이 작품은 건강, 국립 암 연구소 (1R21CA141039), BD Biosciences는 연구 그랜트 수상, 암 퍼듀 대학 센터 미국 암 학회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (IRG # 58-006-53)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 연구 및 건강 연구 및 앨버타 암위원회 연구 이니셔티브 프로그램의 캐나다 연구소. MP는 건강의 국립 연구소, 국립 암 연구소, 암 예방 인턴쉽 프로그램에 의해 지원되었다 (R25CA128770, PI : D. Teegarden) 종양학의 과학 센터와 퍼듀 대학에서 발견 학습 연구 센터에 의해 관리.

1. 사전 준비 <ol><li> 4 ° C에서 멸균 혈청 피펫과 피펫 팁을 유지 문제 해결 : 실온 (RT)에서 리겔 젤, 차가운 피펫 및 팁을 사용하여이 문화를 설치하는 동안 겔에서 리겔을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 리겔의 병을 해동. </li></ol> 2. 시약의 준비 <ol><li> 피브로넥틴 스톡 용액의 제조 : 100 ml의 증류수에 100 mg의 인간 피브로넥틴 용해하여 피브로넥틴의 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 확인. 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 피브로넥틴이 용해되면, 살균 필터, 나누어지는 및 저장. 문제 해결 : 피브로넥틴 빠르게 용해 37 ℃에서 수조 세트에 몇 분을위한 솔루션을 품어하지 않는 경우 </li><li> 10X PBS의 준비 : 80 g 나트륨 염화물의 NaCl 14.4 g 나 2 HPO 4, 2g의의 KCl 2.4 g의 KH 2 PO를 녹이고 <suB&gt; 증류수 1 L에 4. 7.4, 살균 필터에 pH를 설정하고 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 중화 버퍼 (20)의 제조 : 1 M HEPES 및 10X PBS의 주식 솔루션을 사용하여 2 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 100 mM의 HEPES를 포함하는 솔루션을합니다. 7.0 용액의 pH를 조정한다. 2 ~ 3 개월 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 쥐의 꼬리 콜라겐 타입의 2 ㎎ / ㎖ 용액의 조제는 I : 중화 버퍼 (단계 2.3)에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 솔루션을합니다. 낮은 속도로 솔루션을 흔든다 아래로 pipetting에 의해 부드럽게 섞는다. 콜라겐이 매우 점성이기 때문에, 피펫 팅하면서 기포의 발생을 피한다. 그것은 신선한마다 콜라겐 I 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 사용할 때까지 얼음에 솔루션을 보관하십시오. </li><li> 내막 코팅 (분쇄)의 제조 : 1X &amp;에, 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 주식 (2.1 및 2.4 단계) 77 ㎍ / ㎖의 최종 농도 29 ㎍ / ㎖로 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 주식을 각각 혼합# 160; 멸균 PBS. 혼합 최대 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 복원 된 뼈 매트릭스 (RBM)의 제조 : <ol><li> 얼음에 Precool 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브. 항상 얼음에 모든 매트릭스 솔루션을 유지합니다. </li><li> 4 부 리겔 (리겔 농도가 로트마다 다르지만, 변화는 무시할 것으로 밝혀졌다), 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 2.5 부 첫 번째 피펫 리겔로 얼음에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I에 1 부를 혼합 튜브 차가운 피펫 팁을 사용하고 리겔은 4 ° C 이상의 온도에서 응고 시작, 그래서 리겔을 피펫 팅하는 동안 빠르게 작동합니다 피브로넥틴과 콜라겐 I.를 추가합니다. 거품을 도입하지 않도록, 아래로 피펫 팅에 의해 매우 부드럽게 행렬을 섞는다. RBM을 혼합하면서 얼음에 튜브를 유지합니다. </li></ol></li><li> 골수 증식 배지 (BMGM)의 준비 : 6.2 × 10 -4 M 염화칼슘, 10 -6 M 나트륨 숙시 네이트, 10-6 M의 하이드로 코티손, 20 %의 인간 혈장을 (포함 BMGM 500 mL로RPMI-1640) 정상 또는 건강한 기증자 또는 환자로부터 수집 된 악성, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. 염화칼슘, 나트륨 숙시 네이트, 및 하이드로 코티손 보충제는 1,000 X 주식 솔루션으로&gt; 6 개월 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 세포주를 성장하는 경우, 소 태아 혈청 (FBS)은 인간 혈장에 대해 치환 될 수있다. </li><li> 10 % 중성 포르말린 (NBF)의 제조 : 10 % V / V에서 PBS를 1 배인 37 % 포름 알데히드 원액 추가 잘 혼합하고 빛으로부터 보호 2 ~ 3 주간 상온에서 보관. </li><li> 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 제조 : BSA의 적당량을 달아 1X PBS에 녹여. 4 ° C에서 보관 1 주일 이내에 사용한다. BSA 솔루션은 더 이상 기간 동안 냉장 보관하면 오염 얻을하는 경향이있다. 대안 적으로, BSA 용액은 장기간 저장에 분취하고 -20 ℃에서 냉동 될 수있다. 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 세포 복구 솔루션 (CRS)의 제조 : 5 mM의 EDTA, 1 mM의 나트륨 바나 데이트 (나를 &lt;확인1X PBS 서브&gt; 3 VO 4), 1.5 mM의 불화 나트륨 (NaF로) 솔루션을 제공합니다. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 살균 필터 및 저장. </li></ol> 3. 비 악성 및 악성 인간 BM 세포의 내장 3-D 문화 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 플라크 피콜 구배 원심 분리에 의해 차 BM 단핵 세포를 정제 하였다. 선택 단계 : 세포가 배양 기간 동안 세포 증식을 수행하는 제조 업체의 지침에 따라 0.25 μM의 카르복시 디 아세테이트, 숙신 에스테르 (CFSE)으로 표시 할 수 있습니다. 문제 해결 : 세포가 CFSE 염색 후에 죽는다면, 농도가 세포의 종류에 따라 달라집니다로 CFSE의 양을 적정, 0.25 μM는 기본 BM 단핵 세포에 적합합니다. </li><li> 48 잘 조직 문화 처리 플레이트의 각 웰에 분쇄 솔루션 65 μl를 추가합니다. 웰의 전체 표면을 덮도록 균일 용액 깔아&gt; 30 부화RT에서 분. </li><li> 48 - 웰 플레이트의 웰 당 1X PBS 10 μL에서 0.5 × 10 6 세포의 밀도로 세포 현탁액을 준비합니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 잘 당 RBM 행렬의 100 μL와 세포 현탁액을 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting하여 세포와 RBM 행렬을 혼합, 거품을 도입하지 마십시오. 행렬의 겔화를 방지하기 위해 얼음에 셀 / 매트릭스 혼합물을 유지한다. 주 : RBM 시스템은 완전히 확장이다 사용 플레이트의 표면적에 기초하여 모든 시약 (매트릭스 및 매체)의 양을 조정 비 48 - 웰 포맷으로 시스템을 설정. 이에 따라 도금 될 셀의 수를 확장. </li><li> 나머지 렌드를 기음과 우물의 중심에 셀 / 매트릭스 혼합물을 추가합니다. 빠르게 균등 웰의 전체 표면을 덮도록 셀 / 매트릭스 혼합물을 확산. 37 ° C에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 놓고, 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터 행렬이 응고 할 수 있습니다. 흔들거나 표시하지 마십시오배양 중에 플레이트를 TURB. 문제 해결 : RBM 세포의 치우침을 방지 도금하기 전에 잘 혼합한다. 매 5 번째 잘 튜브 바닥에 침전 세포를 피하기 위해 도금 후 섞는다. 일단 도금 셀은 매트릭스에 표면 장력에 의한 웰의 바닥에 가라 앉지 않는다. 문제 해결 : RBM 세포의 치우침을 방지 도금하기 전에 잘 혼합한다. 매 5 번째 잘 튜브 바닥에 침전 세포를 피하기 위해 도금 후 섞는다. 일단 도금 셀은 매트릭스에 표면 장력에 의한 웰의 바닥에 가라 앉지 않는다. </li><li> 물을 욕조에 Prewarm BMGM는 37 ° C로 설정 </li><li> 30 분 후, 매트릭스가 제대로 설정했는지 확인하십시오, 그것은 플레이트가 기울어 때 움직이지 않는 층 같은 부드러운 젤을 형성 할 것이다. 따뜻한 BMGM 1 ㎖의 세포 / 매트릭스 층을 오버레이. 아주 부드럽게 매트릭스 피펫 매체 찢어을 방지하기 위해 사용 (드롭에 의해 드롭 분배)혈청 피펫. 37 ° C, 원하는 기간 동안 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터와 문화에 조립 된 RBM 문화를 놓습니다. 주 : 세포 생존율은 배지를 변경하지 않고 적어도 30 일 동안 유지된다; 매체 변경이 필요한 경우에만마다 배지의 50 %를 변경. 중요한 단계 : 그것은 차가운 온도가 이미 설정 행렬을 방해 하듯이 매체는 추운없는 것이 중요합니다. 그것은 부드러운 매트릭스 층을 깰 수에서 행렬의 맨 위에있는 매체를 분출하지 않도록주의하십시오. 문제 해결 : RBM 시스템에서 세포 생존 능력이 낮 으면, 셀 밀도가 BM 흡인로부터 일차 단핵 세포 이외의 세포를 사용할 때 실험적으로 결정되어야 할 수도있다. 세포 라인으로 작업 할 때 불후의 세포 라인은 기본 세포보다 빠르게 증식로, 세포 수 10 배 감소. </li></ol> 4. &#39;에서 매트릭스&#39;영상 <ol><li><strong&gt; 광학 현미경 <ol><li> 이미지 시야를 사용하여 직접 RBM에서 배양 된 세포, 미분 간섭 대비 (DIC), 공 초점 또는 매트릭스 약 1mm 두께로 원거리 촬상을 허용 다른 이미징 기법. 위쪽에서 아래쪽으로 이미지의 전체 문화를 현미경의 많은에서 사용할 수있는 Z-스택 기능을 사용합니다. </li></ol></li><li> 면역 형광 염색 팁 : 아래의 면역 염색 프로토콜은 염색 / 세탁 솔루션을 흡입 방지를 위해, 대신 접시를 기울 피펫을 사용하여 솔루션을 제거합니다. <ol><li> 피펫을 사용하여 BMGM를 제거하고 RT 1X PBS 100 μL / 세척 / 잘으로 2 배 씻는다. 충분한 PBS는 우물의 전체 표면을 커버하는 데 사용되었는지 확인합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 10 % NBF의 (48 - 웰 플레이트) 100 μL / 웰을 추가하여 행렬의 세포를 수정. NBF를 제거하고 RT 1X PBS 100 μL / 세척 / 잘로 두 번 세포를 씻으십시오. 주의: 그것은 행렬을 녹일 수 있으므로 감기 NBF를 사용하지 마십시오. </li><li> , PBS를 제거 밤새 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 실온에서 4 ° C에서 1 시간 동안 1 % BSA를 추가합니다. </li><li> 필요한 희석에 1 % BSA의 기본 항체 솔루션을 준비합니다. 희석은 제조업체에 문의하거나 최적의 항체 농도를 결정하는 적정, 각 항체에 따라 다를 것입니다. 차 항체 용액 100 μL / 잘을 추가하고 제조업체의 지침에 따라 배양한다. 중요한 단계 : 형광 또는 형광 염료에 접합 된 항체를 포함한 모든 배양은 어둠 속에서 수행해야합니다. </li><li> 차 항체 솔루션을 제거하고 5 분 1X PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 간접 면역 형광 염색의 경우, 실온에서 1 시간 동안 형광 프로브에 복합 이차 항체와 함께 배양한다. 제조업체에서 권장하는 농도의 1 % BSA의 항체를 희석. </li><li> 차를 제거ntibody 솔루션 및 5 분 1X PBS로 3 회 세척한다. 문제 해결 : 높은 배경을 방지하기 위해 촬영하는 동안, 형광 결합 된 이차 항체를 적정하고 적절한 신호를 제공하는 낮은 농도를 사용합니다. 하이 백은 여전히​​ 문제가있는 경우, 세척 단계의 수 및 지속 기간을 증가 시키거나 직접 접합 된 일차 항체를 사용하고, 단계 4.2.6 이동. </li><li> 핵은 제조업체에서 권장하는 희석에, &#39;-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI) 핵 염색 액을 4를 추가 얼룩, 그리고 실온에서 7-10 분 동안 부화. </li><li> 핵 염색 액을 제거하고 5 분 1X PBS로 2 배 씻는다. </li><li> 마지막 세척에서 PBS를 제거하고 형광을 유지하기 위해 샘플에 장착 매체의 드롭 (레귤러 세트)를 추가합니다. 형광 공 초점 현미경에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 이미지. 참고 : 이미지는 염색의 2 일 범위 내에서 실시 할 필요가매트릭스 및 RBM 무결성 및 형광 신호의 손실의 손실의 저하를 방지 할 수 있습니다. 바로 이미지를 만들지 않는 경우, 스테인드 샘플 영상까지, 빛으로부터 보호, 4 ° C에 보관해야합니다. </li></ol></li></ol> 5. RBM에서 세포의 분리 <ol><li> 매트릭스 층을 방해하지 않고 부드럽게 매체를 제거합니다. 대기음하지 마십시오. </li><li> 세척 세포는 멸균 1X PBS로 2 배. 대기음하지 마십시오. </li><li> 또한 각 얼음처럼 차가운 CRS의 0.5 ML을 추가하고 적극적으로 아래로 피펫 팅에 의해, 세포와 함께 전체 매트릭스 층을 제거. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포, 매트릭스, 그리고 CRS를 수집합니다. 얼음에 놓습니다. </li><li> 같은도에 추가로 0.5 ㎖ CRS를 추가하고 나머지 모든 자료를 수집합니다. 같은 microcentrifuge 관에 전송합니다. </li><li> 소용돌이 세포, 매트릭스, 그리고 CRS의 혼합물은 1 시간 동안 얼음에 품어. 소용돌이 세포는 매 15 분 행렬에서 방출을 촉진한다. </li><li> 1 시간, 눈에 보이는 덩어리 후 혼합물을 확인매트릭스의 존재해야한다. 문제 해결 : 행렬의 대단히 짧은 시간은 1 시간 후 계속 표시하는 경우, 더 큰 튜브에 세포를 전송 / 매트릭스 / CRS 혼합물, CRS의 추가 2-5 ML을 추가하고, 추가로 30 ~ 60 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 5 ~ 10 분 동안 1,000 rpm에서 CRS에 원심 분리기 세포 뜨는을 제거하고 차가운 1X PBS 1 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 5 ~ 10 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. PBS 세척을 한 번 더 반복합니다. </li><li> 두 번째 PBS 세척 매트릭스 고립 된 세포에서 세포의 회복, 세포 계측법 생체 이식 등 흐름, 이러한 DNA / RNA / 단백질 분리와 같은 다운 스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다 완료됩니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

RBM 모델은 BM의 세포 조성물을 30 일까지 생체를 유지하는 포괄적 인 시스템을 제공합니다. 자신의 기능이 밀접하게 생체 내에서 발견 된 BM 구조를 흉내에 따라 RBM 자기 충 성장 BM 세포. 더욱이,이 다발성 골수종 클론 (8)의 팽창을 허용 우선 시스템이다. BM 세포의 강력한 성장과 문화의 전반적인 성공을 보장하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1)&gt; 70 %의 생존 능?...

조직 배양은 본래 유기체에 각종 처리를 비교할 때 전신 변동성을 최소화하기 위해 제어 된 환경에서 세포 행동을 연구하기 위해 개발되었다. 이 방법은 먼저 1900 년대 초 1,2 년에 설립 된 조직 절편이 유리 접시에 생체 전 배양 기술을 언급했다. 1900 년대 중반의 시스템은 오히려 손상 조직의 조각보다 분산 된 세포가 성장하기에 적합하고, 용어 &#39;조직 문화&#39;와 &#39;세포 배양&#39;는 3 동의어가되었다. 이러한 종래의 세포 배양 시스템에서 셀은 다양한 성장 인자로 보충 된 성장 배지와 겹쳐 조직 배양 플라스틱의 표면에 성장된다. 자기편 세포 배양, 세포 부착 및 세포 현탁액에 전파되는 조직 배양 플라스틱 및 비 접착 성 문화에 확산 : 문화의 두 가지 유형의 다양한 세포의 접착 능력을 기준으로 등장했습니다. 셀의 초기부터문화, 다 불멸 세포주는 헬라 4, 제 인간의 암 세포주로 생성되었다. 이들 세포주는 세포 배양 물에서 무기한 증식하는 능력이 있고, 대부분의 생존을 유지하기 위해 특별한 처리를 필요로하지 않는다. 원래의 세포 배양 방법의 환원 주의적 접근 방식은 세포 생존과 증식을 유지하기 위해 필요한 경우에만 최소한의 구성 요소를 포함하여 가능한 한 많은 시스템을 단순화하도록 설계되었습니다. 그러나 단순화 된 세포 배양 방식은 유한 한 수명을 가진 생체 가장 기본 인간의 세포 유형을 지원하기 위해 실패합니다. 따라서, 새로운 문화 시스템은 따라서 세포 외식 생리 조건에서 성장할 수 있도록 최대한 조직의 미세 환경에 근접하도록 설계되고있다. 종래 / 환원 세포 배양 방법, 3 차원 (3-D)과는 대조적으로 배양 시스템은 이제 다양한 효율적 문화 바람직한 방법이되고있다인간의 세포 선 및 일차 전지는 이후에 지원 미세 환경의 맥락에서, 건강과 질병에 관련된 메커니즘을 연구합니다. 이러한 3-D 시스템은 일반적으로 관심의 세포 유형을 연구하는 조직의 미세 환경을 요점을 되풀이하기 위해, 성장 인자 보충 복원 행렬 및 / 또는 매체를 사용하여 설정된다. 이러한 3 차원 (3-D) 배양 모델의 첫번째는 유선 개발을 연구하기 위해 개발되었다. 유방 상피 세포가 리겔에 포함 된 기본 조건, 콜라겐 IV와 세포 외 기질 (ECM)의 라미닌이 풍부한 소스와 세포를 제공하고, 성장 매체와 겹쳐합니다. 이러한 조건 하에서, 유선 상피 세포가 유방 꽈리 닮은 클러스터를 형성하고, lactogenic 호르몬 자극시, 선포 세포는 이러한 꽈리 같은 구조의 중공 lumena으로, 감기 및 다른 우유 단백질을 분비. 카제인 분비도 프로락틴 5 첨가 한 후 표준 문화에서 관찰되지 않았다, 상기 세포의 형태 학적 표현형에 미세 환경을 보존하는 역할을 강조. 세포가 자신의 생리 미시의 문맥 촬영 정상적인 세포 기능의 손실의 또 다른 데모지지 미세하지 않고, 각질 세포가 층상 표피 (6)를 형성하는 데 실패하는 데모입니다. 다른 3-D 모델의 수는 기본 세포의 생체 전파 7,8를 할 수 있도록 만들어졌다. 세포 행동의 미세 환경의 중요한 역할은 우아하게 매트릭스 때 콜라겐 배양 유방 상피 세포가 리겔에 형성 올바르게 편광 선포 세포에 비해, &quot;내부 아웃&quot;선포 세포를 형성 연구에서 입증되었다. 라미닌 생산 근 상피 세포가 콜라겐 I 배양 9에 추가 된 경우에 적절한 형태의이 손실은 복귀했다. 또한, 올바른 미시는 정확한 필요합니다유전자형 표현. 접시에 성장, 세포 - 세포 접착 분자 CEACAM1로 형질 MCF7 유방암 세포는 형질 감염되지 않은 CEACAM 음성 세포와 완전히 동일하게 동작. 그러나, 비 악성 유방 상피 세포 (10)에 설립되었습니다로 CEACAM1로 형질 MCF7 세포는, 중공 lumena와 정상 표현형과 양식을 선포 세포로 복귀하면서 ECM, 야생형 MCF7 양식 종양 같은 구조와 접촉, 리겔에 배양 하였다. 마찬가지로, β1-인테그린 유방암 세포를 차단하면 표준 배양 조건에서 동작을 변경할 수 있지만, 3-D 문화에서 수행 된 동일한 실험은 β1-인테그린을 차단하는 것은 정상적인 표현형 (11)에 악성 세포를 되돌 설명하지 않습니다. 따라서, 미시 조직은 세포 생존을 유지하기 위해 요구되지 않고, 또한 적절한 세포 기능을 유지하기 위해. 셀의 동작은 생리적 조건 하에서 연구 될 수있는 시스템을 제공하는 것 외에도의는, 3-D 문화는 새로운 치료제 8,12,13의 전임상 시험을위한 견고하고 신뢰할 수있는 매체를 작동합니다. 3-D에서 세포를 배양하면 세포 - 세포 및 세포 - ECM 부착의 기여가 평가 될 수있는 환경 매개 약제 내성 (14)의 조건에서 조사 화합물의 검사를 할 수 있습니다. 또한, 새로운 화합물의 오프 대상 독성은 다양한 조직의 여러 세포 구획을 통합하여 확인 될 수 있습니다. 이러한 화면은 더 빠르게 수행하고 비용 효율적인 생체 8 비교 연구보다 될 수있다. 여기에서 우리는 정상 및 악성 골수 (BM) 세포가 밀접하게 인간의 BM의 미세 환경을 흉내 낸 시스템에서 체외 증식 복원 골수 (RBM)의 3-D 모델의 설정을 제시한다. BM 기질의 다양한 구성 요소와 함께 2-D의 문화, 액체 또는 부착 공 배양에 인간의 기본 BM 세포를 성장 이전 시도, 3-D, 반 고체 한천 문화로 인해 조직의 미세 15-18의 구성 요소와 세포를 공급하는 그들의 무능력에 제한된 성공을 만났다. 이러한 시스템에서 기본 BM 세포는별로 가능성이 있고 생체을 증식하는 데 실패했습니다. 인간 BM 전구 세포는 BM 간질 세포와 공 배양 타원체에서 재배되는 다른 시스템은 조혈 줄기 세포 생존 및 증식이 적어도 96 시간 지속 된 19 3-D 시스템이다. 조혈 전구 생물학의 이해에 매우 유용하지만, 그러나,이 시스템은 충실히 그 유용성을 제한, 따라서 ECM 구성 요소의 부재로 인해 BM의 미세 환경을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기에 설명 RBM 모델은 인간의 BM 셀룰러 및 세포 외 구획은 시험 관내에서 재구성되는 포괄적 인 시스템을 제공한다. 우리는 RBM의 문화가, 정상적인 인간의 BM 세포의 체외 성장을 지원할 수있는 쇼로 우리각종 혈액 질환을 가진 환자에서 분리 된 세포와 같은거야.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

조직 문화는 정상적인 발달에서 질병, 세포 기능의 여러 측면을 연구하는 귀중한 도구이다. 종래의 세포 배양 방법은 조직 배양 접시의 고체 기질에 부착하는 액체 매질에 현탁 성장하거나 세포의 능력에 의존한다. 다수의 불멸의 세포 라인은 기본 세포가 생체 성장해야 할 경우에는이 방법이 자주 실패, 생성과 같은 방법을 사용하여 재배하고 있습니다. 이러한 실패는 조직 배양 플라스틱은 세포 성장을위한 표면으로서 사용되는 표준 시스템에서 미세 조직의 적합한 세포 외 기질 성분의 부재에 기인 한 내용. 세포 외 기질은 조직의 미세 환경의 핵심 구성 요소이며 그 존재는 세포 편광, 생존, 증식 등의 생리 기능의 유지 보수를 위해 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 3 차원 조직 배양 방법 차 골수 CEL을 제시LS는 인간의 뼈 (RBM 시스템)의 미세 환경을 요점을 되풀이 공식화 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 재배된다. 세포 외 기질에 포함 된 세포 따라서 기본 조직의 세포 구성을 유지하면서 세포의 생존과 증식이 최대 30 일 동안 지속 할 수있는 종합적인 시스템을 제공, 인간 혈장 보충 매체를 통해 영양소와 함께 제공됩니다. RBM 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 정상 기증자와 환자 아밀로이드증, 각종 혈액 학적 악성 종양에서 차 골수 세포를 성장. RBM 시스템은 새로운 치료제의 전임상 효능의 세포 행동 및 평가의 직접,있는 매트릭스 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 세포로부터 단리 RBM이어서 생체 내 이식, 세포 분류, 유동 세포 계측법, 핵산 및 단백질 분석에 사용될 수있다. 종합적 RBM 방법은 일차 뼈 MARRO의 성장을위한 신뢰성있는 시스템을 제공한다생리 학적 조건에서 W 셀.

일차 골수 세포는 표준 조직 배양 조건 하에서 증식하는 데 실패하기 때문에, RBM 시스템 밀접 문화 제공 시스템, 골 미세 환경을 모방하고 생체 BM 세포를 확장하기 위해 만들어졌다. BM 세포 외 기질, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 (21)의 주요 구성 요소는 3-D 문화에 구조 발판을 제공하기 위해 RBM의 행렬로 통합되었다. Endosteum, 콜라겐 I과 fibronectin의 풍부한 뼈와 BM 사이의 ?...

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A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K 조회수.  Purdue University.  표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

연구

의학

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...