyunca aşama 2.9 &#39;da tarif edildiği gibi aynı enzimatik çözeltinin 1 ml&#39;si ile 1 korteksinden mikrodamarlar sindirimiaker. </li><li> Daha sonra, bir tüp içine 3 korteks her birinden sindirilmiş mikrodamarlar karıştırmak ve bundan başka, tüp başına bir buçuk (1.5) korteks eşdeğer ekstre mikrodamarlar elde etmek için iki adet 50 ml Falcon tüpleri içine ayrı. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de soğuk diseksiyon tampon ve santrifüj 30 ml ilave edilir. </li><li> % 20 sığır trombosit bakımından yoksul plazma türevi serum, bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 ug / ml), gentamisin (50 ug / ml) ile desteklenmiş DMEM/F12, 10 ml mikro damar pelletini HEPES ve endotel hücre ortamı (ECM) olarak adlandırılan (2.5 mM), 4 ug / ml &#39;de puromisin ile takviye edilmiştir. </li><li> , Inkübatörden 2 kaplı T75 şişeleri al kaplamanın aşırı aspire ve bir T75 şişesi (T75 şişesi başına 1,5 korteksinden ekstre mikrodamar) her bir tüpten mikrodamarlar plaka. </li></ol> RBEC Primocultures 3. Saflaştırılması ve Çoğalma <ol><li> Arıtma: Çarşamba-Cuma, purom eklemekİcin kültür ortamı için 4 ug / ml &#39;de. Perşembe günü orta değiştirin. Cuma günü, Pazartesi gününe kadar 2 mcg / ml hücreleri yıkayın ve puromycin ekleyin. </li><li> Silahların Yayılmasını Önleme: ikinci haftanın Pazartesi günü, hücrelerin yıkayın ve kültürleri ikinci hafta Çarşamba günü% 90 izdiham ulaşana kadar kültür ortamına insülin, transferrin ve sodyum selenit ek ekleyin. </li></ol> . 4. Farklılaşma: In Vitro BBB Model Kurma <ol><li> Ikinci hafta, Pazartesi (üst bölmesine karışımı 500 ul iki steril kültür su içinde 0.5μg/cm 2 kolajen tip IV ve fibronektinin bir karışımı ile kaplanması ile filtreler (polietilen, 12 kuyu, gözenek boyutu 1.0 um) hazırlanması ve alt bölme içinde steril kültür su 1.5 ml). RBEC tohumlama kadar 37 ° C&#39;de uygun izin verin. </li><li> Ikinci haftanın Pazartesi, beş gün ko-kültür kuruluşundan önce, 37 ° C ve transfer cryovials gelen astrositleri çözülme10 mi GCM olan bir 15 ml Falcon. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 120 x g&#39;de santrifüje süspansiyon. </li><li> 12-çukurlu levhalarda cm2 başına 30 x 10 3 hücre yoğunluğunda GCM ve plaka içindeki astrosit pelletini. </li><li> Ikinci haftanın Çarşamba, sadece tripsin ile Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu ayrışmasından önce, DMEM/F12 ortamı ile iki kez önceden kaplanmış filtreyi yıkayın. Alt bölmeye 1.5 ml ile üst bölmesine 0.5 ml: ECM ile odaları ön doldurun. </li><li> Ikinci haftanın Çarşamba, kalsiyum ve magnezyum olmadan DPBS ile iki kez RBEC yıkayın. Tam olarak 30 saniye boyunca T75 şişesi başına 37 ° C &#39;de% 0,02 EDTA çözeltisi - sıcak tripsin 4 ml% 0.05 ekleyin. Sonra tripsin solüsyonu 3.5 ml çıkarın ve mikroskop altında görüyoruz. Hücre tabakası, matriks ayırmak tüm hücreler yüzen kadar yavaşça T75 şişenin kenarına dokunarak onlara yardım etmek başlar. </li><li> T75 şişesi başına ECM 9 ml ilave edilir ve bir 15 ml Falcon tüpü içine aktarın. Çok nazikçe hücreyi ayırmaksan bir ucu ile donatılmış bir 10 mL pipet ile aşağı yukarı 4 kez pipetleme ile süspansiyon (çözelti içinde kabarcıkların üretimi kaçının). Süspansiyon hücreleri (yaklaşık olarak 3 x 10 cells/T75 6) sayısı ve hemen bir yüksek yoğunluklu (160 x 10 3 hücre / filtre bu nedenle yaklaşık 18 filters/T75) (Şekil 8 ile önceden kaplanmış ve önceden doldurulmuş filtrelerinde plaka .) Ertesi gün (Perşembe), hücre tozu gidermek için, üst bölmenin iki orta değiştirin. </li><li> Ikinci haftanın Perşembe, ko-kültür kuruluşundan önce bir gün, bazal bölmesinden 1/3 klimalı ortam ile takviye edilebilir farklılaşma medya 1.5 ml (500 nM hidrokortizon ile ECM) tarafından astrocyte kültür ortamı değiştirin bir (endotelyal hücreler ve astrositler arasındaki temas 3 gün) ko-kültür önceki of. </li><li> Ikinci hafta Cuma farklılaşmasının gün 0 olarak tanımlanır; filtreleri conta gelen kültür ortamı değiştirinfarklılaşma medya ile Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu adencilik. Astrositler içeren kuyu içine RBEC filtreleri aktarın. Bu koşullar altında, in vitro modeller ayırt etmek ve 3 gün içinde bağlantı ile ilgili proteinleri ifade eder. </li><li> Modeller üçüncü hafta Pazartesi ve Çarşamba arasında 3 gün daha, sırasında optimum farklılaşma tutmak. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Biz, Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu saflaştırılması ve kültür, aşağıdaki ve başka karakteristik özellikleri olan BBB bir in vitro BBB modeli oluşturmak için primer fare astrositler ile birlikte-kültürler kurma, beyin, mikrokapların izolasyonu ve kaplama için bir haftalık tekrarlanabilir protokol uygulanmasını tarif eder. Başarıyla BBB vitro kültürlerinde standart kurma işleminin birden fazla sıralı aşamada bu şekilde uygun koşullar gerektirir. Modeli (a) in vitro BBB modellerin &quot;Holy Grail&quot; kalır, ve (b) efflux ve DDK mekanizmaları valide düşük paraselüler geçirgenliğini, elde etmek için optimize edilmiştir. Üretim, Arıtma ve Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu Yayılmasının RBEC yetiştirilmesi büyük sorun, farklı kültürler arasında yeniden elde etmektir. Protokol Standardizasyon dis için yüksek kaliteli araçlar gerektirirbölüm, yüksek kalite reaktif ve reaktif son kullanma tarihleri ​​saygı. Deneyci korteks yüzeyinden menenjlerin ve büyük damarların hızlı kaldırılması için stereomicroscope altında mikro diseksiyon yetenekli gerekmektedir. Beyin izole ve mekanik ayrışmış bir kez, önemli sorunlardan biri taze izole beyin mikrodamarlar optimum enzimatik sindirim olduğunu. Kullanılan enzim türü ve kalitesi çok önemlidir. Partileri arasında düşük değişkenlik yüksek konsantrasyonda kollagenazlar tip I ve II ve dispase bir karışımı kullanıldı. Ayrıca önemli enzimatik sindirme süresi ve sindirim enzim konsantrasyonu / doku ağırlık / hacim arasındaki oran vardır. Beyin mikrodamar üretiminin en iyi verimi 30 dakika ve 1 saat sırasıyla her iki sindirimler boyunca 60 ug / ml &#39;de karıştırmak dispase / kolajenlerinin 1 ml 1 beyin korteksinde eşdeğeri ile elde edilmiştir. Ayrıca, kritik hücre kirletici ortadan kaldırılmasıdırs (astrositler ve temel perisitler). Bu hücreler, endotelyal hücreler daha yüksek bir hızda çoğalır ve bu nedenle iyi bir sıkılık paraselüler sahip tek tabaka, homojen bir hücre kurulmasını engelleyen, ikincisi ile sıkı bir bağlantı yerlerine kurmak yoktur. Olmayan endotel hücreleri elimine edilir ise beyin endotelyal hücreler, mikrokapların bulunan diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında akış pompaları çok daha yüksek seviyelerde, özellikle P-gp, ifade göz önüne alındığında, bunlar, daha P-gp ligand ilaçların başka şekilde toksik konsantrasyonları tolere edebilir. Ilk iki gün için 4 ug / ml &#39;de göz mertebesinde tedavisi iyi endotel hücre saflık elde etmek için 2 ug / ml&#39; de iki gün daha izledi. Bu seçim de venüllerin, ön kılcal arteryollerin veya daha büyük kılcal gelenler karşı kılcal endotel hücreleri tercih ve sıkı tek katmanlar yol açabilir. Buna ek olarak, zayıf plazma-türevi sığır serumu kullanılmasıdır endotel hücrelerinin 47,48 saf kültürleri elde etmek için zorunludur. Plazma-derived serum düz kas hücreleri ve bu nedenle perisitlerin için, fibroblastlar için mitojeniktir trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF), yoksundur. Sıçan kuyruk geleneksel olarak tavsiye edilen kolajen tip I ile karşılaştırıldığında proliferasyon verimle bir 2-kat bir artış ile, fare ve insan fibronektin önemli bir avantaj elde edilir kollajen tip IV ün bir karışımı ile plastik ve filtrelerin tedavisinin görülmektedir. Hücre çoğalması için önemli ipuçları bu integrini ve büyüme faktörü (bFGF) aktivasyonu 49 gibi hücre dışı matriks tarafından sağlanmaktadır. Tampon konsantrasyonu ve kültür ortamının pH paraselüler sıkışma 50 üzerinde pozitif bir etkisi tarif edilmiş ve 5 mM HEPES tamponu ilavesi ile kültürler arasında daha iyi bir tekrarlanabilirlik görülmektedir. Ekle Filtreler Co-kültür Kuruluş: Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu Farklılaşma Beyin endotel hücreleri, b kezeen arıtıldı ve 6 gün için sürmektedir, bu filtreler üzerindeki kaplama olabilir. Yüksek yoğunlukta Cell kaplama mükemmel bir tek tabaka elde edilmesi için çok önemlidir. 12 oyuklu bir plaka filtre başına 160x10 3 hücrelerinin bir tohum yoğunluğu Tohumlamadan sonra konfluent tek tabaka 24 saat elde etmek için gerekli ve yeterli oldu. Ancak, çevreden primer beyin kılcal endotel hücrelerinin izolasyonu birincil hücreler ve özellikle beyin kapilar endotelial hücreler, güçlü bir şekilde ortam ile düzenlenir ve indüktif faktörler tarafından üretildiği bilindiği gibi bir BBB in vitro modelinin oluşturulması bir paradoks Farklı çevreleyen hücre türleri. Beyin kapiller endotel hücreleri tek başına hızla de-farklılaşmamaktadır kültüre ve bazı spesifik beyin endotel belirteçleri gevşek. Bu nedenle, primer endotel hücreleri, düşük geçiş (P1) kullanılmalıdır ve yeniden bağlanmış, en azından kısmen, astrositler 47,51 şartlandırılmış astrosit veya ortam ile birlikte-kültür ile çevreleriyle. Bu tutarbeyin endotel hücreleri ve astrositler olarak astrosit farklılaşması için de iki yönlü indüksiyon katılmaktadırlar. Astrositler ile RBEC kültürlenmesi interendothelial TJ 52,23 güçlü indüklenmesine yol açtı. Re-indüksiyon moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir, ve araştırma optimum endotel hücre farklılaşmasını 53,54 teşvik olabilir astrositlerde tarafından salgılanan belirli modüle faktörleri belirlemek için çeşitli laboratuvarlarda devam etmektedir. Lösemi inhibe edici faktör (LİF) de dahil olmak üzere beyin endotel hücreleri tarafından salgılanan faktörler astrositik 55,56 farklılaşmasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Ko-kültür kurulması önce, astrositler, glukokortikoid reseptör agonisti hidrokortizon içeren farklılaşma ortama maruz kalan ve ko-kültür ortamı kıvamlandırılmıştır. Hidrokortizon beyin endotelyal hücrelerin sızdırmazlığını artırmak için bilinen ve özellikle 57 sıçan ve fare 58,59 endotel hücreleri BBB modelleri kullanılır. Koşullandırılmış medium 3 gün sonra endotel hücre / astrosit ko-kültür sisteminin alt bölme toplandı ve daha sonraki kullanım için dondurulur. Ko-kültür şartlandırılmış ortamın kullanılması, 2 gün daha uygun paraselüler geçirgenliği ve kültürler arasında da geliştirilmiş yeniden üretilebilirlik ile 3 gün için endotel hücre farklılaşmasının süresi azalır. Genel olarak, tarif protokol, 0.26 ± 0.11 x 10 cm -3 en birincil hücre bazlı BBB modelleri 22 &#39;e benzer / dakika, 300 ohm üzerinde yeniden üretilebilir bir Teer · cm 2 ve ortalama bir paraselüler geçirgenlik katsayısı Pe (LY) verir 12. Biz mikrodamar enzimatik sindirme önerilen modülasyonu ile, bu metin içinde tarif protokol sıçan omurilik 60 ve farenin beyninden endotel hücrelerine uzatılabilir. Moleküler ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Buna ek olarakTJ indüksiyon, astrositlerin, aynı zamanda, endotelyal hücreler, beyin 61&#39;deki P-gp olarak akış nakil ekspresyonuna katkıda bulunur. Gerçekten biz BBB modelinde akış taşıyıcı P-gp ifadesini göstermektedir ve biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak, P-gp akış pompa lokalizasyonu polaritesini göstermek ve P-gp etkinliğinin işlevsel tahlili kullanılarak. GLT-1 ifadesi, mikrokapların bazal zar fraksiyonu içinde tespit edilmiştir, ancak kültürlenmiş Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu bulgulanmamıştır. Biz GLT-1 aşağı in vivo koşulları ve western blot analizi ile tespit edilemeyen dolayısıyla ile mukayeseli olarak RBEC kültürde düzenlenmiştir varsayımında. Fazla glutamat nörotoksik olduğu ve in vivo, GLT-1 apikal bölmeye (kan dolaşımı) bazal bölme (parankima) glutamat akışı için sorumludur. Astrosit kültürlerde, GLT-1 ifadesi çok düşüktür ve ortam 62,63 glutamat ilavesi ile indüklenir. Ayrıca confIRM gibi LRP1, LDLR ve TfR olarak apikal membran akını taşıyıcıları ifadesidir. TfR ve LDLR işlevselliği, daha önce in vitro modelinde BBB 64 içine büyük baş hayvan ile gösterildiği gibi, tek tabaka abluminal tarafına luminal den Tf-Cy3 ve DiLDL arasında bağlanma deneyleri ve nakil ile gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, bu lipid astrositlerden şartı 65,66 bundan başka, in vitro olarak da dahil olmak üzere, astrositler ve beyin endotel hücreleri arasındaki çapraz-karışma teyit fizyolojik beyin kılcal endotel hücreleri üzerinde LDLR ekspresyonunu arttırır gösterilmiştir. Floresan boyalar ile taşıma örneklemek için seçmiş bu Cy3 ve DII spektroflorimetrik analiz laboratuvarlarında en mevcuttur, ve in vitro BBB modelleri doğrulamak için yararlı olduğunu düşünüyor gibi. Bununla birlikte, floresans, radyoaktivite ölçümü daha az duyarlıdır ve önemli verileri elde etmek için deneyler sayısında bir artış gerektirir.İdeal olarak, Tf ve LDL bu tür bir bağlanma / alım ve nakil deneyleri için (genellikle iyot 125), radyo etiketlenmiş bulunmaktadır. Ayrıca önerilen protokol ile elde edilen farklılaşmış endotelyal hücre tek-tabakalı CCL2 serbest bırakılması ve BBB açılmasıyla ortaya koyduğu gibi, TNF-α neden olduğu inflamasyon yanıt olduğunu göstermektedir. CCL2 (MCP-1) ve onun reseptörü CCR2 multipl skleroz, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) 67, CNS travma 68 ve nöroenflamatuar koşullar altında 69,70, CNS içine lökosit göçü mediatörleri olarak bilinmektedir CNS patolojilerde rol oynar. BBB açılış CCL2 konsantrasyonu üst (apikal) ve alt (bazal) bölmeleri hem arasında dengelenmesini sağlar, çünkü test protokolü ile, CCL2 bir polarize salgılanması üzerinde sonucuna varamayız. Sonuç olarak, açık bir şekilde, 24 saat (Şekil 5A) de apikal bölmeye Birleşik Devletler Topluluğu Bürosu tarafından üretilen CCL2 miktarını hafife. Genel Bakış ve in vitro Modeller BBB Sınırlamalar: Ben n Vivo karşı İn Vitro ve Kemirgen İnsan Karşılaştırmalar karşı In vitro BBB pasajda etkili olduğu pek çok umut verici bir merkezi sinir sistemi ilaçları, genellikle insan dışındaki türlerden izole edilmiş hücrelere göre BBB vitro modellerde ikinci nedeniyle tahmin eksikliği klinik çalışmalarda başarısız oldu. Protein ağları, sinyal iletimi, taşıyıcı ve reseptörlerin mekanik yönlerini okuyan geldiğinde bizim bilgimiz için, in vitro BBB modeller muhtemelen daha akıllı olan. In vitro olarak incelenecek her bir mekanizma, yol ya da hedef aynı hayvan türleri tamamlayıcı çevresel etkilere (diğer hücre tipleri, kimyasal maddeler, proteinler) tarafından düzenlenmesi için karakterize edilmiş ve in situ çalışmalar için kombine edilmelidirVe kısıtlamalar ve dikkatli insanlar izole mikrodamarlar ve endotel hücreleri ile, olası aşağıda uyarılmış zaman. In vitro BBB modeller vücut yönetmelik izole otonom sistemleri olarak görülebilir, ancak hala önemli in vivo özellikleri ve çevresel uyaranlara tarafından düzenlenmesi için bir potansiyele sahip. Endotel hücre mono tabakaları nöro-vasküler glia birimi (NGVU) önemli bileşenleri bir dizi eksikliği ve kan ve vücut düzenleme izole edilir çünkü hiç &quot;ideal&quot; in vitro modelle BBB henüz 71,72,73 önerilmiştir. Perisitlerin 74,16 veya 17,18 nöron ya da plastik kaplama veya endotelyal göre en yaygın ve &quot;kolay hale&quot; in vitro BBB modellerde hücre büyümesi için kullanılan kültür ortamı ve serum için kullanılan hücre dışı matrisin farklı bileşenlerin eksikliği astrositler ile farklılaşmış hücreler protein sentezleme i modüle edebilirn in vivo durumda 75 ile karşılaştırılması. Bu modeller in vivo görüntülenen birçok taşıyıcıları ifade, ama hepsi olabilir. Bazı durumlarda, ilk izole edilmiş taşıma parametreleri kılcal (in vivo duruma yakın) olarak teyit edildi ve sonra da hücre kültür sistemleri 76,61 incelenmiştir. Moleküler biyoloji araştırmaları izin verdi, aynı türlerden izole edilmiş kılcal ve düşük geçiş endotel hücre kültürlerinde, gen ekspresyonu ve protein karakterizasyonu ve farklı türler arasında, çoğu zaman, kemirgenler (fareler ve sıçanlar) ya da inek ve domuz küçük hayvanlardan İnsanlarda 77,78,75,15 için karşılaştırılması. In vivo ve in vitro beyin mikrovasküler endotel hücreleri arasında Transkriptomik karşılaştırma farklı şekilde eksprese edilen ve en sık önemli in vitro olarak azaldı çok sayıda gen transkript gösterdi. Böyle TfR ve pr olarak akını taşıyıcıları kodlayan transkriptvezikül ticareti karıştığı oteins esas hücrelerde endositoz ve veziküler taşımacılığında genel bir azalmayı işaret kültürlenmiş beyin endotelyal hücrelerinde aşağı regüle edilir. Saflık (puromycin tedavisi) ve hidrokortizon ile tedavi açısından Kültür manipülasyon bir daha &quot;in vivo gibi&quot; gen ekspresyon profil 77 geri yardımcı olabilir. Transkriptomik çalışmaları da., Insan endotel hücreleri ve astrositlerde ko-kültür içeren In vitro BBB modelleri 15 tarif edilmiştir ayrıca in vitro BBB modellerinde 75 kemirgeninizde dayalı insanlarda ilaç alımı hakkında tahminler karmaşık türler arasında önemli farklar saptandı. Ilgili olsa da post-mortem insan dokusuna düzenlenmiş erişim gerektiren ve heterojenite yaş, hastalık, ve muhtemelen tıbbi bağlı olarak, insan beyin endotel hücreleri kalite / özelliklerinde olduğu gibi bu modeller, düzenli olarak uygulanması daha zordur treatmendonörlerin t. Çabalar iyi fizyolojik, anatomik ve in vivo BBB fonksiyonel özelliklerini yeniden yeni in vitro modeller geliştirmek için yapılması gerekir. Üç hücre tiplerini içeren Co-kültürler derece kısıtlayıcı ve rutin uygulamak zor görünür. Bugüne kadar, en karmaşık in vitro BBB modeller, astrositler ile damar benzeri organizasyon içerir ve kan akışını taklit eden 75,79,80,81,82 ortamının akışı dahil dinamik modelleri, in vitro (DIV-BBB) olan 83,84,85. Beyin endotel hücreleri bir akışına maruz kaldıkları zaman, üretilen kesme gerilmesi örneğin hücre bölünmesi, farklılaşması, migrasyonu ve apoptoz 80 gibi endotel hücre fizyolojisinde alan farklı genlerin ekspresyonunu modüle eden hücre yüzeyinde mechanotransducers aktive eder. In vivo, kesme stresi kan akışı ile üretilen bir kurulmasına izin veren hücre temas okuyun, mitotik tutuklama sorumludurkan damarlarının 80 endotel hücre tek-tabakalı. Normal insan beyin mikrovasküler endotelyal hücrelerin genomik ve proteomik analiz BBB endotel fizyolojisi 84 kesme geriliminin etkisini gösterdi. Kesme gerilmesi CYP450 tarafından aracılık edilen 75,86, 75 oksidasyon enzimleri ve hücre canlılığı, endotel hücre yapışmasının daha yüksek bir derecede, dışarı verme pompası indüksiyon ve taşıyıcıları 75, glikoz metabolizmasının düzenlenmesi ve daha iyi bir polarizasyon sorumludur ifadesini arttırarak paraselüler geçirgenliğin düzenlenmesinde occludin ve ZO-1 87,75,80 ve buna bağlı olarak yüksek TEER gibi arası bağlantı elemanları kodlayan genlerin yaklaşık 1,500 - 2,000 cm ohm · 2, in vivo olarak bilinen en yakın 79,80 parametreler Biyoteknoloji ve ilaç sektöründe, ilaç ya da yüksek verimli tarama (HTS) ve hayvan deneylerini azaltma çabalarının rutin tarama, ledset-kadar rutin daha zor olmaya devam beyin endotel hücreleri birincil kültür yerine kullanılmak üzere, farklı hücre çizgilerinin geliştirilmesi için. Çoğu durumda, beyin endotel hücrelerinin primer kültürleri, retroviral vektörler 88,89,75 kullanılarak plazmid DNA ile transfeksiyonu veya enfeksiyon yoluyla, ölümsüz bir gen (ya da SV40 polyoma virüsü, büyük T-antijeni veya adenovirüs E1A) ile transduse edilmiştir. Serebral kökenli çeşitli endotel hücre çizgileri gibi RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS veya rBCEC4 fare hücre çizgileri 88,75, b.End3 fare hücre hattı 90,75, PBMEC/C1 olarak geliştirilmiştir - 2 domuz hücre çizgisi 87,75 ve hCMEC/D3 insan hücre hattı 89,75. Diğer modeller, Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) veya CaCo2 hücresi çizgileri 12,75 olmayan serebral kaynaklı hücreler dayanmaktadır. Farklı insan beyin endotel hücre çizgileri arasında, yaygın olarak alıntı hCMEC/D3 edilmiştird ve 2005 91,92 yılında kuruluşundan bu yana BBB bir model olarak geliştirilmiş. Birincil kültürler, hücre çizgileri bu avantaj ve sınırlama gibi. Bu, primer kültürlerinde daha işlemek için daha kolay olan uzun bir ömrü vardır, iyi karakterize edilmiştir ve büyük ölçekli deneyler arasında yeniden izin verir. Ancak, hücre hatları, dokuya özgü işlevler vermek çevre düzenleme kaybeder ve in vivo 75, 89 hücrelerden oldukça farklı bir molekül bir fenotip elde edebilirsiniz. Özellikle, hücre hatları mevcut azaltılmış sızdırmazlık, düşük TEER ve gösteri taşıyıcı profil varyasyon 75,89 üretilen tekkatmanları. Böylece primer hücrelerde hayvan deneyleri ya da çalışmalar genellikle katma karmaşıklığına rağmen tercih edilir.

Santral Sinir Sistemi (MSS) tedavisi için geliştirilen birçok ilaç bozuklukları tedavi ilgili konsantrasyonlarda beyin parankimi ulaşmak mümkün değildir. BBB patojenik ajanlar, plazma bileşimin dalgalanmadan beyin sinir dokuları korur, ve beyin 1 ve dışarı iyonları, peptidler, proteinler ve hatta hücre spesifik olmayan akı kısıtlayarak, beyin parankimasının homeostazı tutar. BBB özellikleri nöronlar gibi özel bir sınıf mikrovasküler beyin endotel hücreleri ve nöro-glia-damar biriminin komşu elemanlar (NGVU) arasında iyi bir yakınlık ve çapraz konuşma ile indüklenen ve korunur, glial hücreleri (daha kesin astrosit sonuna m), perisitler ve kolajen tip IV, fibronektin, laminin ve proteoglikanlardan oluşan 2,3 esas bazal membran içinde ensheathed. Kılcal düzeyde endotel% 32 ve önemli bir oynar - perisitler yaklaşık 22 kapakendotel çoğalma, anjiyojenez ve enflamatuar süreçlerin düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Endotel hücreler, kılcal damarların iç yüzeyini kaplayan sürekli bir tabaka oluşturur. Bunlar, apikal bölgede bir kayış benzeri bir yapı oluşturmak ve bu kutuplaşma hücre katkı TJs, birbirine bağlanır. Astrositler BBB özelliklerini düzenlemek ve bu tür TGF-β, GDNF, bFGF ve IL-6 gibi önemli bir düzenleyici faktör kaynaklarıdır. Eksik işlevselliği ile GFAP&#39;ye defıcient Astrositler BBB özelliklerini 4 düzenlemek mümkün değildir. Nöronlar doğrudan BBB oluşumuna yapısal olarak dahil değil, aynı zamanda protein ekspresyonu ve BBB fonksiyonları 5 yönlerini düzenleyen önemli değildir. Ayrıca BBB yapısı, fizyolojisi ve patolojisi incelemek amacıyla, BBB in vitro modelleri araştırma aracı olarak da geliştirilmiştir. Beyin endotel hücreleri göre BBB vitro modellerde uygulamak için çeşitli türlerden ekstre edilmiştirsığır, 6,7 ikinci düşük geçiş primer kültürleri, 8,9 domuz, sıçan 10,11,12, 13 fare ve insan 14,15 on. Bu model in vivo BBB, taklit bilinmektedir özellikle sıçan veya fare ve / veya perisitlerin 16,12 ikinci glial hücreler ve / veya nöral projenitör hücre türetilmiş astrosit 17 ve / veya 18 nöronlar ile birlikte kültürlenmiştir. Bu in vitro / in vivo deneyler ve karşılaştırma ve / veya transgenik model 19 üretilen beyin endotel hücrelerinin çalışmaya izin verir, çünkü &quot;laboratuar&quot; modelleri genellikle kemirgenler üretilmektedir. Yeni vitro BBB modellerde geliştirilen de önce in vivo test 15,20,21,3,6,22,11,23 potansiyel MSS ilaç adaylarının beyin alımını tahmin yardımcı olmak için tasarlanmıştır. In vitro BBB modeller genellikle karşılaştırmak için kullanılır CNS&#39;ye i) bilinen ya da nüfuz l ile: ile ilaçların nakilBBB ve merkezi etkileri karşısında ow geçirgenliği, ve ii) aynı türün hayvan modellerinde ölçülen aynı ilaçların belirgin Pe. Kolayca BBB geçmek ilaçlar çoğunlukla lipofiliktir ve lipid-aracılı serbest difüzyon (kafein, karbamazepin, vb) tarafından beyin endotel hücre zarlarını. Böyle digoksin, verapamil veya siklosporin A gibi olumsuz taşınan ilaçlar aktif P-gp olarak beyin endotel efflux taşımacıları tarafından uzatılır. Bununla birlikte, yeni geliştirilmiş terapötik moleküllerin gibi pek çok bir araya getiren proteinler, siRNA&#39;lar ya da monoklonal antikorlar gibi Biopharmaceuticals vardır. Belirli bir nakil i) yokluğunda ve paraselüler geçit geçiren, yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin önlemek endotel hücreleri, ii) sıkıca paketlenmiş tabakasının: Çoğu nedeniyle BBB çapraz yoktur. Bu sınırlar ile, &quot;Truva atı&quot; stratejiler i, BBB bilinen reseptörlerine karşı vektörleri (antikorlar, peptidler) içeriyordu kullanılarak hayata geçirilmiştirn reseptörünün transferin (Tf) reseptörü (TfR), insülin reseptör (IR), veya LDL reseptör (LDLR) bağlantılı reseptör ailesi (LDLR, LRP1) üyeleri olarak ya da taşıma transsitoz (RMT), aracılık etmektedir. Bu reseptörler vivo 24,25 izole beyin kılcal ve BBB bulunmuştur. Bu reseptörler için transkripsiyonel profilleri, özellikle LDLR ailesinin olanlar, analiz ve co-kültürlenmiştir doğrudan beynin 26 kendi çekimi sonrası astrositler ile veya beyin kılcal beyin endotel hücreleri ve endotel hücrelerinin beyin arasında karşılaştırıldı. Pardridge 24 insülin alıcısının ve insülin büyüme faktörü reseptörü 27,28 karşı antikor, ardından transferrin reseptörü (TfR) karşı OX-26 antikoru ile alan açıldı. Bu antikor bazlı vektörlerle, ArmaGen Teknolojileri BBB 29 karşısında, proteinler de dahil olmak üzere, uyuşturucu sunmak için bir BBB moleküler Truva atı platformu teknolojisi geliştirdi.Literatür LRP1 beyin endotel hücreleri içinde ekspresyonu ve bir güçlü endositik / çöpçü reseptör olarak rolünü gösteren verileri açısından zengindir. Western blot analizi LRP1 beyin kılcal zenginleştirilmiş fraksiyon ve fare beyin kılcal endotel hücreleri 30 olarak ifade edilir olduğunu ileri sürdü. Böyle BBB 31 karşısında etkili ilaç akını teşvik aprotinine türetilmiş peptid vektörleri ile Angiochem hedef LRP1 gibi şirketler. Ancak, LRP1 ayrıca aktif Aβ taşınması ve beyin parankiminde kan 32 onun effluks / boşluk yer almaktadır. Bu veriler ligandlarına bağlı olarak BBB arasında çift yönlü bir taşıma LRP1 içerir. biOasis Vect-HORUS LDLR 34 hedef peptid vektörleri geliştirir iken böyle BBB 33 genelinde lizozomal enzimler ve antikorlar gibi biyolojik maddelerin taşınması için bir protein melanotransferrin kullanarak Transcend teknolojisini geliştirir. Veriler LRP ve LDLR diff taşımak için kullanılabileceğini düşündüren varBu tür BBB 37 arasında lizozomal enzimlerin 35,36 veya nanopartikül kompleksleri gibi erent moleküller. Ilgi alanımız vektörü moleküllerini ve merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisi için vectorized ilaç adayları kullanılarak merkezi sinir sistemine ilaç teslim edilir. Özellikle, BBB boyunca ilaç verme nöroenflamasyonun, kendi ölçüde değişebilir bir süreç bağlamında dikkate alınması gereken, ancak bu ensefalit, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı vs dahil olmak üzere, nöroenflamasyon, muhtemelen tüm merkezi sinir sistemi hastalıkları ve lezyonlar yaygındır paraselüler ve hücre üzerinden taşıma patolojik koşullarda 38,39,40,41,42,43 amplifiye edilebilir dikkate BBB fizyoloji ve geçirgenliği değişikliklerle BBB enflamasyon ile ve potansiyel olarak ilişkilidir. Örneğin, TNF-α, TWEAK ve diğer sitokinler inflamasyon modüle eden ve in vitro modellerle BBB deneyler bu th paraselüler özelliklerini değiştirmek göstermiştire endotelyal hücre tek tabaka 38,39,40 ve TNF-α de LDL 41 transsellüler taşınmasında bir artışa yol açar, 42 ve 43 laktoferrin holotransferrin. Amacımız geliştirmek ve karakterize etmek için optimize edilmiş olan bir ve yüksek oranda çoğaltılabilir sinjeneik fare modeli BBB primer beyin endotel hücreleri ve astrositler ko-kültürler kullanılmıştır. Biz ise beyin endotelyal hücre üretimi ve astrocyte üretim için 5 haftalık ve yenidoğan Wistar sıçanlar kullanıldı. Bir meydan okuma &quot;haftalık tekrarlanabilir&quot; BBB modellerinin üretimini sağlayan bir protokol kurmak oldu. Bu amaca ulaşmak için, üretim protokolün her adım ilk hafta Çarşamba günü beyin mikrovasküler üretimden başlayarak, haftanın belirli günlerindeki yapıldı. Diseksiyonlar son 3 yıl boyunca neredeyse her hafta yapıldı. Ayrıca kültürlerin tekrarlanabilirliğinin geliştirmek için, bir kalite güvence sistemi kuruldu. Tüm Reagents ve kimyasal bir veritabanı (giriş tarihi, stok, son terim, vb) başvurulan edildi. Bu model, bu gibi endotelyal hücre organizasyonu ve saflık gibi bir dizi kriter, aşağıdaki karakterize edildi, TEER, LY geçirgenlik, pro-enflamatuar maddeler, TJ proteinlerin nitel ve nicel ifade, P-gp olarak akış taşıyıcıları işlevselliği ve reseptörlerine müdahale gibi TfR veya LDLR gibi endotel hücre tekli katmanı üzerinde transsitoz katılan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

Kan-beyin bariyeri (BBB), özellikle kan ve sinir dokusu arasında moleküler ve hücresel akışı düzenler. Amacımız, endotelyal hücre tek tabaka arasında transsitoz dahil reseptörleri incelemek için primer fare beyin endotel hücreleri (RBEC) eş-kültür ve astrositler üzerindeki BBB in vitro modelinin yüksek ölçüde tekrarlanabilir singeneik fare geliştirmek ve karakterize etmek olmuştur. Astrositler tripsin sindirim aşağıdaki mekanik disseksiyon yolu ile izole edildi ve daha sonra eş-kültür için dondurulmuştur. RBEC 5 haftalık sıçan korteks izole edilmiştir. Beyin Meninks ve beyaz maddeden temizlenmiş ve mekanik enzimatik sindirimi aşağıdaki ayrışmış edildi. Bundan sonra, doku homojenatı sinir dokusu damar parçalarını ayırmak için bovin serum albümin içinde santrifüjlenmiştir. Kap parçaları kendi hücre dışı matris olmadan endotel hücreleri için ikinci bir enzimatik sindirim uygulandı. Böyle perisitlerden gibi kalan kirlenmesine neden olan hücreleri f edildiurther puromisin içeren ortam içinde mikro damar kaplama parçalarını elimine edilir. Daha sonra kuyular altındaki yetiştirilen astrositler ile ko-kültür için filtreler üzerine geçirilmiştir. RBEC sıkı birleşme yüksek seviyelerini ifade okludin gibi (TJ) proteinleri, hücre sınırları tipik bir lokalizasyonu ile Claudin-5 ve ZO-1. TJs sıkılığını gösteren beyin endotelyal monotabakaların transendotelyal elektriksel direnci (TEER), 300 Ohm · ortalama cm 2 ulaştı. (LY) Lucifer sarı için endotel geçiş katsayıları (Pe) / dk 0.26 ± 0.11 x 10 cm -3 bir ortalama ile yüksek oranda tekrar oldu. Mono tabakaları düzenlenen beyin endotel hücreleri, akış taşıyıcı P-glikoprotein (P-gp) olarak ifade edilmiştir rodamin 123, P-gp için bir ligandın bir polarize taşıma gösterdi ve endotelyal hücre tek tabaka arasında transferrin-Cy3 ve DiILDL özel taşıma gösterdi. Sonuç olarak, bir in vitro kurmak için bir protokol sağlarNedeniyle kalite güvence yöntemleri son derece tekrarlanabilir olduğunu ve BBB nakliyecilere ve reseptörler üzerinde araştırma için uygun olan BBB modeli.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.2K Görüntüleme.  VECT-HORUS SAS.  Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi. 

Video: Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Sıçan Modelinde Transkraniyal Odaklanmış Ultrason kullanarak Kan-beyin bariyeri MRG eşliğinde bozulması

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Tıp

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

Rat Karotis Balon Yaralanma Modeli Anti-vasküler Tadilat Therapeutics Test

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...