Biz içtenlikle MATLAB programı ve New Jersey histopatoloji tesis ve mikroskopi tesisin Kanser Enstitüsü ile ona yardım için Dr Wenjin Chen teşekkür ederim. Biz de onların görüş ve önerileriniz için teşekkür değerlendirenler. Bu çalışma, Raymond ve Beverly Sackler Araştırma Vakfı tarafından desteklenmektedir.

1. % 1 agaroz-kaplı 24-kuyulu plakanın Hazırlanması <ol><li> Agaroz sterilize etmek için 250-500 ml şişe ve otoklavda 100 ml deiyonize su ile 1 gr agaroz (RPI, A20090-500) ekle (121 ° C, 15 psi, otoklav makinede 15 dk). Bir 70 ° C su banyosuna sterilize agaroz ile şişe aktarın. Agaroz bununla ilgili bir saat sürer 70 ° C&#39;ye kadar soğutuldu, ne zaman döküldü üzere hazırdır. Her zaman agaroz steril tutmak için emin olun. </li><li> 24-iyi düz alt plakalar (Falcon, 353.047) elde edilir; plakalar bir faz-kontrast mikroskop altında yansıma olabilir eğer 24 sıra düz alt levhaları her türlü çalışır. </li><li> Biyogüvenlik kabini ve de eşit kapak yapmak için de etrafında girdap agaroz bir Eppendorf Repeater pipet ile her kuyuya agaroz 200 ul dağıtın. Agaroz 200 ul sferoidler tutarlıdır yuvarlak şekillerde oluşturacak şekilde, bir içbükey yüzeyi oluşturmak üzere uygundur. Az 200 ul agaroz olmayabilirde tamamen kapsayacak, ancak 200&#39;den fazla ul agaroz içbükey yüzeyi ve üzerinde yetiştirilen sferoidler kuramazlar küresel şekillere olmayabilir. </li><li> Agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar yaklaşık 10 dakika içinde kullanılmak üzere hazırdır. (İsteğe bağlı) önceden tohum hücrelerinin kültür ortamı ile agaroz dengelemek için orta 100 ul ekleyin. </li><li> Alternatif olarak, agaroz tamamen katılaşmış sonra, her kuyuya 100 ul besi ekleyin ve steril koruyucu bant (Nunc, 236.366) ile tabak kapatın. Bu plakalar bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> Tüm deneyler bir biyogüvenlik kabini içinde standart aseptik teknikler kullanılarak yapılır ve belirtilmediği sürece, tüm kültürlerin, havada% 5 CO 2 ile 37 ° C nemli inkübatör yetiştirilmektedir. </li><li> İnsan pankreas NET BON-1 hücreleri% 10 fetal bovin serumu (FBS, Invitrogen ile DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) içinde tutulur100 mm 16.000-044) orta x 20 mm steril doku kültürü çanak (Corning, 430167). </li><li> Tek tabakalı BON-1 hücreleri% 70-80 konfluent ulaştığında, orta kaldırılır. 37 hücreleri, 5 dakika inkübasyon ile 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) eklenerek ° C ile iki kez PBS ile yıkandı, ve bulaşık uzaklaştırıldı edilir TrypLE tripsin benzer, ancak 15 stabildir - 30 ° C de 4 ° C. Tüm hücreler çanak ayrılmış emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. </li><li> Tripsinize hücrelere 9 ml besiyeri ekleyin ve bir daha tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için birkaç kez aşağı hücrelerin Pipeti ve bir pipet kullanın. </li><li> Hücrelerin filtre 70-um hücre süzgecinden (Fisher, 22.363.548) kullanın. </li><li> Hücreleri toplayın ve Guava PCA-96 Base System (Millipore) kullanarak bir hücre sayımı yapmak. </li><li> % 10 FBS büyüme medyumu ile fenol-free DMEM/F12 ml başına 5.000 hücre, bir süspansiyon hazırlamak. </li></ol> 3. Sfero Kültür <ol><li> Tek Overlay 200 ulHücre agaroz-kaplı 24-iyi levhaya süspansiyonlar ve buharlaştırma önlemek için steril sızdırmaz bantla 24-kuyucuklu plaklar içinde sızdırmazlık. </li></ol> Not: - kaplanacaktır hücrelerin sayısı gün 6 parçacıklarının boyutuna göre ampirik olarak tespit edilmelidir; parçacıklarının 300-400 mikron çapında ilaç tedavisine başlamak için ideal bir boyutu olacaktır; 1000 BON-1 ve H727 hücrelerinin levhalara edilir. - 3D hücrelerin canlılığı hakkında günlük 10 (veri lığa, gösterilmemiştir) düşüş başlarsa çünkü 6 gün sonra ilaç tedavileri başlayan önermiyoruz. <ol start="2"><li> Havada% 5 CO2 içeren bir 37 ° C&#39;de bir gece boyunca nemli bir inkübatörde az 40 rpm&#39;lik bir karıştırma çok yavaş bir çalkalamalı BON-1 hücreleri ile birlikte yukarıda agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar yerleştirin. Sonra kültürleri büyüyen tutmak için istikrarlı bir platform için bu plakaları taşıyın. </li><li> Yukarıda plakanın her oyuğa 200 ul büyüme medyumu eklemes 3 günde. Sferoidler Rahatsız etmeyin. Iyi tarafına pipet dokunmadan ve kuyunun içine orta akış aşağı vererek her kuyunun duvarı boyunca orta eklemeyi deneyin. </li><li> Bir mikroskop altında 24-kuyucuklu plaklar içinde steoid oluşumu izler. </li></ol> 4. İlaç Tedavisi <ol><li> Sferoidler gün 6 çapı 300-400 mikron çapında ulaştığınızda, 3D sferoidler ilaçlarla tedavi edilir. Bu ilaç tedavisi için günlük 0 olarak ifade edilir. </li><li> Günlük 6, plakanın her ortam yaklaşık 400 ul içerir. 8 için yeterli çoğaltır olan bir 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml büyüme medyumu içinde ilacı stok yapılır ilaç tedavileri tedavileri için her bir doz, her sıra, 3x seri seyreltiler in 1x son konsantrasyonda olduğundan emin olmak için. </li><li> 24-kuyulu plakanın her bir sıradaki sferoidler araç, dozu 1, 2, 3, 4 ve 5 olarak sınıflandırılır. 4 (bakınız bir 24-kuyucuklu plak üzerinde tedaviler, her doz için çoğaltır vardır <strong&gt; Tablo 1). Biz genellikle en az en az 8 yapar tedavilerin her doz için çoğaltır 2 24-iyi plakaları, 3D sferoidler davranın. </li><li> 4 az 5 dakika boyunca 800 rpm&#39;de 24-iyi plaka aşağı spin ° sızdırmazlık bandı üzerindeki tüm terlemeyi iyi gider emin olmak için C. 3D parçacıklarının yüzer özelliği nedeniyle, her bir yanı içerisinde orta parçacıklarının rahatsız etmeyecek kaldırılır. </li><li> Dikkatli bir şekilde, her sıra ile duvarı boyunca uygun kuyulara, her doz yukarıda hazırlanmış tedavilerin 200 ul ilave edin. </li><li> Sızdırmazlık bandı ile 24-iyi yüzeyleri ve 37 kültürler inkübe ° C hava içinde% 5 CO ile nemlendirilmelidir inkübatör 2. </li><li> Gerekirse, 72-96 saat sonra tedavi dozu ile ilgili olarak, her sıra sferoidler çekilmek. </li></ol> 5.. Monitör 3D Sfero Kültürler <ol><li> T Her kuyu başında ilaç tedavileri sonrasında her seçilen zaman noktası (0, 24, 48, 72 saat) olarak, sferoidlero 24-iyi plaka 5x objektif kullanarak Zeiss Axiovert 200/M-based faz-kontrast mikroskobu ile görüntülenmesi işlemidir. </li></ol> Not: Görüntüler mikron ve piksel arasında bir kalibre ölçekleme ile herhangi bir ışık mikroskobu alınabilir. Sferoidler hızlı bir şekilde 10x hedefi ile görüntüleme alanında büyümek çünkü 5x hedefi idealdir. <ol start="2"><li> Sfero analizi ile ham görüntüleri Zeiss AxioVision 4.8.2 Yazılımı kullanarak elle yapılabilir. </li><li> Alternatif olarak, geliştirilmiş özel bir MATLAB programı otomatik / yarı-otomatik parçacıklarının boyutunu tahmin etmek için kullanılır. Otomatik program doğru verilen bir görüntüde sfero kontur bulmak ve otomatik olarak büyük (L) ve ikincil (W) eksenleri ölçmek için aktif kontur algoritması 4 uygular. Aynı algoritmasının bir yarı-otomatik versiyonu kullanıcılar kuvvetli dışlayıcı mevcut olduğunda programına başlatmak için olanak sağlar. Tüm görüntüleri TIFF veya JPEG dosya formatları olarak ihraç gerekirprogram tarafından okunacak ham görüntüleri. Sfero hacmi 0,5 x L x W 2 olarak tahmin edilmektedir. </li></ol> 6. NET 3D parçacıklarının HistoGel gömme <ol><li> 10-24 sferoidler, 2 saat süreyle% 10 formalin içinde çözülmüştür, iki kez PBS ile yıkandı, 24-kuyucuklu plaklar alınan% 50 ile yıkanır ve 15 dakika süreyle% 70 etanol iki kez, sırası ile, ve HistoGel gömme için hazırdır. Alternatif olarak, birkaç ay süreyle 4 ° C&#39;de% 70 etanol içinde tutulabilir. </li><li> Soğuk HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) bir tüp su dolu bir kabı konur. Kabı 1 dakika süreyle bir mikrodalga fırın içerisinde ısıtılması ve jel tamamen sıvılaştırılmış kadar, daha sonra her zaman aynı su dolu beher içinde tutulur. </li><li> Yukarıdaki% 70 etanol içinde sferoidler bir kürdan kullanarak bir biyopsi cryomold (Doku-Tek, Sakura Finetek, 4565) aktarılır. Tüm sferoidler transfer olduğundan emin olun. Sferoidler biyo dibine batırmak için bir dakika bekletinpsy cryomold. Kimwipes ile biyopsi cryomold içinde sıvı kurtulmak ve bu arada, çok nazikçe atılabilir plastik Pasteur pipeti kullanarak biyopsi cryomold altındaki merkezine sferoidler itmeye çalışın. Bu aşama, bir mikroskop altında yapılabilir daha kolay olabilir. </li><li> Isıtılmış HistoGel ince bir tabaka biyopsi cryomold altındaki sferoidler stabilize etmek için biyopsi cryomold ilave edilir, bu arada, kürdan çok yavaş bir şekilde biyopsi cryomold altındaki merkezinde sferoidler tutmak için kullanılır. Biyopsi cryomold altındaki sferoidler istikrar için yeterli çok HistoGel ekleyebilir ancak etmeyin. </li><li> Sferoidler / HistoGel oda sıcaklığında veya HistoGel katılaşmış dek 1-2 dakika bekletin. Sonra ısıtılmış HistoGel ile biyopsi cryomold geri kalanını doldurun. </li><li> Yaklaşık 10 dakika için oda sıcaklığında katılaşmaya izin verir. </li><li> Hemen önce biyopsi cryomold, lea gelen sferoidler / HistoGel bloğu dışarı haşhaş içinbozulmadan sferoidler / HistoGel blok yuvalarından yardımcı 1 dakika, 4 ° C &#39;de bir ettik. Sferoidler / HistoGel blok sonra Bio-saran bir parça (Surgipath, 01.090) sarılmış ve bir doku ve biyopsi kaset (Fisher Scientific, 15-182-701D) konur. Doku ve biyopsi kaset% 70 etanol ile bir kap içinde saklanır. Daha sonra parafin gömme için rutin doku işleme prosedürleri takip edilmektedir. 5 </li><li> Parafin blok 3-mikron kalınlığında tabaka slaytlara kesitli olabilir. Slaytlar histolojik değişikliklerini belirlemek için hematoksilin ve Eozin ile boyanmış edilebilir ve ayrıca immünohistokimyasal boyama için de kullanılabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar İnsan pankreas nöroendokrin tümör hücre hatları BON-1 (Kjell oberg, Uppsala Üniversitesi, İsveç tarafından Verto Enstitüsü sağlanan), QGP-1 (Japon Sağlık Bilimleri Vakfı, Osaka, Japonya), ve insan akciğer nöroendokrin tümör hücre hattı H727 (ATCC) idi Bir agaros üzerinde yetiştirilene-kaplı 24-kuyulu plakalı. Şekil 1 &#39;de görüldüğü gibi, üç hücre çizgileri, farklı morfolojisi göstermektedir. BON-1 ve H727 hücreleri 3D sferoidler oluşmuştur. Mikroskop altında, H727 hücreleri BON-1 hücrelerden daha sıkı ve daha kompakt sferoidler gösterdi. Biz, H727 hücreleri hücre-hücre yapışması için artan bir kapasiteye sahip ve bir sonuç olarak daha sıkı bir birleşme oluştururlar hipotez. QGP-1 hücreleri sferoidler olarak kabul edilmemekte, büyük üzüm benzeri gözenekli kitleler, göstermektedir. Son yıllarda pankreas nöroendokrin tümör araştırma yükselen ilgi nedeniyle, BON-1 hücreleri rakamlar geri kalanı için kullanılır. Agaroz kaplı 24-iyi plaka üzerinde BON-1 hücreleri tohumlama sonra, çok hücreli sferoidler oluşumu genellikle 3. veya 4. gün ile oluşur sferoidler 6. gün yuvarlak olurlar. Besin ve oksijen sınırlaması nedeniyle, parçacıklarının yoğun çekirdekli hücreler günde 10 civarında ve günde 17 ile ölmeye başlar, sferoidler nedeniyle büyük olması ya da öylesine dağılmaya başlayabilirBana durumlarda nekrotik çekirdek ejeksiyon. Sferoidler genellikle çapı 1.000 mikron kadar büyüyebilir. Şekil 2 BON-1 3D parçacıklarının oluşumu, büyüme ve dağılma bölümlerini gösterir. Sferoidler 300-400 mikron çapında ve hücreler yüksek canlılığı (lığa) muhafaza olduğumuzda İlaç tedavileri başlandı. Gün 6 3D sferoidler ilaç tedavileri için başlangıç ​​noktası olarak seçilmiştir. Bu histon deasetilaz inhibitörleri NET hücreleri üzerinde antiproliferatif ve proapoptotik etkiler göstermiştir olduğu rapor edilmiştir. 6 We A (TSA) 3D NET sferoidler üzerine ilaç tedavileri etkisini göstermek için bir örnek olarak kullanılabilir. Şekil 3A gösterir histon-deasetilaz inhibitörü-trichostatin tercih TSA. Şekil 3B, tedavi etmeye 3D parçacıklarının morfolojisi TSA (Sigma, T8552) tedavisi üzerine 3D parçacıklarının hacmi gösterir. Her bir steoid boyutu, bir cus tarafından otomatik olarak tahmin edildiMATLAB bilgisayar programı tom-geliştirdi. 4 A elle çizim adım, verilen bir resimde Kenara yakın olan sferoidler, edinmelerine yardımcı eklendi. En az 8 sferoidler her bir zaman noktasında TSA tedavilerin doz başına ölçüldü. Her 3D sfero hacmi 0.5 x Uzunluk x Genişlik 2 olarak hesaplandı. Gibi taşıt göreli Şekil 3A ve 3B, görüldüğü gibi, şekillerde gösterildiği TSA her doz BON-1 3D parçacıklarının büyüme inhibisyonu bir dereceye göstermiştir. Bunların arasında, 125 nM ve TCD ile 250 nM arasında konsantrasyonları kuvvetli 3D sferoidler büyümesini bastırılmış ve 96-saatlik bir zaman noktasında hücre ölümüne yol açmıştır. NET 3D parçacıklarının histoloji anlamak için, bir H &amp; E ve immunohistokimyasal (İHK) boyama 17 gün kültüre edildi 3D sferoidler yapıldı. Şekil 4A önemli olan, HistoGel gömme için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem gösterilmektedir 3D spher ait parafin gömme için adım<html> kortikostereoidlerle. Şekil 4B H &amp; E boyama, bölünmüş kaspaz-3 (apoptotik hücreleri için bir belirteç) ve Ki-67 immünohistokimyasal (hücreler prolifere için bir belirteç) 3D sferoidler üzerindeki antikorlar, 17 gün boyunca kültüre edilmiş gösterir . 3D sferoidler çekirdek içinde hücreleri çoğunlukla nekrotik / apoptotik ve dış katman etkin bir hücre proliferasyon edilir. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. NET 3D parçacıklarının morfolojisi. Üç insan tümör hücre çizgileri nöroendokrin gelen 3D sferoidler agaroz-kaplı 24 oyuklu plakalar üzerinde oluşturulmaktadır. 1000 BON-1, H727 ve QGP-1 hücreleri agaroz-kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine ekildi ve protokolü de gösterildiği gibi, normal bir fizyolojik durumların içinde büyütülmüştür. Bu 10 gün kültüre edildi QGP-1 için BON-1 ve H727 veya hücre agrega, 3D parçacıklarının görüntülerdir. 18/4218fig2.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 2 &quot;/&gt; Şekil 2. BON-1 3D parçacıklarının Büyüme Takibi BON-1 3D parçacıklarının büyüme izleme:. Oluşumu, büyüme ve 3D parçacıklarının parçalanması. Protokolü ayrıntılı olarak, 1000 BON-1 hücreleri agaroz-kaplı 24-iyi plaka üzerine kaplanır. Hücreler gecede fizyolojik bir durum bir çalkalamalı% 10 FBS ile standart bir DMEM/F12 ortamda üretilir, daha sonra istikrarlı bir platform üzerinde taşındı ve aynı şartlarda yetiştirilir. 3D hücrelerinin büyümesini izleme kaplama sonraki ilk saat boyunca 5 görüntüleme hücreler her saat takiben, ve daha sonra bir Zeiss Axiovert ile birlikte, her 1-3 günde bir 5x amacı kullanılarak faz kontrast mikroskobu 200/M-based edildi. İlk kitleler halinde toplu hücreler, sonra çok hücreli agrega, küçük sferoidler, büyük sferoidler ve sonunda sferoidler dağılacağı oluşturur. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. BON-1 TSA Tedavi3D sferoidler. (A) TSA tedavisi üzerine 3D parçacıklarının Görüntüler. Tedavi grubu: V - Araç (0.0025% DMSO); D1 doz 1 (15.625 nM TSA), D2-2 doz (31,25 nM TSA), D3: doz 3 (62.5 nM TSA), D4: doz 4 (125 nM TSA ); D5: doz 5 (250 nM TSA). Tedavi Süresi: 0 H - Zaman noktaya günde 6 3D sferoidler başlayan tedaviler olduğunu, tedavi başladıktan sonra 24 H 48 H 72 H ve 96 H zaman noktaları vardır. 3D sferoidler her noktada daha önce olduğu gibi de görüntülendi. TSA tedavisi üzerine 3D parçacıklarının (B) Büyüme. (A) &#39;in 3D parçacıklarının majör (L) ve hafif (B) ekseni tedavisi, her bir zaman noktasında (0, 24, 48, 72 ve 96 saat) olarak Matlab programı tarafından otomatik olarak tahmin edildi. 3D parçacıklarının hacmi 0,5 x L x W 2 olarak tahmin edilmiştir. Grafikte steoid hacmi 8 ortalama çoğaltır olduğu ve bir hata çubuğu 8 çoğaltır baz hesaplandı. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" /> Tablo 1.Bir 24-kuyucuklu plak üzerinde ilaç tedavileri düzeni <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="Şekil 4A" /> Şekil 4A. HistoGel gömülmesi için 3D sferoidler Süreç bir Yöntemi İllüstrasyon. HistoGel gömme ve 3D sferoidler (A) HistoGel gömme için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem genel bir bakış, immünohistokimyasal için 3D sferoidler işlemek için bir yöntem. 3D sferoidler biyopsi cryomold aynı düzeyde, daha sonra HistoGel / sferoidler blok Bio-atkıları mavi sarılmış ve parafine gömme için sarı biyopsi kaset aktarıldı olmak için bir HistoGel içinde muhafaza edildi. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="Şekil 4B" /> Şekil 4B. H &amp; E Boyama ve gün-17 3D parçacıklarının immünohistokimyasal boyanma. (B) H &amp; E boyama, immünhistokimyasal Ki-67 boyanma ve 17 günlük 3D parçacıklarının parçalanabilen Kaspaz-3. Paraffin gömülü kesitli slaytlar deparaffinized olduğunu ve antijen alımı CCI (Hücre Kondisyon Çözüm, Verana Medical System, # 711-065-152) kullanılarak yapıldı. Tavşan poliklonal Ki-67 antikoru (Abcam. # Ab833) ve parçalanabilen kaspaz 3 antikoru (Celi Technology Sinyalleşme, # 9661), oda sıcaklığında 1 saat boyunca, sırasıyla, 1:75 ve 1:200 bir konsantrasyonda uygulanmıştır. Anti-tavşan sekonder antikoru (Jackson Immunolab, # 711-065-152) kromojenik saptama kiti DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124), ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1:500 uygulanmıştır. Slaytlar Hematoksilin ve susuz ile zıt ve Ksilen gelen coverslipping önce temizlendi.

<ol>
	<li>Taal, B. G., Visser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+neuroendocrine+tumours.">Epidemiology of neuroendocrine tumours.</a> Neuroendocrinology. 80, 3-7 (2004).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protocol. 4, 309-324 (2009).</li><li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+contours+without+edges.">Active contours without edges.</a> IEEE Trans Image Process. 10, 266-277 (2001).</li><li>Olert, J., Wiedorn, K. H., Goldmann, T., K&#252;hl, H., Mehraein, Y., Scherthan, H., Niketeghad, F., Vollmer, E., M&#252;ller, A. M., M&#252;ller-Navia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOPE++Fixation:+A+Novel+Fixing+Method+and+Paraffin-embedding+Technique+for+Human+Soft+Tissues.">HOPE Fixation: A Novel Fixing Method and Paraffin-embedding Technique for Human Soft Tissues.</a> Pathology-Research and Practice. 197, 823-826 (2001).</li><li>Baradari, V., Huether, A., H&#246;pfner, M., Schuppan, D., Scher&#252;bl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiproliferative+and+proapoptotic+effects+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+gastrointestinal+neuroendocrine+tumor+cells.">Antiproliferative and proapoptotic effects of histone deacetylase inhibitors on gastrointestinal neuroendocrine tumor cells.</a> Endocr. Relat. Cancer. 13, 1237-1250 (2006).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+three-dimensional+basement+membrane+cultures+to+model+oncogene-induced+changes+in+mammary+epithelial+morphogenesis.">Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 9, 297-310 (2004).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+single-tumor+spheroids+for+high-throughput+cell+function+and+toxicity+analysis.">Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis.</a> J. Biomol. Screen. 11, 922-932 (2006).</li><li>Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Self-Assembly+of+Complex+Cellular+Aggregates+on+Micromolded+Nonadhesive+Hydrogels.">Dynamics of the Self-Assembly of Complex Cellular Aggregates on Micromolded Nonadhesive Hydrogels.</a> Tissue Engineering. 13, 2087-2094 (2007).</li><li>do Amaral, J. B., Rezende-Teixeira, P., Freitas, V. M., Machado-Santelli, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF-7+cells+as+a+three-dimensional+model+for+the+study+of+human+breast+cancer.">MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 1097-1107 (2011).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz, agaroz-kaplı 24-kuyucuklu plaklar kullanılarak insan nöroendokrin tümör hücrelerinden 3D çokhücreli steoid oluşturulması için basit, güvenilir, tekrar üretilebilir ve metodu göstermektedir. Bu tekniğin bir başarı homojen bir boyut ve hücrelerin sayısı sabit itibaren günde 6 tarafından üniform şekle sahip tek bir steoid elde etmek yeteneğidir. Anahtar adım kaplama sonraki ilk saat boyunca 16-24 NET hücreleri ile plakasının yavaş ajitasyon olup. Bu yöntem de uygulanabilir yaygın insan göğüs kanseri hücre hattı MCF-7 insan kolon kanseri hücre hattı HT-29 insan küçük olmayan hücreli akciğer kanseri hücre hattı H1299 ve insan embriyonik böbrek hücre çizgisi HEK-293. Hepsi terapötik ilaç ekranı (veri gösterilmemiştir) için üniforma ve kompakt 3D sferoidler oluşabilir. Çeşitli yöntemler 3D sferoidler üretmek üzerine bildirilmesine rağmen, 7-10 yöntemi özel plakalar veya reaktifler gerektirmez burada rapor ve böylece basit ve düşük maliyetlidir. Bizim yayınlanmamış veriler demonstratmonolayer 2D hücrelere kıyasla agaroz yetişen NET 3D sferoidler, geometrik ve moleküler vivo NET xenograft tümör taklit eden e. Bu, diğer insan kanser hücresi hatlarında yapılmış 3D sferoidler için rapor edilmiştir ne benzeridir. 3D hücre kültürü modeli 11,12 sınırlama tamamen herhangi bir ilaç ya da terapötik tedavinin etkinliğini in vivo test yerini olmasıdır çünkü 3D sferoidler bu açıdan vivo tümör farklı olan, avasküler tümör gibidir. Bununla birlikte, bu yöntem bazı açılardan in vivo in vitro gelen NET terapötik ilaçların boşluğu ve değerlendirmelerin köprü yardımcı olacaktır. Çok hücreli sferoidler üzerine immünofloresan boyaması büyüklüğü ve geometri yüzen 3D parçacıklarının ve konfokal mikroskop sınırlaması nedeniyle gerçekleştirmek çok zordur. Burada parafin için HistoGel gömme işlemek için bir yöntem göstermek3D parçacıklarının seri kesitli slaytlar, immünohistokimyasal izin, gömme. Bunun yanı sıra, bizim özel geliştirilen MATLAB programı doğru ve tekrarlanabilir, parçacıklarının boyutunu tahmin etkili ilaç etkinliğini izlemenize yardımcı olur, ve NET hastalar için ilaç geliştirme Yüksek verimli bir ekran dahil edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Medya </td><td> Gibco </td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE </td><td> Gibco </td><td> 12604 </td><td></td></tr><tr><td> 24-kuyucuklu plaklar </td><td> Şahin </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mM hücre süzgecinden </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td> Steril sızdırmazlık bantı </td><td> Nunc </td><td> 236366 </td><td></td></tr><tr><td> Trichostatin A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy

Nöroendokrin tümörler (NET&#39;ler) yılda 100, 000 kişi başına iki bir insidans, nadir görülen tümörlerdir ve hepsi insan tümörlerinin% 0.5 &#39;sini oluşturur. 1 lokalize hastalığı ile başvuran hastaların azınlık için ameliyat dışında, orada sistemik terapiye çok az veya hiç sağkalım avantajı. Bu nedenle, daha iyi NET&#39;ler biyolojisinin anlaşılmasında, özellikle de nonresectable veya metastatik nöroendokrin tümörü olan hastalar için yeni tedavi hedefleri tanımlamak için büyük bir ihtiyaç vardır. 3D hücre kültürü vivo tümör dokusu organizasyon ve mikroçevresindeki modellemelerinde alaka nedeniyle ilaç tarama için popüler bir yöntem haline gelmektedir. 2,3 3D çok hücreli sferoidler doğrudan 2D geçmeden daha zamanında ve daha az pahalı şekilde değerli bilgiler sağlayabilir hayvan hücre kültür deneylerinde (fare) modelleri. NET pat için yeni ilaçlar keşfi kolaylaştırmak içinients, insan NET hücre dizileri kullanılarak in vitro 3D modeli çokhücreli sferoidler bir geliştirmişlerdir. NET hücre dışı bir yapışkan agaroz-kaplı 24-kuyulu plakalı içinde kaplandı ve sonra kaplama 16-24 saat boyunca çok yavaş bir ajitasyon ile fizyolojik koşullar (% 5 CO2, 37 ° C) altında enkübe edilmiştir. Hücreler 3. veya 4. gün başlayan ve çok hücreli sferoidler oluştururlar. Sferoidler ilaç tedavileri başlatılır ve bu noktada 6. gün, daha küresel hale gelir. NET sferoidler üzerinde ilaç tedavilerinin etkinliği bir faz-kontrast ışık mikroskobu ile parçacıklarının morfolojisi, şekil ve boyutuna göre izlenir. Parçacıklarının büyüklüğü aktif bir kontur algoritmasına göre geliştirilmiş özel bir MATLAB programı kullanılarak otomatik olarak tahmin edilmektedir. Ayrıca, standart histolojik ve immünohistokimyasal tekniklerin kullanımına izin veren, bu 3D sferoidler üzerine HistoGel gömme işlemek için basit bir yöntem gösterilmektedir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu terapötik ilaçların etkisini incelemek NET hücre hatlarını kullanarak 3D sferoidler üreten ilk rapordur. Biz de bu 3D sferoidler üzerine histoloji yapıldı ve NET parçacıklarının büyümesi ve çoğalması tek bir ilacın etkisi bir örnek göstermiştir. Bizim sonuçlarımız NET sferoidler NET biyoloji ve ilaç geliştirme ileri çalışmalar için değerli olduğunu desteklemektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy at JoVE.com

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Biz nöroendokrin kanser hücre hatlarını kullanarak 3D çok hücreli sferoidler büyümek için basit bir agaroz bindirme platformu sunmak. Bu yöntem, endokrin tümör hücreleri üzerindeki terapötik ilaçların etkisini araştırmak için çok uygun bir yol sağlar. Bu da bize kanser tedavisi için insan nöroendokrin tümör sferoidler kurulmasına yardımcı olabilir.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

28.5K Görüntüleme.  Raymond and Beverly Sackler Foundation. Biz nöroendokrin kanser hücre hatlarını kullanarak 3D çok hücreli sferoidler büyümek için basit bir agaroz bindirme platformu sunmak. Bu yöntem, endokrin tümör hücreleri üzerindeki terapötik ilaçların etkisini araştırmak için çok uygun bir yol sağlar. Bu da bize kanser tedavisi için insan nöroendokrin tümör sferoidler kurulmasına yardımcı olabilir.

Video: Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Tıp

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable risks for normal tissue injury and the hazards of physical tumor miss. A first-of-its-kind SBRT platform achieves high-precision ablative radiation treatment through a combination of versatile real-time imaging solutions and sophisticated tumor tracking capabilities. It uses dual-diagnostic kV x-ray units for stereoscopic open-loop feedback of cancer target intrafraction movement occurring as a consequence of respiratory motions and heartbeat. Image-guided feedback drives a gimbaled radiation accelerator (maximum 15 x 15 cm field size) capable of real-time &#177;4 cm pan-and-tilt action. Robot-driven &#177;60&#176; pivots of an integrated &#177;185&#176; rotational gantry allow for coplanar and non-coplanar accelerator beam set-up angles, ultimately permitting unique treatment degrees of freedom. State-of-the-art software aids real-time six dimensional positioning, ensuring irradiation of cancer targets with sub-millimeter accuracy (0.4 mm at isocenter). Use of these features enables treating physicians to steer radiation dose to cancer tumor targets while simultaneously reducing radiation dose to normal tissues. By adding respiration correlated computed tomography (CT) and 2-[18F] fluoro-2-deoxy-&#7429;-glucose (18F-FDG) positron emission tomography (PET) images into the planning system for enhanced tumor target contouring, the likelihood of physical tumor miss becomes substantially less1. In this article, we describe new radiation plans for the treatment of moving lung tumors.

Stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) involves the precise delivery of high-dose radiation to cancer tumor targets. A novel SBRT platform offers a first-of-its-kind gimbaled radiation accelerator mounted within a pivoting O-ring gantry capable of dynamic image-guided tumor tracking. Here, we describe dynamic tumor tracking for lung targets.

Stereotaktik Ablatif Vücut Radyasyon Tedavisi için Dinamik Akciğer Tümör Takibi

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...