Questo lavoro è stato sostenuto dal Australian Health and Medical Research Council Nazionale, Star Scientific Foundation (Australia), sindrome di Tourette Association (USA), la sclerosi multipla Trish Fondazione per la Ricerca e la sclerosi multipla Research Australia, Petre Foundation (Australia), la Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Ringraziamo tutti i pazienti ei familiari che hanno fornito i campioni per il nostro studio.

<html> 1. Subclonaggio Strategia Per costruire pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R o NMDAR <ol><li> Ottenere full-length cDNA clone di D2R umana o NMDAR subunità 1 (NR1). </li><li> Scegliere un vettore di espressione, come pIRES2-EGFP, che è adatto per l&#39;espressione di proteine ​​transmembrana con una proteina migliorata verde fluorescente (GFP) reporter sotto il controllo di un sito di entrata del ribosoma interno (IRES), permettendo sia antigeni e GFP essere coespressi in cellule separatamente. </li><li> Subclone cDNA umano all&#39;interno pIRES2-EGFP vettoriale. <ol><li> Per subclonare cDNA, utilizzare appropriati enzimi di restrizione (ad esempio NheI e XhoI per l&#39;uomo D2R cDNA). </li><li> Inserire legare taglio cDNA entro ristretto pIRES2-EGFP vettoriale. </li><li> Sequenza ligato pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per verificare se il vettore contiene la sequenza corretta. </li><li> Purificare e amplificare pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per un uso successivo in trasfezione. </li></ol></li></ol>DENOMINAZIONE &quot;&gt; 2. HEK293 Trasfezione cellulare Manifestazione d&#39;neuronale Antigen <ol><li> Cellule Cultura HEK293 in tessuto fiasche di coltura con il fresco di Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) completa di 4,5 g / L D-glucosio, L-glutammina e 110 mg / L piruvato di sodio supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 GlutaMAX mM e 50 pg / ml Gentamicina. </li><li> Staccare cellule HEK293 con tripsina e trasferimento in un tubo conico. <ol><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in DMEM fresco completo. </li></ol></li><li> Contare le celle e sementi 6 pozzetti a circa 8 x 10 5 cellule / pozzetto e cultura pernottamento in DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore. </li><li> Una volta che hanno raggiunto circa il 70% di confluenza, trasfezione le cellule HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 (+ cellule HEK293 NMDAR), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellule), e (cellule HEK293 CTL; controllo vettoriale) pIRES2-EGFP come segue.Mantenere alcune cellule HEK293 untransfected di risarcimento in seguito. <ol><li> Preparare il volume richiesto di miscela di trasfezione comprendente 2,5 ug di DNA, 200 microlitri 0,9% cloruro di sodio e 4 mg / ml polyethylenimine / pozzetto (ciascuna contenente 2 ml di DMEM fresco completo). </li><li> Vortice immediatamente la miscela per 10 sec e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti, prima di aggiungere volume di miscela di trasfezione ai pozzetti appropriati. </li><li> Coprire la piastra, avvolgere i lati con Parafilm e centrifugare a 280 xg per 5 minuti per aiutare trasfezione cellulare. </li><li> Rimuovere il Parafilm e poi posto in incubatrice alla cultura a 37 ° C. </li><li> Sostituire la cultura dei media 18 ore più tardi con DMEM fresco completo, e mantenere in coltura per un altro 72 hr. </li><li> Facoltativo: 72 ore dopo la trasfezione, le cellule transfettate possono essere selezionati mediante coltura in DMEM completo supplementato con 250 ug / ml Geneticin, al fine di ottenere un policlonale trasfettante stabile. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Citometria a flusso test cellulare per il rilevamento di anticorpi alla superficie antigeni neuronali <ol><li> Staccare HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, e cellule HEK293 CTL mediante incubazione con 500 microlitri / pozzetto Versene per circa 5 min a 37 ° C. <ol><li> Risospendere in 2ml/well di PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) integrato con il 2% FBS (PBS / FBS) e trasferimento a 15 ml o 50 ml tubo conico. </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in 15-50 ml di PBS / FBS. Ripetere il lavaggio 2x. </li><li> Contare le cellule e poi risospendere in PBS / FBS a 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li><li> Progettare il modello a 96 pozzetti per l&#39;acquisizione citometria a flusso, visto che + cellule HEK293 D2R + o HEK293 NMDAR, così come le cellule HEK293 CTL dovranno essere incubate con ciascun campione clinico o anticorpo primario. </li><li> Cellule seme in una piastra a 96 pozzetti V-bottom a 50.000 cellule / noill secondo la citometria a flusso template di acquisizione. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione della piastra a 96 pozzetti a 450 xg per 5 min e rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta multicanale elettronica o manuale, inclinando la piastra su un angolo e facendo attenzione a non aspirare il pellet di cellule. </li><li> Incubare HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, e le cellule HEK293 CTL per 1 ora a temperatura ambiente al buio con: <ol><li> Diluizioni seriali di anticorpo primario al fine di valutare l&#39;espressione dell&#39;antigene di superficie. </li><li> I campioni dei pazienti al fine di rilevare gli anticorpi. </li></ol></li><li> Usare adeguato flusso citometria a controlli di compensazione, ad esempio. cellule HEK293 untransfected non colorate, GFP + cellule HEK293 (AF647 -), e untransfected AF647 + HEK293 cellule (GFP). </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 450 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 170 microlitri di PBS / FBS. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Incubare le cellule per 1 hr alla RT al buio con diluizione 1:100 di AF647 coniugato anticorpo secondario (anti-IgG umane per il siero del paziente e anti-topo IgG per anticorpi primari anti-NR1 o anti-D2R). </li><li> Lavare le cellule tre volte, come al punto 3.7, e risospendere in 35 microlitri di PBS / FBS per citometria a flusso acquisizione cellulare. </li><li> Impostare il campionatore ad alto rendimento (HTS) sul citofluorimetro (BDLSRII). </li><li> Acquisire 10.000 eventi / bene secondo la citometria a flusso template di acquisizione. </li><li> Export e poi analizzare i dati per l&#39;analisi utilizzando un citometria a flusso pacchetto software, come ad esempio FlowJo v7.5: <ol><li> In primo luogo, porta le cellule HEK293 viventi basata su avanti (dimensione) e laterale (granularità) disperde. </li><li> Ulteriori cancello cellule vive HEK293 basato su alta GFP-positività per analizzare solo le cellule trasfettate. </li><li> Determinare l&#39;intensità di fluorescenza media (MFI) del canale AF647 all&#39;interno delle cellule GFP-positive vivi. </li><li> Esportare dati in Excel o Prism per l&#39;analisi: <ol><li> Plot cconcentrazioni del di anticorpo primario (anti-NMDAR o anticorpo anti-D2R) contro l&#39;MFI ottenuti dalle cellule incubate con questi anticorpi. </li><li> Per ciascun campione e controllo, determinare il ΔMFI sottraendo il MFI delle cellule HEK293 CTL dal MFI del HEK293 D2R + o + NMDAR cellule HEK293, rispettivamente. </li><li> Calcolare la soglia di positività anticorpale con l&#39;aggiunta di tre deviazioni standard sopra la ΔMFI media della coorte di controllo. </li><li> Singoli campioni Plot raggruppati in base al loro tipo di siero su un grafico e rappresentano la soglia come una linea. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins.">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li><li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS:+new+developments+and+future+challenges.">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica.">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABA(B)+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich,+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis,+Morvan&#8217;s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia.">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan&#8217;s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome.">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders.">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li><li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides:+clues+for+pathogenesis.">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li><li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+diagnosis+of+NMO:+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays.">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li><li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis.">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li><li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis.">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li><li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor,+a+Rhodopsin+Family+GPCR,+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes.">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis.">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li><li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease.">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li><li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6,+a+Subunit+of+Kv4.2.">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li><li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2.">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li></ol>

Conflitto di interessi: Un brevetto è stato depositato da FB e RCD (Università di Sydney), sostenendo D2R come obiettivo per autoanticorpi.

Questo articolo descrive una nuova applicazione di citometria a flusso saggio basato su cellule in tempo reale per individuare gli anticorpi specifici mirati proteine ​​neuronali superficie cellulare utilizzando un campionatore high-throughput. Utilizzando questa tecnica, si segnala che un sottogruppo di pazienti affetti da malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale hanno anticorpi sierici di superficie NMDAR o alla superficie D2R. Passi essenziali per la rilevazione ottimale degli...

Negli ultimi anni, sono state individuate forme autoimmuni del sistema nervoso centrale (SNC) malattie. E &#39;stato dimostrato che queste malattie sono associate e definiti dalla presenza di autoanticorpi. Questi anticorpi si legano ai recettori neuronali o proteine ​​sinaptiche coinvolte nella neurotrasmissione 1,2. Sono stati rilevati diversi antigeni, come recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, recettore γ-amminobutirrico B (GABA B) recettore 6, α-ammino-3-idrossi-5-metil-4- L&#39;acido isoxazolepropionic (AMPA) recettore 7, canale del potassio voltaggio-dipendenti (anti-VGKC) proteine ​​associate: leucina-ricchi glioma attivato 1 proteina (LGL-1) e contattonel-proteina associata 2 (capsr2) 8,9, glutammato recettore 5,10 , e la dopamina-2 recettore (D2R) 11. In passato, questi disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale (principalmente chiamati encefalite) erano spesso non diagnosticata e non trattata. Questi biomarcatori anticorpi romanzo, ad esempio,NMDAR anticorpo o anticorpi D2R, hanno sostanzialmente migliorato la diagnosi e la consapevolezza, e hanno aperto le opzioni di trattamento per i pazienti. Infatti, il trattamento precoce con immunoterapie è associata con una migliore esito 11,12. I metodi tradizionali per rilevare gli anticorpi, come immunoenzimatico assay (ELISA) e Western Blot sono stati utilizzati per la rilevazione di anticorpi nel siero. Tuttavia, essi non consentono facilmente riconoscimento di epitopi extracellulari o di superficie e, invece, possono rivelare immunoreattività verso un epitopo intracellulare. Inoltre, gli anticorpi che si legano al dominio extracellulare di proteine ​​importanti coinvolti nella neurotrasmissione sono suscettibili di essere 2,3,7,13,14 patogeni. Pertanto, lo sviluppo di analisi accurate e sensibili per scoprire superficie cellulare pertinente o bersagli degli anticorpi extracellulare nei pazienti è fondamentale. Il metodo gold standard nel campo si basa sull&#39;utilizzo di cellule vive, nelle cosiddette &quot;cell-basaggi sed &quot;. Questo metodo comporta l&#39;espressione di un antigene sulla superficie di cellule di mammifero (molto spesso renali (293) HEK293 cellule embrionali umane) nella sua forma nativa mediante trasfezione di vettori contenenti la sequenza di cDNA completa l&#39;antigene di interesse. Cellule nonpermeabilized live vengono poi incubate con il siero del paziente diluito e seguiti da fluorocromo coniugato immunoglobulina anti-umana (Ig) anticorpo secondario. Viene quindi rilevata l&#39;intensità o livello di fluorescenza ed è associato al livello di legame autoanticorpi. Questa tecnica è specifico, come un unico antigene è iperespresso nelle cellule. Il ampiamente usato &quot;read-out&quot; più è stata l&#39;analisi di microscopia confocale dopo immunocitochimica 4,5,8-10. Tuttavia, citometria a flusso saggi cellulari sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi nei pazienti con malattie demielinizzanti 15-17. In particolare, Waters et al. 15 rispetto individuazione di anticorpi utilizzando una vaschettael di tecniche di rilevazione degli anticorpi, tra cui saggi cellulari seguite da microscopio o flusso analisi di citometria, e ha mostrato la citometria a flusso saggio basato su cellule ad essere il metodo più sensibile, accurato e affidabile. Pertanto, citofluorimetria saggio basato su cellule è vantaggioso in quanto è quantitativa, non investigatore-dipendente, e non comporta alcun uso di materiale radioattivo. E &#39;anche conveniente in quanto consente grandi coorti di pazienti da analizzare in un breve lasso di tempo. Più di recente, abbiamo ottimizzato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule di rilevare NMDAR anticorpi e anticorpi D2R nei pazienti con malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale 11. Il nostro gruppo ha recentemente rilevato anticorpi NMDAR nel siero del paziente usando la citometria a flusso saggio basato su cellule. Questi sieri anticorpo-positivi NMDAR sono stati precedentemente analizzati usando la microscopia confocale e sono stati anche trovato positivo 11. Questo protocollo delinea una citofluorimetria saggio basato su cellule per la rilevazione di conformation sensibile anticorpi CNS nel siero del paziente utilizzando un campionatore ad alto rendimento automatizzato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">pIRES2-EGFP vector</td>
			<td style="width:187px;">Clontech</td>
			<td style="width:136px;">6029-1</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA</td>
			<td style="width:187px;">Missouri S&#38;T cDNA Resource Centre</td>
			<td style="width:136px;">DRD020TN00</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">Gift from Prof A. Vincent&#160; (Oxford, UK)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)</td>
			<td style="width:187px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">556308</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">WH0001813M1-50UG</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A31571</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A21445</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11995-065</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Foetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10099-141</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15710-072</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Geneticin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10131-035</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-144</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TrypLE Express (1x) with Phenol Red</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">12605-028</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.9% Sodium chloride</td>
			<td style="width:187px;">Baxter</td>
			<td style="width:136px;">AHF7975</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine</td>
			<td style="width:187px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:136px;">9002-98-6</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Versene</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15040-066</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">XhoI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10899194001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NheI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10885843001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K3100-01</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td>
			<td style="width:187px;">Genomed</td>
			<td style="width:136px;">420050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10481220001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Plasmid&#160;Plus&#160;Maxi Kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:136px;">12963</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Name of Equipment/Software</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Model/Version</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Flow cytometer with high-throughput sampler system</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">BDLSRII with HTS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Electronic multichannel pipette (15-300 &#956;l)</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;">613-2240P</td>
			<td style="width:173px;">12-channel Xplorer Plus</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:255px;">Excel</td>
			<td style="width:187px;">Microsoft</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Prism</td>
			<td style="width:187px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v4</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:255px;">FlowJo</td>
			<td style="width:187px;">Treestar</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">50 ml polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">352070</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353046</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm</td>
			<td style="width:187px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:136px;">PM-992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">V-bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">651180</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput flow cytometry cell-based assay to detect antibodies to n-methyl-d-aspartate receptor or dopamine-2 receptor in human serum

Nel corso degli ultimi anni, gli anticorpi contro le proteine ​​di superficie e conformazionali coinvolti nella neurotrasmissione sono state rilevate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale nei bambini e negli adulti. Questi anticorpi sono stati utilizzati per guidare la diagnosi e il trattamento. Saggi cellulari hanno migliorato il rilevamento di anticorpi nel siero del paziente. Essi si basano sulla superficie espressione di antigeni cerebrali sulle cellule eucariotiche, che vengono poi incubate con sieri diluiti paziente seguito da anticorpi secondari coniugati con fluorocromi. Dopo il lavaggio, il legame anticorpo secondario viene quindi analizzata mediante citometria a flusso. Il nostro gruppo ha sviluppato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule-live per rilevare in modo affidabile gli anticorpi contro recettori dei neurotrasmettitori specifici. Questo metodo di citometria a flusso è dritto in avanti, quantitativa, efficiente, e l&#39;uso di un sistema di campionamento ad alta velocità permette di grandi coorti di pazienti di essere facilmente analizzati in un breve lasso di tempo. Inoltre, questa cella basata comedire che può essere facilmente adattato per rilevare gli anticorpi a molti diversi target antigenici, sia dal sistema nervoso centrale e la periferia. Alla scoperta di biomarcatori supplementari romanzo di anticorpi consentirà una diagnosi tempestiva e accurata e migliorare il trattamento dei disturbi immuno-mediate.

Cellule vive HEK293 D2R + e HEK293 CTL sono stati acquisiti al citofluorimetro utilizzando un campionatore high-throughput. Durante l&#39;analisi, le cellule sono state gated basato su forward scatter (dimensione) e parametri (granularità) (Figure 1A e 1D) side scatter. Cellule HEK293 trasfettate espressi molecola reporter, GFP, nel citoplasma, e le cellule non trasfettate sono stati esclusi dall&#39;analisi (Figure 1B e 1E). All&...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum at JoVE.com

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l&#39;analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.

High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

high-throughput-flow-cytometry-cell-based-assay-to-detect-antibodies

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Views.  The University of Sydney.  Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata. 