Les auteurs tiennent à remercier Xixia Luo pour un excellent élevage de poissons et de soutien technique. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health des subventions R21EY019401 (RT) et P30EY04068 (RT) national, et des fonds de démarrage à la température ambiante, y compris une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité à la Wayne State University, Department of Ophthalmology. JT a été soutenue par un Thomas C. Rumble bourse fourni par l&#39;école Wayne State University Graduate.

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le comité de l&#39;utilisation des animaux à la Wayne University School of Medicine Etat. 1. Adaptation à l&#39;obscurité <ol><li> Transfert ~ 10 poissons adultes albinos ou pigmenté à partir du système de logement normale dans une enceinte sombre. Si possible, utilisez un boîtier noir qui est intégré dans le module de logement poisson zèbre, ce qui permet l&#39;écoulement normal de l&#39;eau dans le réservoir. (Si un tel système n&#39;est pas disponible, placez le réservoir de poissons dans un boîtier entièrement noir, en veillant à aérer le poisson avec de l&#39;oxygène). </li><li> Gardez le poisson dans l&#39;obscurité pendant 10 jours. Lors de l&#39;alimentation des animaux ou en ajoutant de nouveaux poissons à la boîte sombre, assurez-vous de passer le plus rapidement possible pour éviter d&#39;exposer le poisson à une longue période de lumière. </li></ol> 2. UV exposition à la lumière <ol><li> Assurez-vous que la puissance de la source UV est éteinte. Retirez le filament de lumière UV stéréoscopique fluorescent. <ol><li> Utiliser un inversé15 cm de diamètre en verre de Pétri (ou quelque chose de semblable cm hauteur 2) comme un support pour le filament UV. Tape le boîte de Pétri à la paillasse. </li><li> Tape le filament de lumière UV en haut de la boîte de Petri inversée. Arrangement de sorte que ~ 2 mm de l&#39;extrémité des saillies de filament de la boîte de Pétri. </li></ol></li><li> Obtenir un bécher en verre de 250. Couvrir la moitié du bas, sur les côtés et l&#39;arrière du bécher avec du papier d&#39;aluminium, en s&#39;assurant que le côté &quot;brillant&quot; de la feuille tournée vers l&#39;intérieur du gobelet. Si le récipient est gradué, couvrir la moitié rédigé du bécher d&#39;une feuille, laissant la moitié claire du bécher exposée. </li><li> Remplir le bécher de 250 ml avec 100 ml d&#39;eau du système d&#39;installation de poisson. </li><li> Placer le bécher de 250 ml dans un bécher 4. Remplissez le 4 L bécher avec de l&#39;eau jusqu&#39;à ce que le niveau de l&#39;eau est encore à la ligne d&#39;eau de 100 ml dans le bécher de 250 ml. </li><li> Ajouter un maximum de 10 animaux sombre traités au bécher de 250 ml. Couvrir le bécher de 250 ml avec un petit morceau d&#39;aluminiumdéjouer. </li><li> Placer l&#39;ensemble de l&#39;appareil de gobelet à proximité immédiate du filament UV. Le filament doit être en contact avec l&#39;extérieur du récipient 4 L et faisant face à la partie exposée du bécher de 250 ml. Assurez-vous que le bécher de 250 ml est centré dans le bas de la 4 L bécher. </li><li> Placez un grand écran opaque derrière le bécher 4L, ce qui permet aux animaux d&#39;être exposés, mais empêchant tout le personnel de laboratoire de voir le bout du filament UV. ATTENTION: assurez-vous que cette barrière est en place avant la mise sous tension de la source UV. </li><li> Allumez la source d&#39;alimentation UV. Régler la minuterie pour 30 min. Lieu que ce soit les étiquettes d&#39;avertissement nécessaires pour s&#39;assurer que le personnel de laboratoire sans méfiance ne pas accidentellement s&#39;exposer au rayonnement UV. </li><li> Après 30 minutes, éteindre la source d&#39;alimentation UV. Retirer le bécher de 250 ml avec le poisson. Remarque: Si plusieurs tours de l&#39;exposition aux UV sont nécessaires, laisser la source d&#39;alimentation refroidir (~ 20 min) avant de répéter le protocole d&#39;exposition. Veillez à remplacer til 100 ml d&#39;eau avec de l&#39;eau fraîche du système pour chaque exposition. L&#39;eau dans le bécher 4 L n&#39;a pas besoin d&#39;être remplacé. </li></ol> 3. Lampe halogène exposition à la lumière <ol><li> Transférer le poisson de 250 ml bécher dans un L aquarium en acrylique transparent 1.8. Remplir le réservoir jusqu&#39;à la marque de débordement. </li><li> Mettre en place la zone de traitement de la lumière d&#39;une lampe halogène. Obtenir quatre lampes utilitaires halogène de 250 W à partir d&#39;une quincaillerie locale. Face à deux lampes dans la même direction, organiser 29 cm de distance de centre à centre. Disposer les deux autres lampes de la même façon. <ol><li> Placer le second ensemble de lampes de sorte qu&#39;ils font face à la première série de lampes, en laissant ~ 73 cm entre les deux séries de lampes. Cela crée une zone de traitement par la lumière en forme de rectangle de 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Procurez-vous un petit ventilateur à partir d&#39;une quincaillerie locale. Placez le ventilateur à égale distance entre les deux ensembles de lampes, juste à l&#39;extérieur de la zone de traitement par la lumière. </li><li> Placez deux 1.8 L réservoirs remplis d&#39;eau dans le centre de lala zone de traitement à la lumière, à égale distance entre les deux jeux de lampes. La distance entre les lampes et la paroi extérieure de la cuve doit être ~ 29 cm. Remarque: même si seulement traiter 10 poissons dans un réservoir de 1,8 L, utiliser cet arrangement. Les deux réservoirs sont nécessaires pour maintenir la température de l&#39;eau de chaque réservoir dans la plage appropriée. </li><li> Placer un aérateur de l&#39;oxygène dans chaque réservoir. </li><li> Couvrir chaque réservoir avec des couvercles acryliques claires, laissant un écart de ~ 2 cm à l&#39;extrémité la plus proche du ventilateur. Disposer le ventilateur afin qu&#39;il souffler de l&#39;air dans cet espace. Placer un thermomètre dans l&#39;une ou les deux des réservoirs. </li><li> Tournez sur la puissance de la lumière, des ventilateurs et aérateurs. Maintenir traitement par la lumière pour un maximum de 4 jours. Le poisson ne doit pas être alimenté pendant le traitement par la lumière, car cela aura une incidence sur la qualité de l&#39;eau et se traduisent par plus de stress pour les animaux. </li><li> Surveiller le niveau de la température et de l&#39;eau sur une base quotidienne. Maintenir la température à 30-33 ° C. Si nécessaire, ajuster la vitesse du ventilateur et / ou la distance entre les réservoirs et la lidro. <ol><li> Couronner chaque réservoir avec de l&#39;eau du système en fonction des besoins, habituellement tous les jours. </li><li> Toujours utiliser le poisson zèbre adulte en bonne santé (en général 6-9 mois d&#39;âge) afin de maintenir un taux de survie de près de 100%. Toutefois, si un poisson est retrouvé mort dans le réservoir, retirez-le immédiatement et remplacez l&#39;eau dans l&#39;ensemble du réservoir. </li></ol></li></ol> 4. Collection de tissus <ol><li> 48 h après le début du traitement par la lumière d&#39;halogène retirer le poisson de la zone de traitement. <ol><li> Préparer fixateur de formaldéhyde éthanol frais (1 part 37% de formaldéhyde, 9 parties d&#39;éthanol à 100%). </li><li> Euthanasier poisson zèbre avec une surdose d&#39;anesthésique de 2-phénoxyéthanol (0,4 mg / L). </li><li> Transférer le poisson zèbre euthanasiés à une serviette en papier. Énucléer l&#39;œil en utilisant des pinces courbes. </li><li> Placez les yeux énucléés dans un fixateur et un magasin O / N à 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect les yeux. <ol><li> Laver les yeux à 5% de saccharose 1x PBS pendant 30 min à température ambiante, puis remplacez-le parfrais 5% de saccharose 1x PBS pendant 2 heures. Ensuite, laver les yeux à 30% de saccharose 1x PBS O / N à 4 ° C. Laver les yeux dans un mélange 1:1 (parties égales) de milieu de congélation de tissu et de 30% de saccharose PBS 1x O / N à 4 ° C. </li></ol></li><li> Intégrer les yeux dans le milieu de congélation de tissu 100% et conserver à -80 ° C. Orienter les yeux pour que cryosectioning du tissu est réalisé sur l&#39;axe dorsal / ventral. </li><li> Cryosection le tissu et le placer sur des lames de verre. Diapositives chaudes pendant 2 heures à 55 ° C. Stocker les lames à -80 ° C ou d&#39;effectuer immédiatement immunohistochimie standard. </li><li> Effectuer standard d&#39;immunohistochimie sur les tissus sectionnés et l&#39;image par microscopie fluorescente 40,51. </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ici, nous montrons que la combinaison d&#39;une exposition aux UV court avec une lumière continuelles résultats d&#39;exposition à une perte des photorécepteurs généralisée et une réponse de régénération robuste. En comparaison avec les méthodes de LIRD individuels, cette méthode combinée est aussi le protocole le plus efficace pour endommager les bâtonnets et les cônes dans les deux moitiés de la rétine. Surtout, ce traitement est efficace chez les animaux pigmentés ainsi que les animaux albinos....

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d&#39;intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l&#39;utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d&#39;intérêt sur ​​le fond albinos pour les études LIRD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV light source</td>
			<td style="width:215px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">EL600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS3160152BO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS1000250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 L glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS10004L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-105</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 W halogen lamps</td>
			<td>Workforce</td>
			<td>265-669</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tanks</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tank lids</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180LCL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fan</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>HT-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aerator</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>77853-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermometer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>YO-08008-58</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent forceps (5/45)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d&#39;intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l&#39;utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d&#39;intérêt sur le fond albinos pour les études LIRD.

Le protocole de traitement de la lumière décrit ci-dessus a été comparée à chaque méthode individuelle de LIRD. Chez les animaux albinos adultes dark-traitées (figures 3-5), les traitements de lumière individuelles a entraîné une perte importante de la tige (Figure 3) et le cône (Figure 4) photorécepteurs. Cependant, les deux traitements individuels endommagés principalement photorécepteurs dans la moitié postérieure de la rétine, en laissant ...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish at JoVE.com

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière.

A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

a-novel-light-damage-paradigm-for-use-retinal-regeneration-studies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K vues.  Wayne State University School of Medicine.  Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière. 

Vidéo: A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Enregistrement et analyse des rythmes circadiens dans la course roue-activité chez les rongeurs

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Recherche

Neurosciences

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab blessures plaies du poisson zèbre adulte Télencéphale: Une méthode pour étudier le cerveau des vertébrés neurogenèse et régénération

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Un modèle novateur In Vitro de Blast traumatisme crânien

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, and size are processed and integrated within numerous brain areas, then ultimately relayed to the motor periphery. In some instances, a reaction is needed as fast as possible. These fast visuomotor transformations, and their underlying neurological substrates, are poorly understood in humans as they have lacked a reliable biomarker. Stimulus-locked responses (SLRs) are short latency (&#60;100 ms) bursts of electromyographic (EMG) activity representing the first wave of muscle recruitment influenced by visual stimulus presentation. SLRs provide a quantifiable output of rapid visuomotor transformations, but SLRs have not been consistently observed in all subjects in past studies. Here we describe a new, behavioral paradigm featuring the sudden emergence of a moving target below an obstacle that consistently evokes robust SLRs. Human participants generated visually guided reaches toward or away from the emerging target using a robotic manipulandum while surface electrodes recorded EMG activity from the pectoralis major muscle. In comparison to previous studies that investigated SLRs using static stimuli, the SLRs evoked with this emerging target paradigm were larger, evolved earlier, and were present in all participants. Reach reaction times (RTs) were also expedited in the emerging target paradigm. This paradigm affords numerous opportunities for modification that could permit systematic study of the impact of various sensory, cognitive, and motor manipulations on fast visuomotor responses. Overall, our results demonstrate that an emerging target paradigm is capable of consistently and robustly evoking activity within a fast visuomotor system.

Presented here is a behavioral paradigm that elicits robust fast visuomotor responses on human upper limb muscles during visually guided reaches.

Un paradigme cible émergent pour évoquer des réponses visuomotrices rapides sur les muscles des membres supérieurs humains

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...