Yazarlar, onların bakım ve onarım Zebra balığı Zebra balığı Araştırma personel için Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi ve Merkez teşekkür etmek istiyorum.

1. Morfolino hazırlanması: <ol><li> Tüm morfolino oligos (Philomath OR) özel olarak tasarlanmış ve GeneTools üzerinden sipariş edilmelidir. Biz, negatif elektrot doğru electroporated morpholinos sürücü pozitif yüklü lissamine etiketli morpholinos kullanın. Biz bu tekniği kullanarak pozitif elektrot negatif yüklü floresein etiketli morpholinos hedef, başarısız çalıştı. 3 mM çözüm verim 100 ul nükleaz ücretsiz su içine morfolino 300 nmol sulandırınız. Birden fazla parafin mühürlü mikrosantrifüj tüpler içine kısım morfolino. Oda sıcaklığında ışıktan uzakta saklayınız. </li><li> 0.1 N HCl 95 ul 5 ul morfolino (veya boş olarak morfolino sulandırmak için kullanılan su) seyreltilmesi ile morfolino konsantrasyonunu belirleyin. Spektrofotometre dalga boyu (λ) 265 nm ayarlayın. Morfolino için aşağıdaki denklemi kullanarak sabit hesaplayın: Özellikle sizin morpholin sabiti = molekül ağırlığıo X 1000/molar absorbans. </li><li> Her morfolino ile sağlanan &quot;Oligo Özellikler&quot; sac moleküler ağırlık ve molar absorbansı veriler bulacaksınız. Başlangıçtaki ölçümleri doğrulamak ve her seyreltilmiş morfolino okuma almak için boş bir analiz edin. Ng / ml konsantrasyonu elde etmek için, belirlenen sabit ve seyreltme faktörü her morfolino 265 nm&#39;de absorbans çarpın. MM konsantrasyonunu belirlemek için moleküler ağırlığı ile bu sayı bölün. Çalışan bir konsantrasyon için, gerekirse, morfolino seyreltilir. </li></ol> 2. Dış kornea tabakası çıkarın: <ol><li> Zebrafish tankı su 1.0 mg / ml veya 2-fenoksietanol Tricaine anestezi 6-12 aylık yetişkin zebrafish. </li><li> Bir Wrap zebrafish solungaçları kapsayan, ancak göz maruz bırakarak, ıslatılmış kağıt havlu parçası. Gözün çapı yaklaşık üçte birinin doldurana kadar sarılmış balık Stereoskop altında yerleştirilir ve büyütme artargörme alanı (Şekil 1). </li><li> Dumont # 5 cımbız kullanarak, optik fissür yakın dış kornea yakala. Bu doku, kırmızı renkli ve Şekil 1 &#39;de &quot;OC&quot; etiketli. &quot;CL&quot; etiketli okla gösterilen hafif bir çıkıntı veya dudak vardır. Dış kornea kaldırmak için göz genelinde düşük bir açıda (yani 10 derece) çekin. Bu uygulama ile tek hareketle tamamlanabilir. Cımbız kayma varsa, doku yeniden kapmak ve kaldırılana kadar daha düşük bir açıyla çekin. İyi bağlı kornea, göz çekildiğinde soketten yerinden olması neden olabilir. Siz başka bir cımbız ile steadying yerinden olma göz tutabilirsiniz. </li></ol> 3. Korneal kesi ve morfolino enjeksiyon: <ol><li> Dış kornea çıkarılmasını takiben hemen, öğrenci iris (Şekil 2) ile tanışır korneada küçük bir kesi yapmak. Bu bir safir bıçak neşter (Malzemeler) kullanılarak yapılır. </li><li> Bir Hamilt 0.5 3.0 mM morfolino çözüm ul yükleyinşırıngaya 33 gauge çıkarılabilir, künt uç bir iğne (Malzemeler) ile donatılmıştır. Doğrultusunda hava kabarcıklarını çıkarmak için yukarı ve aşağı Pipet. Insizyon (Şekil 2) vitreus içine iğne dikkatlice yerleştirin. Çok uzak ya da delinme retina iğneyi veya lens yerinden etmeyin. </li><li> Vitre uzaya morfolino çözüm yavaş yavaş enjekte edin. Balığın yaşına bağlı olarak, vitreus alan ~ 0.5 ul yapacak. Morfolino çözüm yerinden olduğu gibi kesi dışarı sızdıran renksiz vitreus görselleştirmek. Kesi morfolino çözüm sızıntıları küçük bir miktar kadar enjekte edilir. Açıkça göz içi lissamine etiketli morfolino görselleştirmek gerekir. </li><li> Enjeksiyonu takiben, kurtarmak için tanka balık dönün. Biz genellikle sadece bir uninjected kontrol olarak sağ göz sol göze enjekte, ancak her iki gözün elektroporasyon mümkün. </li></ol> 4. Elektroporasyon: <ol><li> Ardındanenjeksiyon, yaklaşık 10 balık solungaçları kapsayan, ancak göz maruz bırakarak, enjekte balık yeniden uyutmak ve kağıt havlu ile nemlendirilmiş bir parça sarın. Petri kabı balık aktarın. Anestezi maruz kalmasını önlemek amacıyla lateks veya benzeri eldivenler giyin. Hafifçe yemeğin altına balık tutarken, çanak (Şekil 3, sol panel) anestezi ile doldurun. </li><li> 3 mm çaplı platin plaka elektrot (Malzemeler) retinanın yaklaşık bir buçuk elektroporasyon bakliyat lokalize. Biz genellikle dorsal retina hedef. Göz ventral yarısında hafifçe pozitif elektrot aşağı doğru basın. Dış kornea kaldırıldı, göz kolayca gözün dorsal kısmı açığa döndürülür. </li><li> Gözün açıkta kalan sırt yarım hala göz ventral tarafında aşağı basarken, yakın negatif elektrot (2 mm ~ 1) yerleştirin. Zarar içinde neden olan, gözle doğrudan negatif elektrot dokunmamaya dikkatli olundorsal retina. Bir kez uygun elektrot arasındaki mesafeyi belirlemek electroporating o zaman yayılmasını sağlamak için elektrotların kol üzerindeki ayar vidası kullanın. Bu negatif elektrot pozitif elektrot pozisyonu basılı göz küresi optimum bir mesafe tutar. </li><li> CUY21 Kare Dalga Elektroporatör (Malzemeler) kullanarak göz Electroporate. Elektroporasyon parametreleri, iki ardışık 50-msn bakliyat bakliyat arasındaki 1 saniyelik duraklama, 75 V ayarlanmış olmalıdır. </li><li> Tank balık dönün. Biz genellikle hemen elektroporasyon sabit ışık indüklenen retinal dejenerasyon için bizim protokol başlar. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: <ol><li> Elektroporasyon (morfolino istikrarı bağlı) takip eden 3-5 gün için, lissamine etiketi kesitli retina (Şekil 4) retina tabakalarının tüm görüntülenebilmekte. Bu varlığı için bir onay olarak hizmet vermektedirmorfolino etiketli. </li><li> Biz elektroporasyon aşağıdaki morfolino etkinliği (Şekil 5) bağlı olarak, 3-5 gün kadar tam protein demonte elde edebilirsiniz. Tipik olarak, ışık tedavisi çalışmaları sırasında, morfolino elektroporasyon sonra 3 veya 4 gün gözleri hasat. Ve immünhistokimya 15 doku işleme; Bu kavisli biter (Malzeme Şekil 6) Dumont # 5B forseps ile tüm göz kaldırarak yapılır. Herhangi bir devirme tekniği ile olduğu gibi, verimli demonte bir gösteri fenotipi doğrulamak için gösterilmesi gerekir. Bu nedenle, ilgi protein elde antiserumlar öneririz. Alternatif olarak, ve antikor ve morfolino pre-mRNA splice alıcısı ya da donör saha ya yönlendirilir, mRNA verimli ekleme engeller. Bu durumda, sınırdaş morphant RNA dizileri yükseltmek ve normal splic engelleme etkinliğini belirlemek için ters transkriptaz-PCR kullanmak mümküning desen. </li><li> Retinanın nazal dorsal ventral eksen üzerinde zamansal kesitli, gölgeli mavi kutular (Şekil 6), en sık elektroporasyon olayın kendisi zarar retina alanları temsil eder. Gölgeli pembe bir kutu elektroporasyon retina hücrelerine morfolino giriş için hedeflenen alanını temsil eder. </li></ol><img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Şekil 1: Şematik kornea epitel katmanlarının kaldırılması tasvir. Sol paneli lens (L), vitreus (Vit), retina (R), dış kornea (OC), iç kornea (IC) ve kornea çıkıntı (gözün en önemli yapısal özellikleri, CL). Ilk panelde sağ alt göz oryantasyon gösterilen (V) ve anterior (A), posterior (P), dorsal (D) etiketli ve ventral. Kırmızı renklenme kaldırılır dış kornea gösterir. İkinci bir tavada<html> El forseps kornea çıkıntı kavramak için ve düşük bir açıda (üçüncü paneli), göz genelinde dış kornea çekmek için nasıl kullanıldığını gösterir. Sağ panelde, kornea çekerken forseps ikinci bir çift kararlı göz için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Şekil 2 morfolino intravitreal enjeksiyon ilgili adımları şematik. Öğrenci iris (sol panel) karşılayan gözünde küçük bir kesi yapılır. Ortaya çıkan boşluğu eklenecek morfolino çözümü, (orta panel) ile dolu bir 33 iğne için yetecek büyüklükte olmalıdır. (Sağ panel) vitreus içine yavaşça 0,5 ul solüsyon enjekte edilir. Vitre çözüm vitreus morfolino (sağ panel) lissamine etiketli kısmen değiştirilir kesi çıkıp küçük bir miktar görselleştirmek gerekir. ig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3 genel elektroporasyon prosedürü şematik. Intravitreal olarak morfolino enjekte edildi anestezi balık, hafifçe nemli kağıt havlu (sol panel) sarılır. Kağıt havlu solungaçları kapağı, ama göz engellemeyin (orta panel). Yavaşça göz dorsal yarısında soket döndürmek için izin veren, göz ventral kısmı pozitif elektrot bastırın. Göz dorsal yarısından itibaren yaklaşık 1 mm negatif elektrot yerleştirin ve elektroporasyon (sağ panel) başlatın. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Şekil 4 Konfokal görüntü lissamine etiketli morfolino (B) ile intravitreal enjekte electroporated lissamine-etiketli morfolino (A) ve retina intravitreal enjekte olmadan electroporated retina karşılaştırarak. Lissamine etiketi tüm retina katmanları ve hücre tipleri bulunur. ROS, çubuk Dışsegmentleri; onl, dış nükleer tabaka; INL, iç nükleer tabaka; GCL, ganglion hücre tabakası. <img alt="Şekil 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Şekil 5 bir anti-PCNA morfolino (sağ paneller) fotoreseptör hücre ölümüne ışık kaynaklı önce electroporated kontrolü morfolino (sol paneller) ve retina ile electroporated retina PCNA immunolocalization karşılaştırarak Konfokal görüntüleri. Koyu adapte yetişkin albino zebrafish morfolino elektroporasyon sonra 1, 2 ya da 3 gün boyunca sürekli yoğun ışık yerleştirildi. Hafif hasarlı retina kontrolü morfolino artan PCNA ifade bastırmak için başarısız oldu. Anti-PCNA morfolino verimli üç gün boyunca sürekli yoğun ışık hasarı PCNA protein ekspresyonu yere serdi. <img alt="Şekil 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> P için göz enükleasyon gösteren Şekil 6. şematik (sol panel)rocessing ve cryosectioning dorsal ventral ekseni boyunca yapılır. Pembe gölgeli kutu (sağ panel), bu tekniği kullanarak protein demonte büyük miktarda retinal bölgede gösterir. Mavi gölgeli kutular elektroporasyon olay en sık hasar gören bölgeleri temsil ediyor. Göz oryantasyon etiketli anterior (A), posterior (P), dorsal (D) ve ventral (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var

Son zamanlarda, iki mikroarray analizleri hafif hasarlı retina ya da cerrahi olarak eksize retina yama 10, 16 ya rejenerasyon sırasında meydana gelen gen ekspresyonu değişiklikleri inceledi . Her iki çalışmada da, muhtemelen, hücre döngüsü içine Müller glia, yeniden giriş olarak retinal rejenerasyon sırasında meydana gelen çeşitli olaylar, için gerekli olduğunu, artan ya da azalan, ifadesinde önemli değişiklikler sergilenen çok sayıda genlerin ortaya yayılması ve göç devam hasarlı retina tabakası ve doğru nöronal hücre tipi içine nöronal progenitörlerin farklılaşma nöronal atalarıdır. Bu iki mikroarray veri setleri doğrudan bir karşılaştırma bu hücresel olayları tutulabilir aday genler ortaya koyuyor olsa da, sonuçta, bu genler ve onların kodlanmış proteinler nöronal rejenerasyonu için gerekli olup olmadığını belirlemek için test edilmelidir. Burada, conditio için güçlü bir fonksiyon-kaybı yaklaşım tarifyetişkin zebrafish retina ilgi nally demonte proteinler. Bu teknik, DNA replikasyonu 17-19 için gerekli ekstrasellüler ve intrasellüler proteinlerin yanı sıra sinyal molekülleri, transkripsiyon faktörleri ve proteinler her iki çalışma için kullanılmıştır . Böylece, bu yöntem büyük ölçüde zebrafish yetişkin retinal rejenerasyon altında yatan moleküler mekanizmayı anlayışımız destekli. Biz başarılı bir protokol sağlandı önce birden fazla elektroporasyon parametreleri test (gerilim, bakliyat, bakliyat arasındaki zaman). Yenileyici zebrafish kuyruk yüzgeci morpholinos electroporating bir önceki raporunda, düşük voltaj (15 V) 20, 10 darbeleri kullandı. Yetişkin zebrafish retina birden çok hücre katmanları ile çevrilidir ve cımbız elektrotlar kolayca erişilebilir değildir, fin kullanılan parametreler verimli yetişkin retina içine morpholinos electroporating başarısız olduk. Tersine, yüksek gerilim (100 V) sık sık resbalık ölüm ulted. Son 5 bakliyat, 80 V, yeni doğmuş fare yavru retinanın 21 plazmid DNA electroporate tarif edilmiştir . Biz biraz daha az yoğun bir 75 2 bakliyat V sağkalım ile% 100 tedavi edilen balık yetişkin zebrafish retina içine morpholinos başarılı elektroporasyon yol açtığını buldu. Ayrıca, korneanın bileşeni (ya da en dış) en dış çıkarılması elektroporasyon verimliliğini büyük ölçüde arttığını keşfetti. Bu doku çıkarılması için darbe sayısının artırılması ihtiyacını ortadan kaldırabilir ama aynı zamanda daha fazla doku hasarına neden olabilir. Kapsamlı kontrol çalışmalarında bu parametrelerin önemli bir retinal hücre ölümüne neden olabilir ya da 19 fotoreseptör rejenerasyon sırasında gözlenen hücresel yanıtları değiştirmek vermedi olduğunu göstermiştir. Fonksiyon-Kazanç çalışmaları sürekli olarak tüm r içine büyük ribonükleik asitlerin electroporate yetersizlik nedeniyle bu tekniği, in vivo olarak kullanarak şu anda mümkün değil.etinal hücreleri. Ancak, fare eksplantlar in vivo ve Zebra balığı retinanın retina içine plazmid electroporating başarı hala zebrafish 21, 22 bir olasılık olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin güçlü biri elektroporasyon, tüm farklı retinal hücre tipleri morfolino verimli tanıtmak görünür. Bununla birlikte, bir potansiyel zayıflık elektroporasyon verimli dorsal ve santral retinal bölgeye sadece morfolino teslim oldu. Retinanın tüm katmanları için iyi hedefleme sonuçları ventral yarısında doğru ikinci bir elektroporasyon olay, zarar değil, genellikle sonuçları. Bu mekansal sınırlama olasılıkla elektrotların şekil ve yerleşimi nedeniyle oldu. Göz çevresine yerleştirilen özel tasarlanmış olabilir fincan şeklinde elektrotlar kullanımı bu zayıflığı artırabilir. Morfolino teslim mekansal Bu kısıtlama, bu tekniğin kullanımını sınırlar ve bir tahlil suc engellemektedirsaat ERG analiz olarak retina küresel bir değerlendirme gerektirir. Bu herhangi bir morfolino deneme olarak, ikinci bir örtüşmeyen morfolino kullanarak hedef mRNA sonuçları doğrulamak için tavsiye olduğunu belirtmek gerekir. Bazı durumlarda, bu da demonte aynı anda iki farklı proteinin ifadesi iki farklı morpholinos electroporate mümkündür. Biz, bireysel ve kombinasyon 18 Pax6a ve Pax6b proteinlerin hem de ifade aşağı vurma bunu açıkça ortaya koymuştur. Bu tekniğin kullanımı hafif hasar modeli ile göstermesine rağmen, büyük olasılıkla diğer hasar modelleri 2-8 rejenerasyon çalışma veya proteinlerin hasarsız retinanın işlevini incelemek için kullanılan olabilir. Örneğin, morpholinos bir elektroporasyon demonte ganglion veya amacrine hücreleri belirli bir kanal ya da sinyal iletim molekülleri ifade için kullanılır ve daha sonra bu sinyal fonksiyonu çalışma olabilirgörsel işleme yollar. Ancak morpholinos sadece yeni protein çeviri etkileyebilir, önce bir test olabilir endojen protein döngüsü oluşuncaya kadar bekleyin olurdu. Protein istikrar bağlı olarak, bu gün 18 saat arasında değişmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT veya CUY21-SC Kare dalga Elektroporatör </td><td> Protech Uluslararası </td><td> CUY21EDIT veya CUY21SC </td><td> Her iki ünite de bu protokol için çalışıyor </td></tr><tr><td> 3-mm çapa kürek elektrotlar </td><td> Protech Uluslararası </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino ilgi proteine ​​özel tasarlanmış olmalıdır </td></tr><tr><td> 2-fenoksietanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anestezi; işlem için balık sistem su ile seyreltilmiş 1:1000, ötenazi için 1:500 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 cımbız </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td>14095 </td><td> # 5 cımbız ile herhangi bir çalışma </td></tr><tr><td> Dumont # 5B cımbız açılı ipuçları </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500234 </td><td> Aydınlatmak göz aşağıdaki ötenazi için kullanılır. </td></tr><tr><td> Sapphire bıçak, çift kenar ucu, Sapphire bıçak sapı ile 1 mm genişliğinde, </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> Blade: 500.314 Kulp: 500.317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton enjektörü ile çıkarılabilir göstergesi 33 künt uç iğne </td><td> Hamilton şirketi </td><td> Şırınga: 87.930 İğne: 7762-06 </td><td> Şırınga ile iğne çıkarın ve 33-gauge künt uç iğne ile değiştirin </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Birçok yıkıcı kalıtsal göz hastalıkları retina nöronlar ölüyor insanlar ya da hastalıklı yeniden çünkü ilerleyici ve geri dönüşümsüz körlük sonuçlanır. Buna karşın, yetişkin zebrafish retinanın retina ponksiyon, kimyasal ablasyonu, konsantre, yüksek sıcaklık ve yoğun ışık tedavisi 1-8 gibi farklı bir retinal hasar modelleri çeşitli kaybetmiş herhangi bir nöronal sınıf kendiliğinden yeniden oluşturmak için güçlü yeteneğine sahiptir . Bizim laboratuvar yoğun fotoreseptörlerin rejenerasyon karakterize ouabain intravitreal enjeksiyon 2, 5, 9 sonra sürekli yoğun ışık tedavisi ve iç retinal nöronların. Tüm durumlarda, Müller glia ikamet eksik nöronlar ayırt uygun retina tabakasının, çoğalırlar ve göç devam nöronal progenitörlerle üretmek için hücre döngüsü yeniden girin. Biz ışık dama rejenerasyon sırasında beş farklı aşamalarında karakterizeged retina spesifik hücresel yanıtları tarafından çizildi. Biz mRNA mikroarray analizi 10 retina yenilenme her aşamasında pek çok farklı genlerin belirledi. Bu genlerin çoğu aynı zamanda göz gelişimi için kritik öneme sahiptir. Retina rejenerasyon sırasında her aday gen / proteinin rolünü test için, biz sadece yetişkin retina rejenerasyon sırasında zaman şartlı aday protein ifadesini sınırlamak için bir yöntem geliştirmek için gerekli. Morfolino oligos zebrafish, Xenopus, civciv, fare gelişimi sırasında spesifik proteinlerin fonksiyon kaybı çalışma yaygın olarak kullanılan ve insan xenografts tümörler 11-14. Bu tamamlayıcı RNA dizisi ile değiştirilmiş oligos basepair ya hedef RNA kırpılması ya da çeviri engellemek için. Morpholinos hücre istikrarlı ve ortadan kaldırmak ya da 3-5 gün 12 için &quot;demonte&quot; protein ekspresyonu. Burada,biz verimli bir şekilde demonte yetişkin zebrafish retinada hedef protein ekspresyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, yetişkin zebrafish göz vitreus içine enjekte edilir lissamine etiketli antisens morpholinos kullanmaktadır. Morfolino elektrot forseps kullanarak, sonra dorsal ve merkezi retina hücre tipleri haline electroporated. Lissamine elektroporasyon morfolino şarj sağlar ve retina hücreleri morfolino varlığını değerlendirmek için görüntülenebilmekte. Retinada Koşullu demonte rejenerasyon sırasında farklı zamanlarda spesifik proteinlerin rolünü incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım, ikinci dereceden nöronlar görsel iletimi ve görsel işleme gibi süreçleri hasarsız retinada spesifik proteinlerin rolünü incelemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

in-vivo-electroporation-of-morpholinos-into-the-adult-zebrafish-retina

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.1K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Video: In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Yetişkin Tavşan Retina Organotipik Kültürü

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Biyoloji

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...