עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן (1R21CA141039), BD Biosciences מענק מחקר פרס, האגודה האמריקנית לסרטן המחקר המוסדי גרנט (IRG # 58-006-53), למרכז אוניברסיטת פרדו למלחמה בסרטן מחקר, והמכון הקנדי לבריאות מחקר והתכנית ליוזמות מחקר אלברטה סרטן הדירקטוריון. חבר הפרלמנט נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן, תכנית למניעת סרטן התמחות (R25CA128770; PI: ד טיגרדן) מנוהל על ידי המרכז למדעי אונקולוגית ומרכז המחקר למידה הגילוי באוניברסיטת פרדו.

1. הכנה מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C. פתרון בעיות: ג&#39;לי Matrigel בטמפרטורת חדר (RT); באמצעות טפטפות וטיפים קרים ימנע Matrigel מgelling במהלך הגדרת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוק Matrigel על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol> 2. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון מניות פיברונקטין: הפוך 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של פיברונקטין על ידי המסת פיברונקטין אדם 100 מ&quot;ג במים מזוקקים 100 מיליליטר. ברגע שפיברונקטין נמס, פילטר סטרילי, aliquot, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. פתרון בעיות: אם פיברונקטין אינו מתמוסס במהירות דגירה הפתרון לכמה דקות בסט אמבט מים ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 10x PBS: ממיסים 80 כלורי NaCl נתרן גרם, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, KCl 2 גרם ו2.4 KH גרם 2 PO <sub&gt; 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים. הגדר את ה-pH 7.4, סינון סטרילי, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של חיץ נטרול 20: להפוך את תמיסה המכילה 100 HEPES מ&quot;מ מלוחים 2x פוספט (PBS) באמצעות 1 M HEPES ו10x פתרונות מניות PBS. התאם את ה-pH של הפתרון ל7.0. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 2 פתרון מ&quot;ג / מיליליטר של קולגן סוג זנב החולדה אני: הפוך 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון אני קולגן במאגר הנטרול (שלב 2.3). מערבולת הפתרון במהירות נמוכה ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. קולגן זה צמיג מאוד, להימנע מדור של בועות אוויר תוך pipetting. מומלץ להכין לי פתרון קולגן טרי בכל פעם. שמור את הפתרון על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ציפוי endosteal (לקרוע): מערבבים 1 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין המניה עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן אני המניה (שלבים 2.1 ו2.4) לריכוז סופי של 77 מיקרוגרם / מיליליטר ו29 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בהתאמה, ב1x &amp;# 160; PBS סטרילית. לערבב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת העצם מטריקס המשוחזר (RBM): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 Precool מיליליטר microcentrifuge צינורות על קרח. שמור את כל פתרונות המטריצה ​​על קרח בכל העת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 4 חלקים Matrigel (ריכוז Matrigel משתנה מהרבה להרבה, אבל הווריאציות נמצאו להיות זניח), 2.5 חלקים של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין וחלק 1 של 2 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן אני על קרח על ידי pipetting הראשון Matrigel לתוך הצינור באמצעות טיפים פיפטה קרים ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין ואני קולגן Matrigel יתחיל חיזוק בטמפרטורות מעל 4 מעלות צלזיוס, כך שעובד במהירות תוך pipetting Matrigel. מערבבים את המטריצה ​​מאוד בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, למנוע החדרת בועות. שמור צינורות על קרח תוך כדי ערבוב RBM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מדיום מח עצם צמיחה (BMGM): הפוך 500 מיליליטר של BMGM מכיל 6.2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 succinate נתרן -6 M, 10 -6 הידרוקורטיזון M, 20% פלזמה אנושית (ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין רגילים או ממאיר שנאסף מתורמים או מטופלים בריאים), בRPMI-1640. ניתן לאחסן CaCl 2, succinate נתרן, ותוספי הידרוקורטיזון ב-80 מעלות צלזיוס למשך&gt; 6 חודשים כפתרונות מניות x 1,000. כאשר גידול שורות תאים, בסרום שור העובר (FBS) ניתן להחליף לפלזמה אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פורמלין 10% הניטרלי שנאגרו (NBF): הוסף 37% מניות פתרון פורמלדהיד ל1X PBS ב10% v / נ מערבבים היטב ולאחסן בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שבועות המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופן ההכנה של 1% אלבומין בסרום שור (BSA): לשקול כמות מתאימה של ארגון ה-BSA ולפזר אותו ב1x PBS. חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבוע 1. פתרון BSA נוטה לקבל מזוהם אם שמר בקירור לתקופות ארוכות יותר. לחלופין, פתרון BSA ניתן aliquoted והוקפא ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון התאוששות תא (CRS): הפוך 5 מ&quot;מ EDTA, vanadate נתרן 1 מ&quot;מ (Na &lt;פלואוריד הנתרן תת&gt; 3 VO 4) ו1.5 מ&quot;מ (פתרון NAF) ב 1x PBS. סינון סטרילי ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. </li></ol> 3. תרבות 3-D גלום של תאי BM האדם nonmalignant ומאירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התאים מונונוקלארים BM ראשוניים על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll-הרובד לפי הוראות יצרן. שלב אופציונאלי: יכולים להיות מתויגים תאים עם diacetate 0.25 מיקרומטר carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (CFSE) לפי הוראות יצרן לעקוב התפשטות תאים לאורך כל תקופת התרבות. פתרון בעיות: אם תאים מתים לאחר צביעת CFSE, לכיל את כמות CFSE כריכוז תלוי בסוג התא; 0.25 מיקרומטר עובד היטב עבור תאים מונונוקלארים BM עיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 65 μl של פתרון קורע לבאר כל צלחת תרבות טופלה רקמות 48 היטב. מורחים את הפתרון באופן שווה על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב דגירה ל&gt; 30דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה התא בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים ב10 μl של 1x PBS לכל גם צלחת 48 היטב. בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר לערבב את ההשעיה התא עם מטריצה ​​של RBM 100 μl לכל טוב. מערבבים את התאים ומטריקס RBM ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה; למנוע החדרת בועות. שמור את תערובת תא / מטריצה ​​על קרח, כדי למנוע gelling של מטריקס. הערה: מערכת RBM היא להרחבה מלאה; להגדיר את המערכת בפורמט שאינם 48 היטב, להתאים את הכמויות של כל חומרים כימיים (מטריצות ובינוניות) המבוסס על פני השטח של הצלחת בשימוש. קנה מידה של מספר התאים להיות מצופה בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לקרוע שנותר ומוסיף את תערובת תא / מטריצה ​​למרכז גם. במהירות, מורח את תערובת תא / מטריצה ​​על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב באופן שווה. מניחים את הצלחת ל30-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% תרבות חממת CO 2 רקמה כדי לאפשר את המטריצה ​​כדי לחזק. אין לנער או דיסturb הצלחת במהלך דגירה. פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה. פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm BMGM באמבט מים מוגדר 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, בדוק שהמטריצה ​​יש להגדיר כראוי; זה יהיה בצורת ג&#39;ל רך כמו שכבה שאינו זז בעת הצלחת מוטה. Overlay שכבת תאים / מטריצה ​​עם 1 מיליליטר של BMGM החם. כדי להימנע מקריעה של פיפטה מטריקס הבינוני מאוד בעדינות (מחלק טיפה אחר טיפה) באמצעותפיפטה סרולוגיות. הנח את תרבות RBM התאסף לתוך ° C 37, 5% חממת CO 2 רקמת תרבות ותרבות לתקופה הזמן הרצויה. הערה: כדאיות תא נשמר לפחות 30 ימים ללא שינוי בינוני, ואם נדרש שינוי בינוני רק לשנות 50% מבינוניים בכל פעם. שלב קריטי: זה חיוני כי המדיום הוא לא קר כמו טמפרטורה קרה עלולה להפריע מטריקס כבר נקבע. יש להיזהר שלא להשפריץ בינוני על גבי המטריצה ​​בזה עלול לשבור את שכבת המטריצה ​​הרכה. פתרון בעיות: אם כדאיות תא במערכת RBM היא נמוכות, צפיפות תאים תצטרך להיקבע באופן ניסיוני בעבודה עם תאים אחרים מאשר תאים חד גרעיניים עיקריים מaspirates BM. כאשר עובד עם שורות תאים, להקטין את המספר הסלולרי של פי 10, כמו שורות תאים הונצחו מתרבות מהר יותר מאשר תאים ראשוניים. </li></ol> 4. הדמיה &quot;במטריצה&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><strong&gt; במיקרוסקופ אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת התאים בתרבית באופן ישיר בRBM באמצעות שדה בהיר, התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), confocal או כל טכניקות הדמיה אחרות המאפשרות הדמיה למרחקים ארוכים כמטריצה ​​היא כ 1 מ&quot;מ עובי. השתמש בתכונת Z-המחסנית נגיש בהרבה של המיקרוסקופים לתמונה כל התרבות מלמעלה עד למטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence טיפ: לקבלת פרוטוקול immunostaining מתחת להימנע aspirating פתרונות מכתים / כביסה, במקום להטות את הצלחת ולהסיר את הפתרונות באמצעות פיפטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את BMGM באמצעות פיפטה ולשטוף 2-3x עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS. ודא כי מספיק PBS משמש כדי לכסות את כל פני השטח של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים במטריצה ​​על ידי הוספת 100 μl / טוב (לצלחת 48 היטב) של 10% NBF 15 דקות ב RT. הסר NBF ולשטוף תאים פעמיים עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS. פתק: הימנע משימוש בNBF הקרה כפי שהוא עשוי נזל המטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS, להוסיף BSA 1% עבור שעה 1 ב RT או 4 ° C למשך הלילה כדי לחסום ספציפי מחייב של נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון נוגדן ראשוני בBSA 1% בדילול הנדרש. דילול ישתנה עבור כל נוגדן, בדוק עם היצרן או לכיל כדי לקבוע את ריכוז נוגדנים האופטימלי. הוספה 100 μl / טוב של פתרון נוגדן ראשוני ודגירה על פי הוראות היצרן. שלב קריטי: יש לבצע כל incubations מעורב נוגדנים מצומדות כדי fluorophores או צבעי ניאון בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדן ראשוני ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים immunofluorescence עקיף, דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לבדיקת ניאון עבור שעה 1 ב RT. לדלל את הנוגדנים בBSA 1% בריכוז שהוצע על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשניפתרון ntibody ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות. פתרון בעיות: כדי להימנע מרקע גבוה במהלך הדמיה, לכיל נוגדנים משני מצומדות fluorescently ולהשתמש בריכוז הנמוך ביותר המספק אות מספקת. אם רקע גבוה הוא עדיין בעיה, להגדיל את המספר ומשך צעדים לשטוף, או להשתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדת באופן ישיר, ולדלג על שלב 4.2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את הגרעינים להוסיף 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מכתים גרעיני, בדילול שהוצע על ידי היצרן, ודגירה של 7-10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון מכתים גרעיני ולשטוף 2x עם 1x PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהשטיפה האחרונה ולהוסיף טיפה של מדיום הרכבה (סט קבוע), על המדגם לשמר הקרינה. תמונה באמצעות הגדרות עירור / פליטה מתאימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. שים לב: הדמיה צריכה להיעשות בתוך 2 ימים של מכתיםכדי להימנע משפלה של מטריצה ​​ואובדן שלמות RBM ואובדן אות ניאון. אם לא צילמו באופן מיידי, יש לשמור דגימות מוכתמות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עד הדמיה. </li></ol></li></ol> 5. בידוד של תאים מRBM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני בעדינות מבלי להפריע את שכבת מטריקס. לא לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאי 2X עם סטרילי 1X PBS. לא לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של CRS קר כקרח היטב כל אחד ולהסיר את כל שכבת מטריקס יחד עם התאים, על ידי במרץ pipetting למעלה ולמטה. לאסוף את התאים, מטריקס, וCRS בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.5 מיליליטר CRS נוסף לאותו היטב ולאסוף את כל חומרים שנותרו. העבר לאותו הצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת התערובת של תאים, מטריקס, וCRS ולדגור על קרח למשך 1 שעות. תאי ורטקס כל 15 דקות כדי להקל על שחרור מהמטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התערובת לאחר 1 שעות, ללא גושים נראים לעיןשל מטריצה ​​צריך להיות נוכח. פתרון בעיות: אם גושים של מטריצה ​​הם עדיין גלויים לאחר 1 שעות, תאי העברה / מטריצה ​​/ תערובת CRS לצינור גדול יותר, תוסיף 2-5 מיליליטר נוסף של CRS, ודגירה של 30-60 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים בCRS ב1,000 סל&quot;ד 5-10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של 1x PBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,000 סל&quot;ד 5-10 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף PBS עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף PBS השני משלים את ההחלמה של תאים ממטריצה ​​ותאים מבודדים יכולה לשמש לכל יישומים במורד כגון בידוד DNA / RNA / חלבון, cytometry זרימה, in vivo השתלה, וכו &#39;. </li></ol>

<ol>
	<li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism.">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber.">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li><li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li><li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium.">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li><li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane.">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li><li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+propagated+in+serum-free,+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model.">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion.">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li><li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma.">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li><li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition.">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li><li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEACAM1-4S,+a+cell-cell+adhesion+molecule,+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture.">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma.">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids.">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li><li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+drug+resistance:+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease.">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li><li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture.">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li><li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells.">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li><li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma.">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li><li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel.">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li><li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells.">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li><li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance.">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.

דגם RBM מספק מערכת מקיפה שבו הרכב תאי של BM נשמר vivo לשעבר לתקופה של עד 30 ימים. תאי BM גדלו בRBM עצמי רבד פי הפונקציה שלהם מחקה את ארכיטקטורת BM מצאה in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, זוהי המערכת הראשונה המאפשרת להרחבת שיבוט מיאלומה הנפוצה 8. השלבים הקריטיים ביו...

תרבית רקמה פותחה כדי ללמוד על התנהגות תא בסביבה מבוקרת כדי למזער את ההשתנות המערכתית כאשר משווה תהליכים שונים באורגניזמים שלמים. שיטה זו הוקמה לראשונה ב 1900 1,2 המוקדם ומתייחסת לטכניקה שבה explants היה בתרבית הרקמה vivo לשעבר בצלחת זכוכית. באמצע שנתי ה 1900s-המערכת הותאמה לגדל תאים מפוזרים ולא שברי רקמות שלמות, ו&#39;תרבית הרקמה &#39;התנאים ו&#39;תרבית תאים&#39; הפכו לשם נרדף 3. במערכות תרבית תאים קונבנציונליות כגון תאים גדלים על פני השטח של הפלסטיק בתרבית רקמה ועליהן מדיום גידול בתוספת גורמי גדילה שונים. שני סוגים של תרבויות צמחו מבוססים על יכולת ההדבקה של תאים שונים: תרבית תאים חסיד, שבו תאים לצרף ולהפיץ על הפלסטיק בתרבית רקמה ותרבויות nonadherent, שבו תאים מופצים בהשעיה. מאז הימים הראשונים של תאנוצרו תרבות, שורות תאים אלמותיים מרובות, כגון 4 הלה, שורת תאי סרטן האנושיים הראשונה. יש שורות תאים אלה את היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן בתרבית תאים, ורוב אינו דורשים כל טיפול מיוחד כדי לשמור על יכולת קיום. הגישה הרדוקציוניסטית של שיטות תרבית תאים המקורית שנועדה לפשט את המערכת ככל האפשר על ידי כולל רק את רכיבי המינימום הנדרשים כדי לקיים את כדאיות תא ושגשוגם. עם זאת, גישות פשוטות תרבית תאים לא מצליחות לתמוך vivo לשעבר סוגים העיקריים ביותר תא אנושיים עם תוחלת חיים מוגבלת. לכן, מערכות התרבות חדשות שתוכננו משוערת microenvironment הרקמות, ככל שניתן, ובכך מאפשרות explants התא לגדול בתנאים פיסיולוגיים. בניגוד ל/ גישות קונבנציונליות הרדוקציוניסטית תרבית תאים, 3 ממדים (3-D) מערכות תרבות נמצאות כעת הופכות שיטה מועדפת ליעילות תרבות שונותשורות תאים אנושיות ותאים ראשוניים ללמוד לאחר מכן מנגנונים מעורבים במחלה ובריאות, בהקשר של microenvironment תומך. מערכות 3-D כאלה הן בדרך כלל הגדרה באמצעות מטריצות משוחזרות ו / או בינוני בתוספת גורמי גדילה, על מנת לשחזר את microenvironment הרקמות ללמוד סוגי תא של עניין. הראשון של דגמי תרבות 3 ממדים (3-D) אלה פותח כדי ללמוד התפתחות בלוטת החלב. כדי לספק את התאים עם תנאים מקומיים תאי אפיתל החלב היו משובצים בMatrigel, קולגן IV ומקור laminin עשיר של מטריצה ​​תאית (ECM), ועליהן מדיום גידול. בתנאים אלה, תאי אפיתל החלב נוצרו אשכולות דומים acini החלב, ועל גירוי עם הורמוני lactogenic, acini אלה מופרשים קזאין, וחלבונים חלב אחרים, לlumena החלול של המבנים דמוי acini. הפרשת קזאין לא נצפתה בתרבויות סטנדרטיות גם לאחר תוספת של פרולקטין 5, תוך שימת דגש על תפקידו של המיקרו בשמירה על המאפיינים מורפולוגיים ופנוטיפי של תאים נוספים. הפגנה נוספת של אובדן התפקוד תאי נורמלי כאשר תאי לקוחים מתוך ההקשר של microenvironment הפיזיולוגי שלהם היא הפגנה שללא microenvironment תומך, קרטינוציטים להיכשל כדי ליצור האפידרמיס מרובדת 6. מספר 3-D מודלים אחרים נוצר כדי לאפשר ריבוי vivo לשעבר של תאים ראשוניים 7,8. התפקיד המכריע של microenvironment בהתנהגות תא הודגם אלגנטיות במחקר שבו תאי אפיתל החלב נוצרו acini &quot;מבפנים החוצה&quot; כאשר בתרבית בקולגן אני מטריקס, בהשוואה לacini המקוטב בצורה הנכונה שנוצרו בMatrigel. הפסד זה של מורפולוגיה התקינה היה חזר כאשר תאי myoepithelial ייצור laminin נוספו לקולגן I תרבויות 9. יתר על כן, microenvironment הנכון דרוש למדויקביטוי גנוטיפ. גדל בצלחת, תאי סרטן שד MCF7 transfected עם CEACAM1 מולקולת הידבקות תאי תאים מתנהגים בדיוק כמו התאים השליליים CEACAM untransfected. עם זאת, כאשר בתרבית בMatrigel, במגע עם ECM, מבנים כמו גידול בצורת MCF7 wildtype תוך MCF7 תאי transfected עם CEACAM1 לחזור לacini פנוטיפ והצורה נורמלי עם lumena החלול, כפי שכבר נקבעו באפיתל החלב nonmalignant 10. בדומה לכך, חסימה בתאי סרטן שד integrin-β1 אינו משנה את התנהגותם בתנאי תרבות סטנדרטיות, אבל על אותו הניסוי שבוצע בתרבויות 3-D מוכיח כי חסימת β1-integrin חוזרת תאים ממאירים לפנוטיפ נורמלי 11. לכן, microenvironment רקמות אינו נדרש רק כדי לשמור על כדאיות תא, אלא גם כדי לשמור על תפקוד תא תקין. בנוסף לאספקת מערכת שבה התנהגות תא ניתן ללמוד בתנאים פיסיולוגייםים, תרבויות 3-D לתפקד מדיום חזק ואמין כמו לבדיקה קליני של הרפוי רומן 8,12,13. Culturing תאים ב 3-D מאפשר הקרנה של תרכובות investigational בתנאים של בתיווך סביבת סמים התנגדות 14, שבו התרומה של תאי תאים והידבקות התא-ECM יכולה להיות מוערכת. יתר על כן, רעילות מחוץ היעד של תרכובות חדשות ניתן לקביעה על ידי שילוב של תאים סלולריים שונים של רקמות שונות. ניתן לבצע מסכים כאלה במהירות רבה יותר ויותר יעיל וחסכוני יותר מהמחקרים דומים בvivo 8. כאן אנו מציגים התקנה של 3-D מודל של מח עצם משוחזר (RBM) שבו תאי מח עצם נורמלי וממאירים (BM) להתרבות vivo לשעבר במערכת מחקה את microenvironment של BM האדם באופן הדוק. ניסיונות קודמים בגידול תאי BM אנושי ראשוניים בתרבויות 2-D, נוזל או cocultures חסיד עם רכיבים שונים של stroma BM, או 3-D, תרבויות אגר חצי מוצק נפגשו עם הצלחה מוגבלת בשל חוסר היכולת שלהם לספק את התאים עם הרכיבים של microenvironment הרקמה 15-18. במערכות אלה היו תאי BM עיקריים כדאיות עניות ולא הצליחו להתרבות vivo לשעבר. מערכת נוספת שבו תאי BM אדם גדלים בcocultures אליפטית עם תאי סטרומה BM היא מערכת 3-D בו כדאיות תא גזע hematopoietic ושגשוגם נשמרו במשך לפחות 96 שעה 19. עם זאת, למרות שמאוד מועיל להבנת הביולוגיה אבות היווצרות הדם, מערכת זו אינה נאמנות לשחזר את microenvironment של BM בשל היעדר רכיבי ECM, ולכן, מה שמגביל את השימושיות שלה. דגם RBM המתואר כאן מציג מערכת מקיפה שבו שני התאים סלולריים ותאיים של BM האדם משוחזרים במבחנה. אנו מראים כי תרבויות RBM יכולות לתמוך בצמיחת vivo לשעבר של תאים אנושיים BM רגילים, כפי שאנוll כמו תאים מבודדים מחולים עם הפרעות המטולוגיות שונות.

<table><tbody><tr><td>CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from human plasma</td><td>Millipore</td><td>NG1884448</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Lifesciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel basement membrane matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen type I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting medium for fluorescence (regular set)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4648</td><td>For TRAP staining</td></tr><tr><td>SigmaFast BCIP/NBT tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td>For alkaline phosphatase staining</td></tr><tr><td>Zeiss confocal LSM 510 microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 510 software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Image analysis software for confocal analysis</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Image analysis software for Axiovert 200M</td></tr><tr><td>FACSort flow cytometer&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Software for the analysis of flow cytometry data</td></tr></tbody></table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

תרבית רקמה הייתה כלי רב ערך כדי ללמוד על היבטים רבים של תפקוד תא, מהתפתחות נורמלית למחלה. שיטות תרבות תאים רגילות להסתמך על היכולת של תאים או לצרף לתשתית מוצקה של צלחת תרבית רקמה או לגדול בתרחיף במדיום נוזלי. נוצרו שורות תאים אלמותיים מרובות וגדלו תוך שימוש בגישות אלה, עם זאת, שיטות אלה לעתים קרובות להיכשל כאשר תאים ראשוניים צריכים להיות מבוגרים vivo לשעבר. כישלון כזה יוחס להעדרם של רכיבי מטריצה ​​תאיים המתאימים של microenvironment הרקמה מהמערכות סטנדרטיות שבו פלסטיק תרבית רקמה משמש כמשטח לצמיחת תאים. מטריצה ​​תאית היא מרכיב בלתי נפרד של microenvironment הרקמות ונוכחותה היא חיונית לשמירה על תפקודים פיסיולוגיים כגון קיטוב תא, הישרדות, ושגשוגם. כאן אנו מציגים שיטת תרבית רקמה 3 ממדים שבו cel מוח עצם העיקריls גדלים במטריצה ​​תאית גובשה כדי לשחזר את microenvironment של עצמות אדם (מערכת RBM). משובץ במטריצה ​​תאית, תאים מסופקים עם חומרים מזינים דרך המדיום בתוספת פלזמה אנושית, ובכך לספק מערכת מקיפה שבו הישרדות תא ושגשוגם יכולים להתקיים לעד 30 ימים תוך שמירה על ההרכב התאי של הרקמות ראשוניות. שימוש במערכת RBM יש לנו גדלו בהצלחה תאי מח העצם עיקריים מתורמים רגילים וחולים עם עמילואידוזיס, ומחלות דם ממאירות שונות. מערכת RBM מאפשרת הדמיה ישירה, במטריצה ​​בזמן אמת של התנהגות התא וההערכה של יעילות קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, ניתן לבודד תאים מRBM ולאחר מכן נעשה שימוש להשתלת in vivo, מיון תא, cytometry זרימה, וחומצות גרעין וניתוח חלבון. יחדיו, שיטת RBM מספקת מערכת אמינה לצמיחה של Marro עצם העיקריתאי w בתנאים פיסיולוגיים.

מכיוון שתאי מח עצם העיקרי אינם מצליחים להתרבות בתנאי תרבית רקמה רגילים, מערכת RBM נוצרה כדי לחקות באופן הדוק microenvironment העצם, מתן מערכת לתרבות ולהרחיב את תאי BM vivo לשעבר. המרכיבים העיקריים של מטריצת BM תאית, פיברונקטין, קולגן I, קולגן IV, וlaminin 21, שולבו מטריצת RBM לספ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies at JoVE.com

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

16.6K Views.  Purdue University.  בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות. 

Video: A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Cancer Research

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Bioengineering

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Developmental Biology

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

לוקמיה עמידה דוגמנות כימותרפיה<em&gt; במבחנה</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

3D Co-Culture Assay: נישות אוסטאוגניות וסקולריות לבדיקת תרופות לסרטן

Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models recapitulating bone- and bone marrow-specific functions, including vascularization, that are compatible with drug screening are highly desirable. Such models can bridge the gap between simplistic, structurally irrelevant two-dimensional (2D) in vitro models and the more expensive, ethically challenging in vivo models. This article describes a controllable three-dimensional (3D) co-culture assay based on engineered poly(ethylene glycol) (PEG) matrices for the generation of vascularized, osteogenic bone-marrow niches. The PEG matrix design allows the development of 3D cell cultures through a simple cell seeding step requiring no encapsulation, thus enabling the development of complex co-culture systems. Furthermore, the matrices are transparent and pre-cast onto glass-bottom 96-well imaging plates, rendering the system suitable for microscopy. For the assay described here, human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (hBM-MSCs) are cultured first until a sufficiently developed 3D cell network is formed. Subsequently, GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are added. The culture development is followed by bright-field and fluorescence microscopy. The presence of the hBM-MSC network supports the formation of vascular-like structures that otherwise&#160;would not form and that remain stable for at least 7 days. The extent of vascular-like network formation can easily be quantified. This model can be tuned toward an osteogenic bone-marrow niche by supplementing the culture medium with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), which promotes the osteogenic differentiation of the hBM-MSCs, as assessed by increased alkaline phosphatase (ALP) activity at day 4 and day 7 of co-culture. This cellular model can be used as a platform for culturing various cancer cells and studying how they interact with bone- and bone marrow-specific vascular niches. Moreover, it is suitable for automation and high-content analyses, meaning it would enable cancer drug screening under highly reproducible culture conditions.

מחבר זרקור: הקמה פשוטה של נישת מח עצם אוסטאוגנית וסקולרית באמצעות הידרוג'לים פוליציק מראש (אתילן גליקול) (PEG) במיקרו-צלחת הדמיה  

An in vitro model of the bone marrow vascular niche is established by seeding mesenchymal and endothelial cells onto pre-cast 3D PEG hydrogels. The endothelial networks, ECM components, and ALP activity of the niches vary depending on the growth factor used. The platform can be used for advanced cancer models.

הקמה פשוטה של נישת מח עצם אוסטאוגנית וסקולרית באמצעות הידרוג'לים פוליאתילן גליקול (PEG) יצוקים מראש במיקרו-צלחת הדמיה

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models ...

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video