עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן (1R21CA141039), BD Biosciences מענק מחקר פרס, האגודה האמריקנית לסרטן המחקר המוסדי גרנט (IRG # 58-006-53), למרכז אוניברסיטת פרדו למלחמה בסרטן מחקר, והמכון הקנדי לבריאות מחקר והתכנית ליוזמות מחקר אלברטה סרטן הדירקטוריון. חבר הפרלמנט נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון לאומי לסרטן, תכנית למניעת סרטן התמחות (R25CA128770; PI: ד טיגרדן) מנוהל על ידי המרכז למדעי אונקולוגית ומרכז המחקר למידה הגילוי באוניברסיטת פרדו.

1. הכנה מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור טפטפות סרולוגיות סטרילי וטיפים פיפטה ב 4 ° C. פתרון בעיות: ג&#39;לי Matrigel בטמפרטורת חדר (RT); באמצעות טפטפות וטיפים קרים ימנע Matrigel מgelling במהלך הגדרת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוק Matrigel על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol> 2. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון מניות פיברונקטין: הפוך 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות של פיברונקטין על ידי המסת פיברונקטין אדם 100 מ&quot;ג במים מזוקקים 100 מיליליטר. ברגע שפיברונקטין נמס, פילטר סטרילי, aliquot, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. פתרון בעיות: אם פיברונקטין אינו מתמוסס במהירות דגירה הפתרון לכמה דקות בסט אמבט מים ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 10x PBS: ממיסים 80 כלורי NaCl נתרן גרם, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, KCl 2 גרם ו2.4 KH גרם 2 PO <sub&gt; 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים. הגדר את ה-pH 7.4, סינון סטרילי, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של חיץ נטרול 20: להפוך את תמיסה המכילה 100 HEPES מ&quot;מ מלוחים 2x פוספט (PBS) באמצעות 1 M HEPES ו10x פתרונות מניות PBS. התאם את ה-pH של הפתרון ל7.0. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 2 פתרון מ&quot;ג / מיליליטר של קולגן סוג זנב החולדה אני: הפוך 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון אני קולגן במאגר הנטרול (שלב 2.3). מערבולת הפתרון במהירות נמוכה ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. קולגן זה צמיג מאוד, להימנע מדור של בועות אוויר תוך pipetting. מומלץ להכין לי פתרון קולגן טרי בכל פעם. שמור את הפתרון על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ציפוי endosteal (לקרוע): מערבבים 1 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין המניה עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן אני המניה (שלבים 2.1 ו2.4) לריכוז סופי של 77 מיקרוגרם / מיליליטר ו29 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בהתאמה, ב1x &amp;# 160; PBS סטרילית. לערבב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת העצם מטריקס המשוחזר (RBM): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 Precool מיליליטר microcentrifuge צינורות על קרח. שמור את כל פתרונות המטריצה ​​על קרח בכל העת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 4 חלקים Matrigel (ריכוז Matrigel משתנה מהרבה להרבה, אבל הווריאציות נמצאו להיות זניח), 2.5 חלקים של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין וחלק 1 של 2 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן אני על קרח על ידי pipetting הראשון Matrigel לתוך הצינור באמצעות טיפים פיפטה קרים ולאחר מכן להוסיף פיברונקטין ואני קולגן Matrigel יתחיל חיזוק בטמפרטורות מעל 4 מעלות צלזיוס, כך שעובד במהירות תוך pipetting Matrigel. מערבבים את המטריצה ​​מאוד בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, למנוע החדרת בועות. שמור צינורות על קרח תוך כדי ערבוב RBM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מדיום מח עצם צמיחה (BMGM): הפוך 500 מיליליטר של BMGM מכיל 6.2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 succinate נתרן -6 M, 10 -6 הידרוקורטיזון M, 20% פלזמה אנושית (ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין רגילים או ממאיר שנאסף מתורמים או מטופלים בריאים), בRPMI-1640. ניתן לאחסן CaCl 2, succinate נתרן, ותוספי הידרוקורטיזון ב-80 מעלות צלזיוס למשך&gt; 6 חודשים כפתרונות מניות x 1,000. כאשר גידול שורות תאים, בסרום שור העובר (FBS) ניתן להחליף לפלזמה אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פורמלין 10% הניטרלי שנאגרו (NBF): הוסף 37% מניות פתרון פורמלדהיד ל1X PBS ב10% v / נ מערבבים היטב ולאחסן בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שבועות המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופן ההכנה של 1% אלבומין בסרום שור (BSA): לשקול כמות מתאימה של ארגון ה-BSA ולפזר אותו ב1x PBS. חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבוע 1. פתרון BSA נוטה לקבל מזוהם אם שמר בקירור לתקופות ארוכות יותר. לחלופין, פתרון BSA ניתן aliquoted והוקפא ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון התאוששות תא (CRS): הפוך 5 מ&quot;מ EDTA, vanadate נתרן 1 מ&quot;מ (Na &lt;פלואוריד הנתרן תת&gt; 3 VO 4) ו1.5 מ&quot;מ (פתרון NAF) ב 1x PBS. סינון סטרילי ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. </li></ol> 3. תרבות 3-D גלום של תאי BM האדם nonmalignant ומאירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התאים מונונוקלארים BM ראשוניים על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll-הרובד לפי הוראות יצרן. שלב אופציונאלי: יכולים להיות מתויגים תאים עם diacetate 0.25 מיקרומטר carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (CFSE) לפי הוראות יצרן לעקוב התפשטות תאים לאורך כל תקופת התרבות. פתרון בעיות: אם תאים מתים לאחר צביעת CFSE, לכיל את כמות CFSE כריכוז תלוי בסוג התא; 0.25 מיקרומטר עובד היטב עבור תאים מונונוקלארים BM עיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 65 μl של פתרון קורע לבאר כל צלחת תרבות טופלה רקמות 48 היטב. מורחים את הפתרון באופן שווה על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב דגירה ל&gt; 30דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה התא בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים ב10 μl של 1x PBS לכל גם צלחת 48 היטב. בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר לערבב את ההשעיה התא עם מטריצה ​​של RBM 100 μl לכל טוב. מערבבים את התאים ומטריקס RBM ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה; למנוע החדרת בועות. שמור את תערובת תא / מטריצה ​​על קרח, כדי למנוע gelling של מטריקס. הערה: מערכת RBM היא להרחבה מלאה; להגדיר את המערכת בפורמט שאינם 48 היטב, להתאים את הכמויות של כל חומרים כימיים (מטריצות ובינוניות) המבוסס על פני השטח של הצלחת בשימוש. קנה מידה של מספר התאים להיות מצופה בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לקרוע שנותר ומוסיף את תערובת תא / מטריצה ​​למרכז גם. במהירות, מורח את תערובת תא / מטריצה ​​על מנת לכסות את כל פני השטח של היטב באופן שווה. מניחים את הצלחת ל30-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% תרבות חממת CO 2 רקמה כדי לאפשר את המטריצה ​​כדי לחזק. אין לנער או דיסturb הצלחת במהלך דגירה. פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה. פתרון בעיות: כדי למנוע חלוקה לא שווה של תאים בRBM, ומערבב היטב לפני ציפוי. מערבבים אחרי כל 5 גם ה מצופים להימנע מתאי שיקוע לחלק התחתון של הצינור. מצופים ברגע, תאים לא ישקעו לתחתית הבאר בשל שטח מתח במטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm BMGM באמבט מים מוגדר 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, בדוק שהמטריצה ​​יש להגדיר כראוי; זה יהיה בצורת ג&#39;ל רך כמו שכבה שאינו זז בעת הצלחת מוטה. Overlay שכבת תאים / מטריצה ​​עם 1 מיליליטר של BMGM החם. כדי להימנע מקריעה של פיפטה מטריקס הבינוני מאוד בעדינות (מחלק טיפה אחר טיפה) באמצעותפיפטה סרולוגיות. הנח את תרבות RBM התאסף לתוך ° C 37, 5% חממת CO 2 רקמת תרבות ותרבות לתקופה הזמן הרצויה. הערה: כדאיות תא נשמר לפחות 30 ימים ללא שינוי בינוני, ואם נדרש שינוי בינוני רק לשנות 50% מבינוניים בכל פעם. שלב קריטי: זה חיוני כי המדיום הוא לא קר כמו טמפרטורה קרה עלולה להפריע מטריקס כבר נקבע. יש להיזהר שלא להשפריץ בינוני על גבי המטריצה ​​בזה עלול לשבור את שכבת המטריצה ​​הרכה. פתרון בעיות: אם כדאיות תא במערכת RBM היא נמוכות, צפיפות תאים תצטרך להיקבע באופן ניסיוני בעבודה עם תאים אחרים מאשר תאים חד גרעיניים עיקריים מaspirates BM. כאשר עובד עם שורות תאים, להקטין את המספר הסלולרי של פי 10, כמו שורות תאים הונצחו מתרבות מהר יותר מאשר תאים ראשוניים. </li></ol> 4. הדמיה &quot;במטריצה&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><strong&gt; במיקרוסקופ אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת התאים בתרבית באופן ישיר בRBM באמצעות שדה בהיר, התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), confocal או כל טכניקות הדמיה אחרות המאפשרות הדמיה למרחקים ארוכים כמטריצה ​​היא כ 1 מ&quot;מ עובי. השתמש בתכונת Z-המחסנית נגיש בהרבה של המיקרוסקופים לתמונה כל התרבות מלמעלה עד למטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence טיפ: לקבלת פרוטוקול immunostaining מתחת להימנע aspirating פתרונות מכתים / כביסה, במקום להטות את הצלחת ולהסיר את הפתרונות באמצעות פיפטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את BMGM באמצעות פיפטה ולשטוף 2-3x עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS. ודא כי מספיק PBS משמש כדי לכסות את כל פני השטח של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים במטריצה ​​על ידי הוספת 100 μl / טוב (לצלחת 48 היטב) של 10% NBF 15 דקות ב RT. הסר NBF ולשטוף תאים פעמיים עם 100 μl / לשטוף / היטב RT 1x PBS. פתק: הימנע משימוש בNBF הקרה כפי שהוא עשוי נזל המטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS, להוסיף BSA 1% עבור שעה 1 ב RT או 4 ° C למשך הלילה כדי לחסום ספציפי מחייב של נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון נוגדן ראשוני בBSA 1% בדילול הנדרש. דילול ישתנה עבור כל נוגדן, בדוק עם היצרן או לכיל כדי לקבוע את ריכוז נוגדנים האופטימלי. הוספה 100 μl / טוב של פתרון נוגדן ראשוני ודגירה על פי הוראות היצרן. שלב קריטי: יש לבצע כל incubations מעורב נוגדנים מצומדות כדי fluorophores או צבעי ניאון בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדן ראשוני ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים immunofluorescence עקיף, דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לבדיקת ניאון עבור שעה 1 ב RT. לדלל את הנוגדנים בBSA 1% בריכוז שהוצע על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשניפתרון ntibody ולשטוף 3x עם 1x PBS במשך 5 דקות. פתרון בעיות: כדי להימנע מרקע גבוה במהלך הדמיה, לכיל נוגדנים משני מצומדות fluorescently ולהשתמש בריכוז הנמוך ביותר המספק אות מספקת. אם רקע גבוה הוא עדיין בעיה, להגדיל את המספר ומשך צעדים לשטוף, או להשתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדת באופן ישיר, ולדלג על שלב 4.2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את הגרעינים להוסיף 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מכתים גרעיני, בדילול שהוצע על ידי היצרן, ודגירה של 7-10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון מכתים גרעיני ולשטוף 2x עם 1x PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהשטיפה האחרונה ולהוסיף טיפה של מדיום הרכבה (סט קבוע), על המדגם לשמר הקרינה. תמונה באמצעות הגדרות עירור / פליטה מתאימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. שים לב: הדמיה צריכה להיעשות בתוך 2 ימים של מכתיםכדי להימנע משפלה של מטריצה ​​ואובדן שלמות RBM ואובדן אות ניאון. אם לא צילמו באופן מיידי, יש לשמור דגימות מוכתמות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עד הדמיה. </li></ol></li></ol> 5. בידוד של תאים מRBM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני בעדינות מבלי להפריע את שכבת מטריקס. לא לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאי 2X עם סטרילי 1X PBS. לא לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של CRS קר כקרח היטב כל אחד ולהסיר את כל שכבת מטריקס יחד עם התאים, על ידי במרץ pipetting למעלה ולמטה. לאסוף את התאים, מטריקס, וCRS בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.5 מיליליטר CRS נוסף לאותו היטב ולאסוף את כל חומרים שנותרו. העבר לאותו הצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת התערובת של תאים, מטריקס, וCRS ולדגור על קרח למשך 1 שעות. תאי ורטקס כל 15 דקות כדי להקל על שחרור מהמטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התערובת לאחר 1 שעות, ללא גושים נראים לעיןשל מטריצה ​​צריך להיות נוכח. פתרון בעיות: אם גושים של מטריצה ​​הם עדיין גלויים לאחר 1 שעות, תאי העברה / מטריצה ​​/ תערובת CRS לצינור גדול יותר, תוסיף 2-5 מיליליטר נוסף של CRS, ודגירה של 30-60 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים בCRS ב1,000 סל&quot;ד 5-10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של 1x PBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,000 סל&quot;ד 5-10 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף PBS עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף PBS השני משלים את ההחלמה של תאים ממטריצה ​​ותאים מבודדים יכולה לשמש לכל יישומים במורד כגון בידוד DNA / RNA / חלבון, cytometry זרימה, in vivo השתלה, וכו &#39;. </li></ol>

<ol>
	<li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism.">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber.">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li><li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li><li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium.">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li><li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane.">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li><li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+propagated+in+serum-free,+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model.">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion.">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li><li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma.">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li><li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition.">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li><li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEACAM1-4S,+a+cell-cell+adhesion+molecule,+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture.">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma.">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids.">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li><li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+drug+resistance:+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease.">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li><li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture.">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li><li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells.">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li><li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma.">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li><li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel.">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li><li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells.">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li><li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance.">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.

דגם RBM מספק מערכת מקיפה שבו הרכב תאי של BM נשמר vivo לשעבר לתקופה של עד 30 ימים. תאי BM גדלו בRBM עצמי רבד פי הפונקציה שלהם מחקה את ארכיטקטורת BM מצאה in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, זוהי המערכת הראשונה המאפשרת להרחבת שיבוט מיאלומה הנפוצה 8. השלבים הקריטיים ביו...

תרבית רקמה פותחה כדי ללמוד על התנהגות תא בסביבה מבוקרת כדי למזער את ההשתנות המערכתית כאשר משווה תהליכים שונים באורגניזמים שלמים. שיטה זו הוקמה לראשונה ב 1900 1,2 המוקדם ומתייחסת לטכניקה שבה explants היה בתרבית הרקמה vivo לשעבר בצלחת זכוכית. באמצע שנתי ה 1900s-המערכת הותאמה לגדל תאים מפוזרים ולא שברי רקמות שלמות, ו&#39;תרבית הרקמה &#39;התנאים ו&#39;תרבית תאים&#39; הפכו לשם נרדף 3. במערכות תרבית תאים קונבנציונליות כגון תאים גדלים על פני השטח של הפלסטיק בתרבית רקמה ועליהן מדיום גידול בתוספת גורמי גדילה שונים. שני סוגים של תרבויות צמחו מבוססים על יכולת ההדבקה של תאים שונים: תרבית תאים חסיד, שבו תאים לצרף ולהפיץ על הפלסטיק בתרבית רקמה ותרבויות nonadherent, שבו תאים מופצים בהשעיה. מאז הימים הראשונים של תאנוצרו תרבות, שורות תאים אלמותיים מרובות, כגון 4 הלה, שורת תאי סרטן האנושיים הראשונה. יש שורות תאים אלה את היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן בתרבית תאים, ורוב אינו דורשים כל טיפול מיוחד כדי לשמור על יכולת קיום. הגישה הרדוקציוניסטית של שיטות תרבית תאים המקורית שנועדה לפשט את המערכת ככל האפשר על ידי כולל רק את רכיבי המינימום הנדרשים כדי לקיים את כדאיות תא ושגשוגם. עם זאת, גישות פשוטות תרבית תאים לא מצליחות לתמוך vivo לשעבר סוגים העיקריים ביותר תא אנושיים עם תוחלת חיים מוגבלת. לכן, מערכות התרבות חדשות שתוכננו משוערת microenvironment הרקמות, ככל שניתן, ובכך מאפשרות explants התא לגדול בתנאים פיסיולוגיים. בניגוד ל/ גישות קונבנציונליות הרדוקציוניסטית תרבית תאים, 3 ממדים (3-D) מערכות תרבות נמצאות כעת הופכות שיטה מועדפת ליעילות תרבות שונותשורות תאים אנושיות ותאים ראשוניים ללמוד לאחר מכן מנגנונים מעורבים במחלה ובריאות, בהקשר של microenvironment תומך. מערכות 3-D כאלה הן בדרך כלל הגדרה באמצעות מטריצות משוחזרות ו / או בינוני בתוספת גורמי גדילה, על מנת לשחזר את microenvironment הרקמות ללמוד סוגי תא של עניין. הראשון של דגמי תרבות 3 ממדים (3-D) אלה פותח כדי ללמוד התפתחות בלוטת החלב. כדי לספק את התאים עם תנאים מקומיים תאי אפיתל החלב היו משובצים בMatrigel, קולגן IV ומקור laminin עשיר של מטריצה ​​תאית (ECM), ועליהן מדיום גידול. בתנאים אלה, תאי אפיתל החלב נוצרו אשכולות דומים acini החלב, ועל גירוי עם הורמוני lactogenic, acini אלה מופרשים קזאין, וחלבונים חלב אחרים, לlumena החלול של המבנים דמוי acini. הפרשת קזאין לא נצפתה בתרבויות סטנדרטיות גם לאחר תוספת של פרולקטין 5, תוך שימת דגש על תפקידו של המיקרו בשמירה על המאפיינים מורפולוגיים ופנוטיפי של תאים נוספים. הפגנה נוספת של אובדן התפקוד תאי נורמלי כאשר תאי לקוחים מתוך ההקשר של microenvironment הפיזיולוגי שלהם היא הפגנה שללא microenvironment תומך, קרטינוציטים להיכשל כדי ליצור האפידרמיס מרובדת 6. מספר 3-D מודלים אחרים נוצר כדי לאפשר ריבוי vivo לשעבר של תאים ראשוניים 7,8. התפקיד המכריע של microenvironment בהתנהגות תא הודגם אלגנטיות במחקר שבו תאי אפיתל החלב נוצרו acini &quot;מבפנים החוצה&quot; כאשר בתרבית בקולגן אני מטריקס, בהשוואה לacini המקוטב בצורה הנכונה שנוצרו בMatrigel. הפסד זה של מורפולוגיה התקינה היה חזר כאשר תאי myoepithelial ייצור laminin נוספו לקולגן I תרבויות 9. יתר על כן, microenvironment הנכון דרוש למדויקביטוי גנוטיפ. גדל בצלחת, תאי סרטן שד MCF7 transfected עם CEACAM1 מולקולת הידבקות תאי תאים מתנהגים בדיוק כמו התאים השליליים CEACAM untransfected. עם זאת, כאשר בתרבית בMatrigel, במגע עם ECM, מבנים כמו גידול בצורת MCF7 wildtype תוך MCF7 תאי transfected עם CEACAM1 לחזור לacini פנוטיפ והצורה נורמלי עם lumena החלול, כפי שכבר נקבעו באפיתל החלב nonmalignant 10. בדומה לכך, חסימה בתאי סרטן שד integrin-β1 אינו משנה את התנהגותם בתנאי תרבות סטנדרטיות, אבל על אותו הניסוי שבוצע בתרבויות 3-D מוכיח כי חסימת β1-integrin חוזרת תאים ממאירים לפנוטיפ נורמלי 11. לכן, microenvironment רקמות אינו נדרש רק כדי לשמור על כדאיות תא, אלא גם כדי לשמור על תפקוד תא תקין. בנוסף לאספקת מערכת שבה התנהגות תא ניתן ללמוד בתנאים פיסיולוגייםים, תרבויות 3-D לתפקד מדיום חזק ואמין כמו לבדיקה קליני של הרפוי רומן 8,12,13. Culturing תאים ב 3-D מאפשר הקרנה של תרכובות investigational בתנאים של בתיווך סביבת סמים התנגדות 14, שבו התרומה של תאי תאים והידבקות התא-ECM יכולה להיות מוערכת. יתר על כן, רעילות מחוץ היעד של תרכובות חדשות ניתן לקביעה על ידי שילוב של תאים סלולריים שונים של רקמות שונות. ניתן לבצע מסכים כאלה במהירות רבה יותר ויותר יעיל וחסכוני יותר מהמחקרים דומים בvivo 8. כאן אנו מציגים התקנה של 3-D מודל של מח עצם משוחזר (RBM) שבו תאי מח עצם נורמלי וממאירים (BM) להתרבות vivo לשעבר במערכת מחקה את microenvironment של BM האדם באופן הדוק. ניסיונות קודמים בגידול תאי BM אנושי ראשוניים בתרבויות 2-D, נוזל או cocultures חסיד עם רכיבים שונים של stroma BM, או 3-D, תרבויות אגר חצי מוצק נפגשו עם הצלחה מוגבלת בשל חוסר היכולת שלהם לספק את התאים עם הרכיבים של microenvironment הרקמה 15-18. במערכות אלה היו תאי BM עיקריים כדאיות עניות ולא הצליחו להתרבות vivo לשעבר. מערכת נוספת שבו תאי BM אדם גדלים בcocultures אליפטית עם תאי סטרומה BM היא מערכת 3-D בו כדאיות תא גזע hematopoietic ושגשוגם נשמרו במשך לפחות 96 שעה 19. עם זאת, למרות שמאוד מועיל להבנת הביולוגיה אבות היווצרות הדם, מערכת זו אינה נאמנות לשחזר את microenvironment של BM בשל היעדר רכיבי ECM, ולכן, מה שמגביל את השימושיות שלה. דגם RBM המתואר כאן מציג מערכת מקיפה שבו שני התאים סלולריים ותאיים של BM האדם משוחזרים במבחנה. אנו מראים כי תרבויות RBM יכולות לתמוך בצמיחת vivo לשעבר של תאים אנושיים BM רגילים, כפי שאנוll כמו תאים מבודדים מחולים עם הפרעות המטולוגיות שונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

תרבית רקמה הייתה כלי רב ערך כדי ללמוד על היבטים רבים של תפקוד תא, מהתפתחות נורמלית למחלה. שיטות תרבות תאים רגילות להסתמך על היכולת של תאים או לצרף לתשתית מוצקה של צלחת תרבית רקמה או לגדול בתרחיף במדיום נוזלי. נוצרו שורות תאים אלמותיים מרובות וגדלו תוך שימוש בגישות אלה, עם זאת, שיטות אלה לעתים קרובות להיכשל כאשר תאים ראשוניים צריכים להיות מבוגרים vivo לשעבר. כישלון כזה יוחס להעדרם של רכיבי מטריצה ​​תאיים המתאימים של microenvironment הרקמה מהמערכות סטנדרטיות שבו פלסטיק תרבית רקמה משמש כמשטח לצמיחת תאים. מטריצה ​​תאית היא מרכיב בלתי נפרד של microenvironment הרקמות ונוכחותה היא חיונית לשמירה על תפקודים פיסיולוגיים כגון קיטוב תא, הישרדות, ושגשוגם. כאן אנו מציגים שיטת תרבית רקמה 3 ממדים שבו cel מוח עצם העיקריls גדלים במטריצה ​​תאית גובשה כדי לשחזר את microenvironment של עצמות אדם (מערכת RBM). משובץ במטריצה ​​תאית, תאים מסופקים עם חומרים מזינים דרך המדיום בתוספת פלזמה אנושית, ובכך לספק מערכת מקיפה שבו הישרדות תא ושגשוגם יכולים להתקיים לעד 30 ימים תוך שמירה על ההרכב התאי של הרקמות ראשוניות. שימוש במערכת RBM יש לנו גדלו בהצלחה תאי מח העצם עיקריים מתורמים רגילים וחולים עם עמילואידוזיס, ומחלות דם ממאירות שונות. מערכת RBM מאפשרת הדמיה ישירה, במטריצה ​​בזמן אמת של התנהגות התא וההערכה של יעילות קליני של תרופות חדשות. יתר על כן, ניתן לבודד תאים מRBM ולאחר מכן נעשה שימוש להשתלת in vivo, מיון תא, cytometry זרימה, וחומצות גרעין וניתוח חלבון. יחדיו, שיטת RBM מספקת מערכת אמינה לצמיחה של Marro עצם העיקריתאי w בתנאים פיסיולוגיים.

מכיוון שתאי מח עצם העיקרי אינם מצליחים להתרבות בתנאי תרבית רקמה רגילים, מערכת RBM נוצרה כדי לחקות באופן הדוק microenvironment העצם, מתן מערכת לתרבות ולהרחיב את תאי BM vivo לשעבר. המרכיבים העיקריים של מטריצת BM תאית, פיברונקטין, קולגן I, קולגן IV, וlaminin 21, שולבו מטריצת RBM לספ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies at JoVE.com

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Views.  Purdue University.  בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות. 

Video: A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...