Ce travail a été soutenu par la Santé et paramédical Conseil national australien de recherche, Fondation scientifique Star (Australie), Association syndrome de la Tourette (USA), La sclérose en plaques Fondation pour la recherche et Trish sclérose en plaques Research Australia, Fondation Petre (Australie), Rebecca L. Fondation Cooper Medical Research (Australie). Nous remercions tous les patients et les membres de la famille qui ont fourni des échantillons pour notre étude.

<html> Une. Sous-clonage Stratégie de construire pIRES2-EGFP vecteur codant D2R ou NMDAR <ol><li> Obtenir ADNc complet clone de D2R humaine ou NMDAR sous-unité 1 (RN1). </li><li> Choisir un vecteur d&#39;expression, tel que pIRES2-EGFP, ce qui est approprié pour l&#39;expression de protéines transmembranaires avec une protéine améliorée verte fluorescente (GFP) rapporteur sous le contrôle d&#39;un site interne d&#39;entrée du ribosome (IRES), permettant à la fois des antigènes et des GFP d&#39;être co-exprimées dans cellules séparément. </li><li> Sous-cloner l&#39;ADNc humain dans pIRES2-EGFP vecteur. <ol><li> Pour sous-cloner l&#39;ADNc, en utilisant les enzymes de restriction appropriées (par exemple Nhel et Xhol pour D2R ADNc humain). </li><li> ADNc Ligate coupe insérer dans restreint vecteur pIRES2-EGFP. </li><li> Séquence ligaturé pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vecteur de vérifier si le vecteur contient la séquence correcte. </li><li> Purifier et amplifier pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vecteur pour une utilisation ultérieure dans la transfection. </li></ol></li></ol>itre &quot;&gt; 2. HEK293 Transfection cellulaire pour l&#39;expression de l&#39;antigène neuronale <ol><li> Les cellules de la culture HEK293 en flacons de culture tissulaire avec un milieu de Eagle modifié frais Dulbecco (1x) (DMEM) avec 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamine et de 110 mg / L de pyruvate de sodium supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM GlutaMAX, et 50 ug / ml de gentamicine. </li><li> Détacher les cellules HEK293 en utilisant la trypsine et la transférer dans un tube conique. <ol><li> Laver les cellules par centrifugation à 250 g pendant 6 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans du DMEM complet frais. </li></ol></li><li> Compter les cellules et les semences plaques de 6 puits à environ 8 x 10 5 cellules / puits et de la culture pendant une nuit dans du DMEM 2 ml à 37 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur. </li><li> Une fois qu&#39;ils ont atteint environ 70% de confluence, transfecter les cellules HEK293 avec pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR Les cellules +), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellules), et (cellules HEK293 CTL; contrôle vectoriel) pIRES2-EGFP comme suit.Gardez quelques cellules HEK293 non transfectées d&#39;indemnisation plus tard. <ol><li> Préparer un volume déterminé de mélange de transfection comprenant 2,5 ug d&#39;ADN, de 200 ul de chlorure de sodium à 0,9% et de 4 ug / ml de polyéthylèneimine / puits (contenant chacune 2 ml de DMEM complet frais). </li><li> Vortex immédiatement le mélange pendant 10 secondes et incuber à température ambiante (RT) pendant 10 min, avant d&#39;ajouter le volume de mélange de transfection dans les puits appropriés. </li><li> Recouvrir la plaque, envelopper les côtés avec du Parafilm et centrifuger à 280 g pendant 5 min à l&#39;aide transfection cellulaire. </li><li> Retirez le Parafilm et les placer dans l&#39;incubateur de culture à 37 ° C. </li><li> Remplacez le support de culture 18 heures plus tard avec du DMEM complet frais, et maintenir dans la culture pour un autre 72 heures. </li><li> Facultatif: 72 heures après la transfection, les cellules transfectées peuvent être sélectionnées par culture dans du DMEM complet additionné de 250 ug / ml de généticine, de manière à obtenir un transfectant stable polyclonal. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Cytométrie en flux test cellulaire pour la détection des anticorps dirigés contre les antigènes de surface de neurones <ol><li> Détacher HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, et les cellules HEK293 CTL par incubation avec 500 ul / puits Versene pendant environ 5 min à 37 ° C. <ol><li> Remettre en suspension dans du PBS 2ml/well (-Ca 2 + / Mg 2 +-) supplémenté avec 2% de FBS (PBS / FBS) et transférer dans un 15 ml ou 50 ml de tube conique. </li><li> Laver les cellules par centrifugation à 250 g pendant 6 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 15 à 50 ml de PBS / FBS. Répétez lavage 2x. </li><li> Compter les cellules et remettre en suspension dans du PBS / FBS à 1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> Concevoir le modèle à 96 puits pour l&#39;acquisition de la cytométrie en flux, en considérant que HEK293 D2R + + ou des cellules HEK293 NMDAR, ainsi que des cellules HEK293 CTL devront être incubé avec chaque échantillon de patient ou de l&#39;anticorps primaire. </li><li> cellules de semences dans une plaque de 96 puits à fond en V à 50 000 cellules / nousll en fonction de la cytométrie de flux modèle d&#39;acquisition. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation de la plaque de 96 puits à 450 g pendant 5 min et retirez délicatement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux électronique ou manuel, en inclinant la plaque sur un angle et en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire. </li><li> Incuber HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + et les cellules HEK293 CTL pour 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité avec: <ol><li> Des dilutions en série d&#39;anticorps primaire afin d&#39;évaluer l&#39;expression des antigènes de surface. </li><li> Les échantillons de patients afin de détecter des anticorps. </li></ol></li><li> Utilisez flux approprié cytométrie contrôles de compensation, par exemple. les cellules HEK293 non transfectées non colorées, GFP + des cellules HEK293 (AF647 -), et non transfectées AF647 + cellules HEK293 (GFP). </li><li> Laver les cellules par centrifugation à 450 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 170 pi de PBS / FBS. Répétez l&#39;étape de lavage deux fois de plus. </li><li> Incuber les cellules pendant 1 hr à température ambiante dans l&#39;obscurité avec une dilution 1:100 d&#39;anticorps secondaire conjugué à AF647 (anti-IgG humaine dans le sérum du patient et de l&#39;anti-IgG de souris pour des anticorps primaires anti-NR1 ou anti-D2R). </li><li> Laver les cellules trois fois, comme dans l&#39;étape 3.7, et remettre en suspension dans 35 ul de PBS / FBS à cytométrie de flux des cellules acquisition. </li><li> Mettre en place le haut débit échantillonneur (HTS) sur le cytomètre de flux (BDLSRII). </li><li> Acquérir 10 000 événements / puits selon la cytométrie de flux modèle d&#39;acquisition. </li><li> Exporter, puis analyser les données pour l&#39;analyse en utilisant une cytométrie de flux logiciel, comme FlowJo v7.5: <ol><li> Premièrement, porte les cellules vivantes HEK293 basé sur l&#39;avant (taille) et le côté (granularité) disperse. </li><li> En outre grille des cellules HEK293 en direct sur la base de haute GFP-positivité pour analyser seulement les cellules transfectées. </li><li> Déterminer l&#39;intensité moyenne de fluorescence (MFI) du canal AF647 dans les cellules GFP-positives vivants. </li><li> Exporter des données dans Excel ou prisme d&#39;analyse: <ol><li> Terrain concentrations d&#39;anticorps primaire (anti-NMDAR ou un anticorps anti-D2R) par rapport à la MFI obtenues à partir des cellules incubées avec ces anticorps. </li><li> Pour chaque échantillon de patient et contrôle, déterminer la ΔMFI en soustrayant le MFI des cellules HEK293 CTL de l&#39;IMF de la HEK293 D2R + ou HEK293 NMDAR cellules +, respectivement. </li><li> Calcul du seuil de positivité des anticorps par ajout de trois écarts-types au-dessus de la ΔMFI moyen de la cohorte témoin. </li><li> échantillons individuels de parcelles regroupées en fonction de leur type de sérum sur un graphique et représentent le seuil en ligne. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins.">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li><li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS:+new+developments+and+future+challenges.">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+receptor+antibodies+in+pediatric+dyskinetic+encephalitis+lethargica.">N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica.</a> Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+GABA(B)+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures:+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen.">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location.">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich,+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis,+Morvan&#8217;s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia.">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan&#8217;s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li><li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+LGI1+as+the+antigen+in+limbic+encephalitis+previously+attributed+to+potassium+channels:+a+case+series.">Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series.</a> Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).</li><li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+Ophelia+syndrome.">Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome.</a> Neurol. 77, 1698-1701 (2011).</li><li>Dale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+surface+dopamine-2+receptor+in+autoimmune+movement+and+psychiatric+disorders.">Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders.</a> Brain. , (2012).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li><li>Hughes, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+synaptic+mechanisms+of+anti-NMDA+receptor+encephalitis.">Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis.</a> J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).</li><li>Bien, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+autoantibody-associated+encephalitides:+clues+for+pathogenesis.">Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis.</a> Brain. 135, 1622-1638 (2012).</li><li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serologic+diagnosis+of+NMO:+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays.">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li><li>McLaughlin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Dependent+B+Cell+Autoimmunity+to+a+Myelin+Surface+Antigen+in+Pediatric+Multiple+Sclerosis.">Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis.</a> J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).</li><li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis.">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li><li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor,+a+Rhodopsin+Family+GPCR,+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes.">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis.">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li><li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease.">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li><li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6,+a+Subunit+of+Kv4.2.">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li><li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2.">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li></ol>

Conflit d&#39;intérêts: Un brevet a été déposé par FB et le RCD (Université de Sydney) affirmant D2R comme cible pour les auto-anticorps.

Cet article décrit une nouvelle application de la cytométrie de flux essai à base de cellules en direct pour détecter les anticorps ciblant les protéines spécifiques de neurones de la surface de la cellule à l&#39;aide d&#39;un échantillonneur à haut débit. Grâce à cette technique, nous signaler qu&#39;un sous-groupe de patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central ont des anticorps sériques à la surface ou à la surface NMDAR D2R. Les étapes essentiel...

Au cours des dernières années, des formes auto-immunes du système nerveux central (SNC) des maladies ont été identifiés. Il a été montré que ces maladies sont associées et définies par la présence d&#39;auto-anticorps. Ces anticorps se lient à des récepteurs ou des protéines synaptiques des neurones impliqués dans la neurotransmission 1,2. Différents antigènes ont été détectés, tels que des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) 3-5, récepteur de la γ-aminobutyrique B (GABA B) récepteur 6, α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4- acide isoxazolepropionique (AMPA) 7, le canal potassique voltage-dépendants (VGKC) protéines associées: riche en leucine gliome activé une protéine (LGL-1) et contactine-associated protein 2 (capsr2) récepteur 8,9, 5,10 glutamate , et de la dopamine-2 récepteur (D2R) 11. Dans le passé, ces troubles du SNC auto-immunes (principalement appelé encéphalite) étaient souvent non diagnostiquée et non traitée. Ces nouveaux biomarqueurs d&#39;anticorps, par exemple,anticorps NMDAR ou anticorps D2R, ont considérablement amélioré le diagnostic et la sensibilisation, et ont ouvert des options de traitement pour les patients. En effet, un traitement précoce avec des immunothérapies est associée à une amélioration des résultats 11,12. Les méthodes traditionnelles de détection des anticorps, tels que des immuno-essai enzymatique (ELISA) et Western blot ont été utilisées pour la détection des anticorps dans le sérum. Toutefois, ils ne permettent pas facilement la reconnaissance d&#39;épitopes extracellulaires ou de surface et, plutôt, peuvent révéler immunoréactivité contre un épitope intracellulaire. En outre, des anticorps qui se lient au domaine extracellulaire des protéines importantes impliquées dans la neurotransmission sont susceptibles d&#39;être 2,3,7,13,14 pathogène. Par conséquent, le développement de dosages précis et sensibles à découvrir la surface de la cellule pertinente ou des cibles d&#39;anticorps chez les patients extracellulaire est primordiale. La méthode de l&#39;étalon d&#39;or dans le domaine est basée sur l&#39;utilisation de cellules vivantes, dans ce qu&#39;on appelle &quot;cellule-baessais sed &quot;. Ce procédé implique l&#39;expression d&#39;un antigène à la surface des cellules de mammifères (le plus souvent du rein 293 (HEK 293) de cellules embryonnaires humaines) dans sa forme native, par transfection de vecteurs contenant la séquence complète de l&#39;ADNc de l&#39;antigène d&#39;intérêt. Les cellules non perméabilisés vivants sont ensuite incubées avec du sérum de patient dilué et suivies par un fluorochrome conjugué anti-immunoglobuline humaine (Ig), un anticorps secondaire. L&#39;intensité ou le niveau de fluorescence est alors détectée et est associée au niveau de la liaison auto-anticorps. Cette technique est spécifique, comme un seul antigène est surexprimé dans les cellules. Le plus utilisé &quot;lecture&quot; a été analyse par microscopie confocale après immunocytochimie 4,5,8-10. Cependant, la cytométrie en flux tests cellulaires ont été utilisés avec succès pour détecter les anticorps chez les patients atteints de maladies démyélinisantes 15-17. En particulier, Waters et al. 15 ont comparé la détection des anticorps en utilisant une casseroleel des techniques de détection des anticorps, y compris des analyses cellulaires suivies par microscopie ou des analyses de flux cytométrie, et a montré la cytométrie en flux essai à base de cellules pour être la méthode la plus sensible, précis et fiable. Par conséquent, la cytométrie en flux essai à base de cellules est avantageuse car elle est quantitative, pas enquêteur dépendant, et n&#39;implique pas l&#39;utilisation de matières radioactives. Il est également commode, car il permet de grandes cohortes de patients à tester dans un court laps de temps. Plus récemment, nous avons optimisé un flux à haut débit cytométrie test cellulaire pour détecter les anticorps dirigés NMDAR et anticorps D2R chez les patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central 11. Notre groupe a récemment détecté des anticorps NMDAR dans les sérums des patients en utilisant la cytométrie en flux essai à base de cellules. Ces sérums d&#39;anticorps positif NMDAR ont été préalablement analysés par microscopie confocale et ont également révélé positif 11. Ce protocole décrit un dosage de cytométrie de flux à base de cellules pour la détection de canticorps CNS onformation sensible dans le sérum du patient en utilisant un échantillonneur à haut débit automatisé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">pIRES2-EGFP vector</td>
			<td style="width:187px;">Clontech</td>
			<td style="width:136px;">6029-1</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA</td>
			<td style="width:187px;">Missouri S&#38;T cDNA Resource Centre</td>
			<td style="width:136px;">DRD020TN00</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">Gift from Prof A. Vincent&#160; (Oxford, UK)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)</td>
			<td style="width:187px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">556308</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">WH0001813M1-50UG</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A31571</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">A21445</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">11995-065</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Foetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10099-141</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15710-072</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">35050-061</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15140-122</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Geneticin</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">10131-035</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">14190-144</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">TrypLE Express (1x) with Phenol Red</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">12605-028</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">0.9% Sodium chloride</td>
			<td style="width:187px;">Baxter</td>
			<td style="width:136px;">AHF7975</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Polyethylenimine</td>
			<td style="width:187px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:136px;">9002-98-6</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Versene</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">15040-066</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">XhoI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10899194001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NheI</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10885843001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">K3100-01</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td>
			<td style="width:187px;">Genomed</td>
			<td style="width:136px;">420050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;">10481220001</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Plasmid&#160;Plus&#160;Maxi Kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:136px;">12963</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Name of Equipment/Software</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Model/Version</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Flow cytometer with high-throughput sampler system</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">BDLSRII with HTS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Electronic multichannel pipette (15-300 &#956;l)</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;">613-2240P</td>
			<td style="width:173px;">12-channel Xplorer Plus</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:255px;">Excel</td>
			<td style="width:187px;">Microsoft</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">2010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Prism</td>
			<td style="width:187px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v4</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:255px;">FlowJo</td>
			<td style="width:187px;">Treestar</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:173px;">v7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">50 ml polypropylene conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">352070</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">6-well plate</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353046</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tissue culture flask (T75)</td>
			<td style="width:187px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">353136</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm</td>
			<td style="width:187px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:136px;">PM-992</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">V-bottom 96-well plate</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">651180</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput flow cytometry cell-based assay to detect antibodies to n-methyl-d-aspartate receptor or dopamine-2 receptor in human serum

Au cours des dernières années, des anticorps contre les protéines de surface et conformationnels impliqués dans la neurotransmission ont été détectés dans les maladies auto-immunes du système nerveux central chez les enfants et les adultes. Ces anticorps ont été utilisés pour orienter le diagnostic et le traitement. Essais cellulaires ont amélioré la détection des anticorps dans le sérum du patient. Ils sont basés sur l&#39;expression des antigènes de surface du cerveau sur les cellules eucaryotes, qui sont ensuite incubées avec des sérums dilués de patients suivis par des anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome. Après lavage, un anticorps secondaire de liaison est ensuite analysée par cytométrie en flux. Notre groupe a développé un flux à haut débit cytométrie dosage à base de cellules-live pour détecter de manière fiable les anticorps contre les récepteurs de neurotransmetteurs spécifiques. Cette méthode de cytométrie en flux est simple, quantitative, efficace, et l&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;échantillonnage à haut débit permet de grandes cohortes de patients pour être facilement analysés dans un court espace de temps. En outre, ce repose-cellule commedire peut être facilement adapté pour détecter les anticorps à de nombreuses cibles antigéniques différents, à la fois du système nerveux central et de la périphérie. Découvrir d&#39;autres biomarqueurs d&#39;anticorps roman permettra un diagnostic rapide et précis et améliorer le traitement de troubles à médiation immunitaire.

Cellules HEK293 vivre D2R + et HEK293 CTL ont été acquises à la cytométrie en flux en utilisant un échantillonneur à grand débit. Lors de l&#39;analyse, les cellules ont été déclenchés en fonction de diffusion vers l&#39;avant (de taille) et diffusion latérale (granularité) paramètres (Figures 1A et 1D). Des cellules HEK293 transfectées ont exprimé la molécule rapporteur, la GFP, dans le cytoplasme, et les cellules non transfectées ont été exclu...

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High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Au cours des dernières années, des essais à base de cellules vivantes ont été utilisées avec succès pour détecter des anticorps contre les antigènes de surface et de conformation. Ici, nous décrivons une méthode utilisant un écoulement à haut débit cytométrie permettant l&#39;analyse de grandes cohortes de patients. Détection de nouveaux anticorps permettra d&#39;améliorer le diagnostic et le traitement des troubles du système immunitaire à médiation.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

high-throughput-flow-cytometry-cell-based-assay-to-detect-antibodies

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JoVE Journal

Medicine

16.0K vues.  The University of Sydney.  Au cours des dernières années, des essais à base de cellules vivantes ont été utilisées avec succès pour détecter des anticorps contre les antigènes de surface et de conformation. Ici, nous décrivons une méthode utilisant un écoulement à haut débit cytométrie permettant l'analyse de grandes cohortes de patients. Détection de nouveaux anticorps permettra d'améliorer le diagnostic et le traitement des troubles du système immunitaire à médiation....