Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Star Bilimsel Vakfı (Avustralya), Tourette sendromu Derneği (ABD) tarafından desteklenen, Trish Multipl skleroz Araştırma Vakfı ve Multipl Skleroz Araştırma Avustralya, Petre Vakfı (Avustralya), Rebecca L. Cooper Tıbbi Araştırma Vakfı (Avustralya). Hepimiz hasta ve bizim çalışma için örnekleri verilen aile üyelerine teşekkür ederim.

<html> 1.. Strateji pIRES2-EGFP Vektör Kodlama D2R veya NMDAR Construct altklonlamıştır <ol><li> İnsan D2R veya NMDAR alt biriminin 1 (NR1) tam uzunluktaki cDNA klonunu elde edilir. </li><li> Böyle bir durumda birlikte tanımlanması antijenleri ve GFP hem de mümkün kılan bir gelişmiş yeşil floresan protein, bir iç ribozom giriş sahası (IRES) kontrolü altında (GFP) raportör ile transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygun olan pIRES2-EGFP gibi bir ifade vektörü, seç ayrı ayrı hücreler. </li><li> PIRES2-EGFP vektörü içinde insan cDNA alt-klonlanmıştır. <ol><li> , CDNA alt klonlamak, uygun kısıtlama enzimleri kullanmak için (insan D2R cDNA örneğin Nhel ve Xhol için). </li><li> Ligatı kesilmiş cDNA kısıtlı pIRES2-EGFP vektörü içinde yerleştirin. </li><li> Dizisi vektör doğru sırasını içerip içermediğini kontrol etmek pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörü bağlandı. </li><li> Arındırmak ve transfeksiyon daha sonra kullanmak için pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörün yükseltilmesi. </li></ol></li></ol>itle &quot;&gt; 2. Nöronal Antijen İfade için HEK293 HÜCRE NAKLİ <ol><li> Taze Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) 4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin ve 110 mg,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş / L sodyum piruvat ile birlikte ile doku kültürü şişelerinde Kültür HEK293 hücreleri, 2 mM GlutaMAX ve 50 ug / ml Gentamisin. </li><li> Tripsin ve transferi bir konik tüp kullanılarak HEK293 hücreleri ayırın. <ol><li> 6 dakika boyunca 250 xg&#39;de hücreler santrifüj ile yıkayın ve taze bitmiş DMEM içinde bir hücre pelletini. </li></ol></li><li> Yaklaşık 8 x 10 5 hücre / göz ve kültür, gece boyunca 2 ml DMEM içinde 37 ° C de ve% 5, bir kuluçka makinesi içinde CO2 de hücreleri ve tohum 6 kuyucuğu sayılır. </li><li> Bu yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa eriştiklerinde sonra, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + hücreleri), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + hücreleri) ile HEK293 hücreleri transfekte etmek, ve pIRES2-EGFP (HEK293 CTL hücreleri vektör kontrolü) aşağıdaki gibi.Sonra tazminat için bazı untransfected HEK293 hücreleri tutun. <ol><li> 2.5 ug DNA, 200 ul% 0.9 sodyum klorür ve 4 ug / ml polietilenimin / oyuk (her biri 2 ml taze tam DMEM içeren) içeren bir transfeksiyon karışımı gerekli hacmi hazırlayın. </li><li> Hemen 10 saniye boyunca girdap karışımı ve uygun oyuklara transfeksiyon karışımı hacmi ilave edilmeden önce, 10 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. </li><li> , Kapak plakası Parafilm ile yanlarını doğal olarak kaplayan ve hücre transfeksiyonu yardımcı olmak için 5 dakika boyunca 280 x g &#39;de santrifüj. </li><li> Parafilm çıkarın ve sonra 37 ° C de kültüre inkübatöre koyun </li><li> Taze tam DMEM ile 18 saat sonra kültür ortamı değiştirin ve başka bir 72 saat boyunca kültür korumak. </li><li> İsteğe bağlı: 72 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş hücreler, poliklonal stabil transfektan elde etmek amacıyla, 250 ug / ml Genetisin ile desteklenmiş tam DMEM içinde kültür tarafından seçilebilir. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Nöronal Antijenleri Yüzey antikor tespiti için Cytometry hücre bazlı bir deneyde Akış <ol><li> 37 ° C&#39;de yaklaşık 5 dakika boyunca 500 ul / well Versene ile kuluçkaya yatırılması ile HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + ve HEK293 hücreleri CTL ayırın <ol><li> PBS içinde süspanse 2ml/well (= Ca 2 + / Mg2 +)% 2 FBS (PBS / FBS) ve 15 ml veya 50 ml konik bir tüp transfer ile takviye edilmiştir. </li><li> 6 dakika boyunca 250 xg&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır ve 15-50 ml PBS / FBS hücre pelletini. Yıkama 2x tekrarlayın. </li><li> Hücre sayımı ve daha sonra 1 x 10 6 hücre / ml &#39;de PBS / FBS içerisinde yeniden süspanse edin. </li></ol></li><li> HEK293 D2R + veya HEK293 NMDAR + hücreleri, hem de CTL HEK293 hücreleri, her bir hasta numune ya da birincil antikor ile inkübe edilmesi olacağı dikkate alınarak, akış sitometri elde edilmesi için 96-çukurlu bir şablon tasarımı. </li><li> 50,000 hücre / biz bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohum hücrelerill alıcı şablon sitometri akışına göre. </li><li> 5 dakika boyunca 450 x g &#39;de 96-yuvalı plaka santrifüj ve nazikçe bir elektronik çok kanallı pipet ya da elle kullanarak süpernatan, bir açı ile plaka eğme ve hücre pelletini aspire dikkat alarak Pelet hücreleri. </li><li> HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilmiş HEK293 hücreleri CTL: <ol><li> Yüzey antijen ekspresyonunu değerlendirmek için birincil antikorunun seri dilüsyonları. </li><li> Antikoru belirlemek amacıyla hasta örnekleri. </li></ol></li><li> Örneğin, tazminat kontrolleri sitometri uygun akışı kullanın. boyanmamış transfekte edilmemiş HEK293 hücreleri, GFP + HEK293 hücreleri (AF647 -) ve transfekte edilmemiş AF647 + HEK293 hücreleri (GFP). </li><li> 5 dakika boyunca 450 x g santrifüj ile hücreler yıkanır ve 170 ul PBS / FBS hücre pelletini. Yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 1 saat boyunca inkübe hücreleri(anti-NR1 ya da anti-D2R primer antikorlar hasta serum ve anti-fare IgG anti-insan IgG) AF647-konjuge sekonder antikor 1:100 seyreltme ile karanlıkta, oda sıcaklığında r. </li><li> Adım 3.7 &#39;de olduğu gibi, hücreler üç kez yıkayın ve hücre devir akış sitometrisi için 35 ul PBS / FBS içerisinde yeniden süspanse edin. </li><li> (BDLSRII) sitometresi akış yüksek verim sampler (HTS) ayarlayın. </li><li> Edinimi şablonun sitometri akışına göre 10.000 olaylar / kuyu edinin. </li><li> İhracat ve sonra bu FlowJo v7.5 gibi yazılım paketinin sitometri akışını kullanarak analiz için verileri analiz: <ol><li> İlk olarak, ileri (boyut) ve yan (granüllü yapı) göre kapı canlı HEK293 hücreleri dağıtır. </li><li> Yalnızca transfekte hücreleri analiz etmek için yüksek GFP-pozitif göre daha fazla kapı canlı HEK293 hücreleri. </li><li> Canlı GFP-pozitif hücreler içinde AF647 kanalın ortalama floresan yoğunluğu (MFI) belirler. </li><li> Analiz için Excel veya prizma içine İhracat verileri: <ol><li> Plot cMFI karşı birincil antikor (anti-NMDAR veya anti-D2R antikor) oncentrations, bu antikorlar ile inkübe hücrelerden elde. </li><li> Her bir hasta ve kontrol örneği için, sırası ile, HEK 293 D2R + ya da HEK293 NMDAR + hücrelerinin MFI gelen CTL HEK293 hücrelerinin MFI çıkarılarak ΔMFI belirler. </li><li> Kontrol kohort ortalama ΔMFI yukarıdaki üç standart sapma ekleyerek antikor pozitifliğinin eşiğini hesaplayın. </li><li> Arsa bireysel örnekler bir grafik üzerindeki serum türüne göre gruplandırılmış ve bir çizgi halinde eşiği temsil etmektedir. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins.">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li><li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS:+new+developments+and+future+challenges.">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica.">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABA(B)+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich,+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis,+Morvan&#8217;s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia.">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan&#8217;s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome.">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders.">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li><li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides:+clues+for+pathogenesis.">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li><li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+diagnosis+of+NMO:+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays.">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li><li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis.">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li><li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis.">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li><li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor,+a+Rhodopsin+Family+GPCR,+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes.">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis.">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li><li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease.">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li><li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6,+a+Subunit+of+Kv4.2.">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li><li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2.">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması: Bir patent otoantikorlar için hedef olarak D2R iddia FB ve RCD (Sydney Üniversitesi) tarafından dava açılmıştır.

Bu çalışma, bir yüksek verimli bir örneği kullanarak, belirli hücre yüzeyi proteinlerini nöronal hedef antikorları tespit etmek için bir canlı hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi yeni bir uygulamasını tarif etmektedir. Bu tekniği kullanarak, otoimmün sinir sistemi hastalığı olan etkilenen hastaların bir alt grubu NMDAR yüzey veya D2R yüzey serum antikorları sahip olduğunu bildirmektedir. Canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri bu yüksek verimli bir akış...

Son yıllarda, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları ve oto-bağışıklık biçimleri tanımlanmıştır. Bu hastalıklar ve ilişkili otoantikorlann mevcudiyeti ile tanımlanır olduğu gösterilmiştir. Bu antikorlar ya da reseptörleri nöronal sinir iletimini 1,2 dahil sinaptik proteinlere bağlanır. Farklı antijenler, örneğin N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) 3-5, γ-aminobütirik asit reseptör B (GABA B) 6 reseptörü, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-olarak tespit edilmiştir izoksazolepropiyonik asit (AMPA) reseptörü 7, voltaj kapılı potasyum kanal (VGKC) bağlı proteinler: lösin açısından zengin glioma-aktive protein 1 (LGL-1) ve kontaktin-ilişkili protein 2 (capsr2) 8,9, glutamat reseptörü 5,10 ve dopamin-2 reseptörü (D2R) 11. Geçmişte, (çoğunlukla ensefalit olarak da bilinir), bu otoimmün CNS bozuklukları sıklıkla teşhis ve tedavi edilmemiştir. Bu yeni biyolojik antikor, örnNMDAR antikor veya D2R antikor, esasen tanı ve farkındalık düzeldi, ve hastalar için tedavi seçenekleri açtı. Gerçekten de, bağışıklık ile erken tedavi geliştirilmiş sonuç 11,12 ile ilişkilidir. , Örneğin enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) ve western blot gibi antikorları tespit etmek için geleneksel yöntemler serumunda antikorların saptanması için kullanılmıştır. Ancak, hali hazırda hücre-dışı ya da yüzey epitoplarının tanınması olanak değildir ve, bunun yerine, bir hücre içi epitopuna karşı immunoreaktivitesini ortaya çıkarabilir. Ayrıca, sinir katılan önemli proteinlerin hücre dışı alanına bağlanan antikorlar, patojenik 2,3,7,13,14 olması muhtemeldir. Bu nedenle, ilgili hücre yüzey ya da hücre-dışı hastalarda antikor hedefleri keşfetmek için doğru ve hassas analizlerin geliştirilmesi önemlidir. Alanındaki altın standart yöntem olarak adlandırılan, &quot;hücre-ba olarak, canlı hücrelerin kullanımına dayanmaktadırsed deneyleri &quot;. Bu yöntem, memeli hücrelerinin ilgilenilen antijenin tam cDNA dizisini ihtiva eden vektörler transfeksiyonu ile kendi doğal biçiminde (en çok insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücre) yüzeyinde bir antijenin ekspresyonunu içerir. Geçirgen hale getirilmemiş canlı hücreler daha sonra, seyreltilmiş hasta serumu ile inkübe edildi ve florokrom-eşlenik anti-insan immünoglobülin (Ig) sekonder antikoru ile takip edilmektedir. Floresans yoğunluğu veya seviyesi, daha sonra tespit edilir ve bağlayıcı otoantikor seviyesine ilişkilidir. Tek bir antijen hücrelerinde aşırı eksprese olduğu gibi bu teknik, özgüdür. En çok &quot;Okuması&quot; kullanılmış immünsitokimya 4,5,8-10 sonra konfokal mikroskopi analizi olmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı deneylerde akış sitometrisi başarılı demiyelinizan hastalıklar 15-17 olan hastalarda antikorları tespit etmek için kullanılmıştır. Özellikle, Waters vd. 15, bir tava ile bir antikorun saptanmasını karşılaştırıldığındaHücre bazlı mikroskobu ile takip deneylerinde ya da dahil olmak üzere, akış antikor algılama teknikleri el sitometri analizleri ve en hassas, doğru ve güvenilir bir yöntem olarak hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi göstermiştir. Bu araştırmacı bağımlı, kantitatif değildir ve radyoaktif malzemenin herhangi bir şekilde kullanılması anlamına gelmez Bu nedenle, hücre bazlı bir deneyde sitometri akışı avantajlıdır. Bu büyük hasta tabur kısa bir miktarda tahlil edilecek verir gibi de uygundur. Daha yakın zamanlarda, otoimmun CNS hastalıkları olan hastalarda 11 NMDAR antikor ve D2R antikoru belirlemek için hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış optimize ettik. Bizim grubu son hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi kullanılarak hasta serumunda NMDAR antikor tespit edildi. Bu NMDAR antikoru pozitif serumlar daha önce konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edildi ve 11 pozitif olduğu bulunmuştur. Bu protokol, c tespiti için hücre bazlı bir deneyde bir akış sitometri özetlenmektedirotomatik yüksek verimli örneği kullanan hasta serumunda onformation duyarlı CNS antikor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">pIRES2-EGFP vector</td>
			<td style="width:187px;">Clontech</td>
			<td style="width:136px;">6029-1</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA</td>
			<td style="width:187px;">Missouri S&#38;T cDNA Resource Centre</td>
			<td style="width:136px;">DRD020TN00</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">Gift from Prof A. Vincent&#160; (Oxford, UK)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)</td>
			<td style="width:187px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">556308</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">WH0001813M1-50UG</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A31571</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A21445</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11995-065</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Foetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10099-141</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15710-072</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Geneticin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10131-035</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-144</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TrypLE Express (1x) with Phenol Red</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">12605-028</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.9% Sodium chloride</td>
			<td style="width:187px;">Baxter</td>
			<td style="width:136px;">AHF7975</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine</td>
			<td style="width:187px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:136px;">9002-98-6</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Versene</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15040-066</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">XhoI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10899194001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NheI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10885843001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K3100-01</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td>
			<td style="width:187px;">Genomed</td>
			<td style="width:136px;">420050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10481220001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Plasmid&#160;Plus&#160;Maxi Kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:136px;">12963</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Name of Equipment/Software</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Model/Version</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Flow cytometer with high-throughput sampler system</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">BDLSRII with HTS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Electronic multichannel pipette (15-300 &#956;l)</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;">613-2240P</td>
			<td style="width:173px;">12-channel Xplorer Plus</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:255px;">Excel</td>
			<td style="width:187px;">Microsoft</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Prism</td>
			<td style="width:187px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v4</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:255px;">FlowJo</td>
			<td style="width:187px;">Treestar</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">50 ml polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">352070</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353046</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm</td>
			<td style="width:187px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:136px;">PM-992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">V-bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">651180</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput flow cytometry cell-based assay to detect antibodies to n-methyl-d-aspartate receptor or dopamine-2 receptor in human serum

Son yıllarda, yüzey ve sinir iletimi ile ilgili yapısal proteinlerine karşı olan antikorlar, çocuklar ve yetişkinler için CNS otoimmün hastalıklarda tespit edilmiştir. Bu antikorlar tanı ve tedaviye yol kullanılmıştır. Hücre bazlı deneyler hasta serum içinde antikorların saptanmasını iyileştirilmiştir. Daha sonra florokrom-konjuge sekonder antikor ile, ardından seyreltilmiş hasta serası ile inkübe edilir, ökaryotik hücreler üzerinde beyin antijenlerin, yüzey ekspresyonu dayanmaktadır. Yıkama işleminden sonra, bağlayıcı ikinci antikor daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilir. Bizim grup güvenilir bir şekilde belirli bir nörotransmiter reseptörlerine karşı antikorlar tespit etmek için, canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış geliştirmiştir. Bu akış sitometri yöntemi yalındır, kantitatif, verimli ve geniş hasta kohortlarının kolayca zaman kısa bir alanda test edilmesi için yüksek verimli bir örnekleyici sistemi kullanma imkanı sağlar. Ayrıca, bu gibi hücre bazlıki kolayca merkezi sinir sistemi ve çevre hem de birçok farklı antijenik hedeflere antikorları tespit etmek için adapte edilebilir. Ilave yeni antikor biomarkerlerin Keşfi hızlı ve doğru tanı sağlamak ve bağışıklık aracılı bozuklukların tedavisini artıracaktır.

Canlı HEK293 D2R + ve HEK293 hücreleri, CTL yüksek verimli bir örneği kullanarak akış sitometresi ile elde edildi. Analiz sırasında, hücreler ileri dağılım (boyut) ve yan dağılım (granülaritesi) parametreleri (Şekil 1A ve 1B) dayalı kapılı edilmiştir. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri sitoplazmasında raportör molekülü, GFP ifade ve transfekte edilmemiş hücrelerin analizi (Şekil 1 B ve 1 E) alınmad?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum at JoVE.com

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

high-throughput-flow-cytometry-cell-based-assay-to-detect-antibodies

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Görüntüleme.  The University of Sydney.  Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır. 