Yazarlar mükemmel balık yetiştiriciliği ve teknik destek için Xixia Luo teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe R21EY019401 (RT) ve P30EY04068 (RT) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilen ve Wayne State Üniversitesi, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı için Körlük Önleme Araştırma tarafından sınırsız ödenekle de dahil olmak üzere, RT para start-up oldu. JT Wayne State Üniversitesi Enstitü tarafından sağlanan Thomas C. Rumble Bursu ile desteklenmiştir.

Bu protokol açıklanan tüm prosedürleri Tıp Wayne State Üniversitesi Okulu&#39;nda hayvan kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Koyu Adaptasyon <ol><li> Transferi karanlık bir muhafaza içine normal konut sisteminden 10 yetişkin albino veya pigmentli balık ~. Varsa, tank ile normal su akışını sağlayan Zebra balığı konut modülü, yerleşik bir karanlık muhafaza kullanın. (Böyle bir sistem mevcut değilse, oksijen ile balık havalandırmak için emin olun, tamamen karanlık bir muhafaza içinde akvaryum yerleştirin). </li><li> 10 gün boyunca karanlıkta balık tutun. Hayvan besleme veya koyu kutusuna yeni balık eklerken, ışık uzun bir süre için balık maruz kalmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk hareket etmek emin olun. </li></ol> 2. UV Pozlama <ol><li> UV kaynağı için güç KAPALI olduğundan emin olun. Floresan stereomikroskopta gelen UV ışığı filament çıkarın. <ol><li> Ters bir kullanmaUV filament için bir stand olarak 15 cm çapında cam Petri kabı (ya da benzer bir 2 cm yüksekliğinde bir şey). Laboratuar tezgah Petri kabı bant. </li><li> Bant UV ışığı filament ters Petri kabı dön. Düzenlemek böylece Petri kabı filamanın çıkıntılar sonu ~ 2 mm. </li></ol></li><li> 250 ml&#39;lik bir cam kabın elde edilir. Alt ½, iki ve arka alüminyum folyo ile beher, folyo &quot;parlak&quot; yan beher iç yüzleri emin Kapak. Beher derecelendirilmişse, maruz beher açık yarım bırakarak, folyo ile beher ifadeli yarısını kapsar. </li><li> Balık tesisi sistemi, 100 ml su ile 250 ml beher doldurun. </li><li> Bir 4 L&#39;lik bir behere 250 ml beher yerleştirin. Su seviyesi, hatta 250 ml beher 100 ml su hattı ile kadar su ile 4 L kaba doldurun. </li><li> 250 ml&#39;lik behere 10 koyu ile muamele edilmiş hayvanların, maksimum ekleyin. Alüminyum küçük bir parça ile 250 ml beher Kapakfolyo. </li><li> UV filamana hemen bitişiğindeki tüm beher cihaz yerleştirin. Filaman 4 L kaba dış dokunarak ve 250 ml&#39;lik bir açıkta kalan kısmı bakmalıdır. 250 ml&#39;lik 4 L kaba alt merkezli olduğundan emin olun. </li><li> Maruz hayvanlar için izin, ancak UV filamanın ucu görmesini herhangi bir laboratuar personeli önlenmesi, 4L beher arkasında büyük, opak ekran yerleştirin. UYARI: Bu bariyer UV kaynağına Gücü açmadan ÖNCE yerinde olduğundan emin olun. </li><li> UV güç kaynağı açın. 30 dakika zamanlayıcı ayarlayın. Ne olursa olsun gerekli uyarı etiketleri bu masum laboratuar personeli yanlışlıkla UV ışınlarına kendilerini maruz bırakmayın sağlamak için yerleştirin. </li><li> 30 dakika sonra, UV güç kaynağı kapatın. Balık ile 250 ml beher çıkarın. NOT: UV ışınlarına maruz kalma birden fazla tur gerekiyorsa, pozlama protokolü tekrar önce (~ 20 dk) aşağı güç kaynağı soğumasını bekleyin. T yerine emin olunO her teşhir için taze sistemi su ile, 100 ml su. 4 L beher su değiştirilmesi gerekmez. </li></ol> 3. Halojen Lamba Işık Pozlama <ol><li> 1.8 L açık akrilik akvaryum içine 250 ml kaptan balık aktarın. Taşma işareti doldurun. </li><li> Halojen lamba ışığı tedavi alanı ayarlayın. Yerel bir nalburdan dört 250 W halojen lambalar programı edinin. Aynı yönde iki lamba bakan, merkezi dışında 29 cm düzenlemek. Benzer bir şekilde diğer iki lamba düzenleyin. <ol><li> Bu lambaların her iki set arasında ~ 73 cm bırakarak, lambalar ilk kümesi bakacak şekilde lambaların ikinci kümesi yerleştirin. Bu 29 x 73 cm dikdörtgen şeklinde ışık tedavisi alan oluşturur. </li></ol></li><li> Yerel bir nalburdan küçük bir fan alın. Sadece ışık tedavisi alanı dışında, lambaların iki takım arasında eşit uzaklıkta fan yerleştirin. </li><li> Ortasına su dolu iki 1.8 L tank yerleştirinlambaların iki takım arasında eşit uzaklıkta ışık tedavisi alan,. Lambaları ve tankın dış duvar arasındaki mesafe ~ 29 cm olmalıdır. Not: Sadece bir 1,8 L tankta 10 balık tedavi olsa bile, bu düzenleme kullanın. Her iki tank uygun aralık içinde her tankın su sıcaklığı tutmak için gereklidir. </li><li> Her tankta bir oksijen havalandırıcı yerleştirin. </li><li> Fan en yakın sonunda bir ~ 2 cm boşluk bırakarak, şeffaf akrilik kapaklı her tankı kapağı. Bu boşluğu içine hava darbe böylece fan düzenleyin. Tanklarının biri veya her ikisi bir termometre yerleştirin. </li><li> Işıklar, fan ve havalandırıcılar için güç açın. En fazla 4 gün için ışık tedavisi koruyun. Bu hayvanlara daha fazla stres su kalitesi ve sonuç etkileyecek gibi balık, ışık tedavisi sırasında verilmemelidir. </li><li> Günlük olarak ısı ve su izleyin. 30-33 ° C sıcaklıkta muhafaza Gerekirse, fan hızı ve / veya tank ve Li arasındaki mesafeyi ayarlamakghts. <ol><li> Gerektiği gibi, genellikle günlük sistemi su ile her bir tank kapalı üst. </li><li> Her zaman% 100 yakın bir hayatta kalma oranı korumak için sağlıklı yetişkin zebrafish (yaş genellikle 6-9 ay) kullanın. Bir balık tankında ölü bulundu Ancak, eğer, hemen çıkarın ve tüm depodaki su değiştirin. </li></ol></li></ol> 4. Doku Toplama <ol><li> Halojen ışık tedavinin başlangıcından sonra 48 saat tedavi alanından balık çıkarın. <ol><li> Taze etanol formaldehit fiksatif (1 kısım% 37 formaldehit, 9 parça% 100 etanol) hazırlayın. </li><li> 2-fenoksietanol (0.4 mg / L) bir anestezik doz aşımı ile Zebra balığı euthanize. </li><li> Bir kağıt havlu için ötenazi Zebra balığı aktarın. Kavisli bir forseps kullanarak göz tanıttılar. </li><li> 4 ° C&#39;de sabitleştirici ve mağaza O / N enüklee gözleri yerleştirin </li></ol></li><li> Gözler cryoprotect. <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sakkaroz 1x PBS yıkayınız, sonra bunun yerine2 saat boyunca% 5 sakkaroz taze PBS 1x. Daha sonra, 4 ° C&#39;de% 30 sukroz PBS 1x O / N yıkayın 4 ° C&#39;de bir doku dondurma orta ve% 30 sakaroz PBS 1x O / N 1:1 &#39;lik bir (eşit bölümler) içinde yıkayın </li></ol></li><li> -80% 100 doku dondurma orta ve mağaza gözleri Embed ° C Yönlendirmek gözleri böylece doku cryosectioning dorsal / ventral eksen üzerinde gerçekleştirilir. </li><li> Cam slaytlar cryosection doku ve yer. 55 ° C&#39;de 2 saat boyunca sıcak slaytlar -80 Mağaza slaytlar ° C veya hemen standart immünhistokimya gerçekleştirin. </li><li> Floresan mikroskobu 40,51 ile kesitli doku ve görüntü standart immünhistokimya gerçekleştirin. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada yaygın fotoreseptör kaybı ve güçlü bir yenilenme yanıt olarak sürekli bir parlak ışığa maruz kalma sonucu ile kısa UV ışınlarına maruz kalma birleştirerek olduğunu göstermektedir. Bireysel LIRD yöntem ile karşılaştırıldığında, bu kombine yöntem de retina her iki yarısı da çubuk ve koni hem de zarar için en etkili bir protokoldür. Önemli olarak, bu tedavi pigmentli hayvanların yanı sıra albino hayvanlarda etkilidir. Daha yaygın ve tutarl...

Işık kaynaklı retina dejenerasyonuna (LIRD) genellikle kemirgenlerde ve hasar çubuk ve koni fotoreseptör için zebrabalıkları hem de kullanılır. Yetişkin Zebra balığı, fotoreseptör dejenerasyonu Müller glial hücreler yeniden girmek hücre döngüsü için tetikler ve geçici-yükselterek ataları üretmek. Bu ataları onlar sonuçta yeni bir fotoreseptör neden hasarlı bölgeye, göç gibi yayılmaya devam etmektedir. Şu anda, iki yaygın olarak kullanılan LIRD paradigmalar, her biri yenilenmesi yanıt olarak fotoreseptör kaybını ve buna tekabül eden farklar değişen derecelerde sonuçlar birçok türü vardır. Daha fazla genetik ve farmakolojik rejenerasyon sırasında ilgi tek tek genlerin rolü test etmek için kullanılabilir gibi, güçlü bir LIRD paradigma geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Burada bir LIRD protokol açıklar biz iki daha önce kurulmuş LIRD tekniklerinin kullanılması birleştirdik hangi çubuk ve koni fotoreseptör hem de yaygın ve tutarlı kaybına neden olur. Ayrıca, Bu protokol LIRD çalışmaları için albino arka planda ilgi transgenik hatları korumak için gereğini ortadan kaldırır pigmentli hayvanlarda kullanılmak üzere uzatılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV light source</td>
			<td style="width:215px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">EL600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS3160152BO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS1000250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 L glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS10004L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-105</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 W halogen lamps</td>
			<td>Workforce</td>
			<td>265-669</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tanks</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tank lids</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180LCL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fan</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>HT-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aerator</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>77853-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermometer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>YO-08008-58</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent forceps (5/45)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish

Işık kaynaklı retina dejenerasyonuna (LIRD) genellikle kemirgenlerde ve hasar çubuk ve koni fotoreseptör için zebrabalıkları hem de kullanılır. Yetişkin Zebra balığı, fotoreseptör dejenerasyonu Müller glial hücreler yeniden girmek hücre döngüsü için tetikler ve geçici-yükselterek ataları üretmek. Bu ataları onlar sonuçta yeni bir fotoreseptör neden hasarlı bölgeye, göç gibi yayılmaya devam etmektedir. Şu anda, iki yaygın olarak kullanılan LIRD paradigmalar, her biri yenilenmesi yanıt olarak fotoreseptör kaybını ve buna tekabül eden farklar değişen derecelerde sonuçlar birçok türü vardır. Daha fazla genetik ve farmakolojik rejenerasyon sırasında ilgi tek tek genlerin rolü test etmek için kullanılabilir gibi, güçlü bir LIRD paradigma geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Burada bir LIRD protokol açıklar biz iki daha önce kurulmuş LIRD tekniklerinin kullanılması birleştirdik hangi çubuk ve koni fotoreseptör hem de yaygın ve tutarlı kaybına neden olur. Ayrıca, Bu protokol LIRD çalışmaları için albino arka planda ilgi transgenik hatları korumak için gereğini ortadan kaldırır pigmentli hayvanlarda kullanılmak üzere uzatılabilir.

Evvel tarif ışık tedavi protokolü LIRD her bir yöntemi ile karşılaştırılmıştır. Koyu ile tedavi edilen hayvanlarda yetişkin albino (Şekil 3-5), bireysel ışık tedavileri önemli bir çubuk kaybı (Şekil 3) ve koni (Şekil 4) fotoreseptör sonuçlandı. Ancak, her iki bireysel tedaviler öncelikle nispeten ışık tedavileri (Şekil 3 ve 4) korunmaktadır ventral retina bırakarak, retinanın dorsal yarısında...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish at JoVE.com

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Çoklu ışık zarar protokolleri zarar fotoreseptör tarif ve dolayısıyla yetişkin zebrafish bir retina rejenerasyon tepki neden olmuştur. Bu protokol, pigmentli hayvanlarda kullanılabilen geliştirilmiş bir yöntem açıklanır ve bu çubuk ve tüm retinada arasında koni fotoreseptörlerin büyük çoğunluğu zarar verir.

Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

a-novel-light-damage-paradigm-for-use-retinal-regeneration-studies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine.  Çoklu ışık zarar protokolleri zarar fotoreseptör tarif ve dolayısıyla yetişkin zebrafish bir retina rejenerasyon tepki neden olmuştur. Bu protokol, pigmentli hayvanlarda kullanılabilen geliştirilmiş bir yöntem açıklanır ve bu çubuk ve tüm retinada arasında koni fotoreseptörlerin büyük çoğunluğu zarar verir. 