Yazarlar, onların bakım ve onarım Zebra balığı Zebra balığı Araştırma personel için Freimann Yaşam Bilimleri Merkezi ve Merkez teşekkür etmek istiyorum.

1. Morfolino hazırlanması: <ol><li> Tüm morfolino oligos (Philomath OR) özel olarak tasarlanmış ve GeneTools üzerinden sipariş edilmelidir. Biz, negatif elektrot doğru electroporated morpholinos sürücü pozitif yüklü lissamine etiketli morpholinos kullanın. Biz bu tekniği kullanarak pozitif elektrot negatif yüklü floresein etiketli morpholinos hedef, başarısız çalıştı. 3 mM çözüm verim 100 ul nükleaz ücretsiz su içine morfolino 300 nmol sulandırınız. Birden fazla parafin mühürlü mikrosantrifüj tüpler içine kısım morfolino. Oda sıcaklığında ışıktan uzakta saklayınız. </li><li> 0.1 N HCl 95 ul 5 ul morfolino (veya boş olarak morfolino sulandırmak için kullanılan su) seyreltilmesi ile morfolino konsantrasyonunu belirleyin. Spektrofotometre dalga boyu (λ) 265 nm ayarlayın. Morfolino için aşağıdaki denklemi kullanarak sabit hesaplayın: Özellikle sizin morpholin sabiti = molekül ağırlığıo X 1000/molar absorbans. </li><li> Her morfolino ile sağlanan &quot;Oligo Özellikler&quot; sac moleküler ağırlık ve molar absorbansı veriler bulacaksınız. Başlangıçtaki ölçümleri doğrulamak ve her seyreltilmiş morfolino okuma almak için boş bir analiz edin. Ng / ml konsantrasyonu elde etmek için, belirlenen sabit ve seyreltme faktörü her morfolino 265 nm&#39;de absorbans çarpın. MM konsantrasyonunu belirlemek için moleküler ağırlığı ile bu sayı bölün. Çalışan bir konsantrasyon için, gerekirse, morfolino seyreltilir. </li></ol> 2. Dış kornea tabakası çıkarın: <ol><li> Zebrafish tankı su 1.0 mg / ml veya 2-fenoksietanol Tricaine anestezi 6-12 aylık yetişkin zebrafish. </li><li> Bir Wrap zebrafish solungaçları kapsayan, ancak göz maruz bırakarak, ıslatılmış kağıt havlu parçası. Gözün çapı yaklaşık üçte birinin doldurana kadar sarılmış balık Stereoskop altında yerleştirilir ve büyütme artargörme alanı (Şekil 1). </li><li> Dumont # 5 cımbız kullanarak, optik fissür yakın dış kornea yakala. Bu doku, kırmızı renkli ve Şekil 1 &#39;de &quot;OC&quot; etiketli. &quot;CL&quot; etiketli okla gösterilen hafif bir çıkıntı veya dudak vardır. Dış kornea kaldırmak için göz genelinde düşük bir açıda (yani 10 derece) çekin. Bu uygulama ile tek hareketle tamamlanabilir. Cımbız kayma varsa, doku yeniden kapmak ve kaldırılana kadar daha düşük bir açıyla çekin. İyi bağlı kornea, göz çekildiğinde soketten yerinden olması neden olabilir. Siz başka bir cımbız ile steadying yerinden olma göz tutabilirsiniz. </li></ol> 3. Korneal kesi ve morfolino enjeksiyon: <ol><li> Dış kornea çıkarılmasını takiben hemen, öğrenci iris (Şekil 2) ile tanışır korneada küçük bir kesi yapmak. Bu bir safir bıçak neşter (Malzemeler) kullanılarak yapılır. </li><li> Bir Hamilt 0.5 3.0 mM morfolino çözüm ul yükleyinşırıngaya 33 gauge çıkarılabilir, künt uç bir iğne (Malzemeler) ile donatılmıştır. Doğrultusunda hava kabarcıklarını çıkarmak için yukarı ve aşağı Pipet. Insizyon (Şekil 2) vitreus içine iğne dikkatlice yerleştirin. Çok uzak ya da delinme retina iğneyi veya lens yerinden etmeyin. </li><li> Vitre uzaya morfolino çözüm yavaş yavaş enjekte edin. Balığın yaşına bağlı olarak, vitreus alan ~ 0.5 ul yapacak. Morfolino çözüm yerinden olduğu gibi kesi dışarı sızdıran renksiz vitreus görselleştirmek. Kesi morfolino çözüm sızıntıları küçük bir miktar kadar enjekte edilir. Açıkça göz içi lissamine etiketli morfolino görselleştirmek gerekir. </li><li> Enjeksiyonu takiben, kurtarmak için tanka balık dönün. Biz genellikle sadece bir uninjected kontrol olarak sağ göz sol göze enjekte, ancak her iki gözün elektroporasyon mümkün. </li></ol> 4. Elektroporasyon: <ol><li> Ardındanenjeksiyon, yaklaşık 10 balık solungaçları kapsayan, ancak göz maruz bırakarak, enjekte balık yeniden uyutmak ve kağıt havlu ile nemlendirilmiş bir parça sarın. Petri kabı balık aktarın. Anestezi maruz kalmasını önlemek amacıyla lateks veya benzeri eldivenler giyin. Hafifçe yemeğin altına balık tutarken, çanak (Şekil 3, sol panel) anestezi ile doldurun. </li><li> 3 mm çaplı platin plaka elektrot (Malzemeler) retinanın yaklaşık bir buçuk elektroporasyon bakliyat lokalize. Biz genellikle dorsal retina hedef. Göz ventral yarısında hafifçe pozitif elektrot aşağı doğru basın. Dış kornea kaldırıldı, göz kolayca gözün dorsal kısmı açığa döndürülür. </li><li> Gözün açıkta kalan sırt yarım hala göz ventral tarafında aşağı basarken, yakın negatif elektrot (2 mm ~ 1) yerleştirin. Zarar içinde neden olan, gözle doğrudan negatif elektrot dokunmamaya dikkatli olundorsal retina. Bir kez uygun elektrot arasındaki mesafeyi belirlemek electroporating o zaman yayılmasını sağlamak için elektrotların kol üzerindeki ayar vidası kullanın. Bu negatif elektrot pozitif elektrot pozisyonu basılı göz küresi optimum bir mesafe tutar. </li><li> CUY21 Kare Dalga Elektroporatör (Malzemeler) kullanarak göz Electroporate. Elektroporasyon parametreleri, iki ardışık 50-msn bakliyat bakliyat arasındaki 1 saniyelik duraklama, 75 V ayarlanmış olmalıdır. </li><li> Tank balık dönün. Biz genellikle hemen elektroporasyon sabit ışık indüklenen retinal dejenerasyon için bizim protokol başlar. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: <ol><li> Elektroporasyon (morfolino istikrarı bağlı) takip eden 3-5 gün için, lissamine etiketi kesitli retina (Şekil 4) retina tabakalarının tüm görüntülenebilmekte. Bu varlığı için bir onay olarak hizmet vermektedirmorfolino etiketli. </li><li> Biz elektroporasyon aşağıdaki morfolino etkinliği (Şekil 5) bağlı olarak, 3-5 gün kadar tam protein demonte elde edebilirsiniz. Tipik olarak, ışık tedavisi çalışmaları sırasında, morfolino elektroporasyon sonra 3 veya 4 gün gözleri hasat. Ve immünhistokimya 15 doku işleme; Bu kavisli biter (Malzeme Şekil 6) Dumont # 5B forseps ile tüm göz kaldırarak yapılır. Herhangi bir devirme tekniği ile olduğu gibi, verimli demonte bir gösteri fenotipi doğrulamak için gösterilmesi gerekir. Bu nedenle, ilgi protein elde antiserumlar öneririz. Alternatif olarak, ve antikor ve morfolino pre-mRNA splice alıcısı ya da donör saha ya yönlendirilir, mRNA verimli ekleme engeller. Bu durumda, sınırdaş morphant RNA dizileri yükseltmek ve normal splic engelleme etkinliğini belirlemek için ters transkriptaz-PCR kullanmak mümküning desen. </li><li> Retinanın nazal dorsal ventral eksen üzerinde zamansal kesitli, gölgeli mavi kutular (Şekil 6), en sık elektroporasyon olayın kendisi zarar retina alanları temsil eder. Gölgeli pembe bir kutu elektroporasyon retina hücrelerine morfolino giriş için hedeflenen alanını temsil eder. </li></ol><img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Şekil 1: Şematik kornea epitel katmanlarının kaldırılması tasvir. Sol paneli lens (L), vitreus (Vit), retina (R), dış kornea (OC), iç kornea (IC) ve kornea çıkıntı (gözün en önemli yapısal özellikleri, CL). Ilk panelde sağ alt göz oryantasyon gösterilen (V) ve anterior (A), posterior (P), dorsal (D) etiketli ve ventral. Kırmızı renklenme kaldırılır dış kornea gösterir. İkinci bir tavada<html> El forseps kornea çıkıntı kavramak için ve düşük bir açıda (üçüncü paneli), göz genelinde dış kornea çekmek için nasıl kullanıldığını gösterir. Sağ panelde, kornea çekerken forseps ikinci bir çift kararlı göz için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Şekil 2 morfolino intravitreal enjeksiyon ilgili adımları şematik. Öğrenci iris (sol panel) karşılayan gözünde küçük bir kesi yapılır. Ortaya çıkan boşluğu eklenecek morfolino çözümü, (orta panel) ile dolu bir 33 iğne için yetecek büyüklükte olmalıdır. (Sağ panel) vitreus içine yavaşça 0,5 ul solüsyon enjekte edilir. Vitre çözüm vitreus morfolino (sağ panel) lissamine etiketli kısmen değiştirilir kesi çıkıp küçük bir miktar görselleştirmek gerekir. ig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3 genel elektroporasyon prosedürü şematik. Intravitreal olarak morfolino enjekte edildi anestezi balık, hafifçe nemli kağıt havlu (sol panel) sarılır. Kağıt havlu solungaçları kapağı, ama göz engellemeyin (orta panel). Yavaşça göz dorsal yarısında soket döndürmek için izin veren, göz ventral kısmı pozitif elektrot bastırın. Göz dorsal yarısından itibaren yaklaşık 1 mm negatif elektrot yerleştirin ve elektroporasyon (sağ panel) başlatın. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Şekil 4 Konfokal görüntü lissamine etiketli morfolino (B) ile intravitreal enjekte electroporated lissamine-etiketli morfolino (A) ve retina intravitreal enjekte olmadan electroporated retina karşılaştırarak. Lissamine etiketi tüm retina katmanları ve hücre tipleri bulunur. ROS, çubuk Dışsegmentleri; onl, dış nükleer tabaka; INL, iç nükleer tabaka; GCL, ganglion hücre tabakası. <img alt="Şekil 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Şekil 5 bir anti-PCNA morfolino (sağ paneller) fotoreseptör hücre ölümüne ışık kaynaklı önce electroporated kontrolü morfolino (sol paneller) ve retina ile electroporated retina PCNA immunolocalization karşılaştırarak Konfokal görüntüleri. Koyu adapte yetişkin albino zebrafish morfolino elektroporasyon sonra 1, 2 ya da 3 gün boyunca sürekli yoğun ışık yerleştirildi. Hafif hasarlı retina kontrolü morfolino artan PCNA ifade bastırmak için başarısız oldu. Anti-PCNA morfolino verimli üç gün boyunca sürekli yoğun ışık hasarı PCNA protein ekspresyonu yere serdi. <img alt="Şekil 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> P için göz enükleasyon gösteren Şekil 6. şematik (sol panel)rocessing ve cryosectioning dorsal ventral ekseni boyunca yapılır. Pembe gölgeli kutu (sağ panel), bu tekniği kullanarak protein demonte büyük miktarda retinal bölgede gösterir. Mavi gölgeli kutular elektroporasyon olay en sık hasar gören bölgeleri temsil ediyor. Göz oryantasyon etiketli anterior (A), posterior (P), dorsal (D) ve ventral (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var

Son zamanlarda, iki mikroarray analizleri hafif hasarlı retina ya da cerrahi olarak eksize retina yama 10, 16 ya rejenerasyon sırasında meydana gelen gen ekspresyonu değişiklikleri inceledi . Her iki çalışmada da, muhtemelen, hücre döngüsü içine Müller glia, yeniden giriş olarak retinal rejenerasyon sırasında meydana gelen çeşitli olaylar, için gerekli olduğunu, artan ya da azalan, ifadesinde önemli değişiklikler sergilenen çok sayıda genlerin ortaya yayılması ve göç devam hasarlı retina tabakası ve doğru nöronal hücre tipi içine nöronal progenitörlerin farklılaşma nöronal atalarıdır. Bu iki mikroarray veri setleri doğrudan bir karşılaştırma bu hücresel olayları tutulabilir aday genler ortaya koyuyor olsa da, sonuçta, bu genler ve onların kodlanmış proteinler nöronal rejenerasyonu için gerekli olup olmadığını belirlemek için test edilmelidir. Burada, conditio için güçlü bir fonksiyon-kaybı yaklaşım tarifyetişkin zebrafish retina ilgi nally demonte proteinler. Bu teknik, DNA replikasyonu 17-19 için gerekli ekstrasellüler ve intrasellüler proteinlerin yanı sıra sinyal molekülleri, transkripsiyon faktörleri ve proteinler her iki çalışma için kullanılmıştır . Böylece, bu yöntem büyük ölçüde zebrafish yetişkin retinal rejenerasyon altında yatan moleküler mekanizmayı anlayışımız destekli. Biz başarılı bir protokol sağlandı önce birden fazla elektroporasyon parametreleri test (gerilim, bakliyat, bakliyat arasındaki zaman). Yenileyici zebrafish kuyruk yüzgeci morpholinos electroporating bir önceki raporunda, düşük voltaj (15 V) 20, 10 darbeleri kullandı. Yetişkin zebrafish retina birden çok hücre katmanları ile çevrilidir ve cımbız elektrotlar kolayca erişilebilir değildir, fin kullanılan parametreler verimli yetişkin retina içine morpholinos electroporating başarısız olduk. Tersine, yüksek gerilim (100 V) sık sık resbalık ölüm ulted. Son 5 bakliyat, 80 V, yeni doğmuş fare yavru retinanın 21 plazmid DNA electroporate tarif edilmiştir . Biz biraz daha az yoğun bir 75 2 bakliyat V sağkalım ile% 100 tedavi edilen balık yetişkin zebrafish retina içine morpholinos başarılı elektroporasyon yol açtığını buldu. Ayrıca, korneanın bileşeni (ya da en dış) en dış çıkarılması elektroporasyon verimliliğini büyük ölçüde arttığını keşfetti. Bu doku çıkarılması için darbe sayısının artırılması ihtiyacını ortadan kaldırabilir ama aynı zamanda daha fazla doku hasarına neden olabilir. Kapsamlı kontrol çalışmalarında bu parametrelerin önemli bir retinal hücre ölümüne neden olabilir ya da 19 fotoreseptör rejenerasyon sırasında gözlenen hücresel yanıtları değiştirmek vermedi olduğunu göstermiştir. Fonksiyon-Kazanç çalışmaları sürekli olarak tüm r içine büyük ribonükleik asitlerin electroporate yetersizlik nedeniyle bu tekniği, in vivo olarak kullanarak şu anda mümkün değil.etinal hücreleri. Ancak, fare eksplantlar in vivo ve Zebra balığı retinanın retina içine plazmid electroporating başarı hala zebrafish 21, 22 bir olasılık olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin güçlü biri elektroporasyon, tüm farklı retinal hücre tipleri morfolino verimli tanıtmak görünür. Bununla birlikte, bir potansiyel zayıflık elektroporasyon verimli dorsal ve santral retinal bölgeye sadece morfolino teslim oldu. Retinanın tüm katmanları için iyi hedefleme sonuçları ventral yarısında doğru ikinci bir elektroporasyon olay, zarar değil, genellikle sonuçları. Bu mekansal sınırlama olasılıkla elektrotların şekil ve yerleşimi nedeniyle oldu. Göz çevresine yerleştirilen özel tasarlanmış olabilir fincan şeklinde elektrotlar kullanımı bu zayıflığı artırabilir. Morfolino teslim mekansal Bu kısıtlama, bu tekniğin kullanımını sınırlar ve bir tahlil suc engellemektedirsaat ERG analiz olarak retina küresel bir değerlendirme gerektirir. Bu herhangi bir morfolino deneme olarak, ikinci bir örtüşmeyen morfolino kullanarak hedef mRNA sonuçları doğrulamak için tavsiye olduğunu belirtmek gerekir. Bazı durumlarda, bu da demonte aynı anda iki farklı proteinin ifadesi iki farklı morpholinos electroporate mümkündür. Biz, bireysel ve kombinasyon 18 Pax6a ve Pax6b proteinlerin hem de ifade aşağı vurma bunu açıkça ortaya koymuştur. Bu tekniğin kullanımı hafif hasar modeli ile göstermesine rağmen, büyük olasılıkla diğer hasar modelleri 2-8 rejenerasyon çalışma veya proteinlerin hasarsız retinanın işlevini incelemek için kullanılan olabilir. Örneğin, morpholinos bir elektroporasyon demonte ganglion veya amacrine hücreleri belirli bir kanal ya da sinyal iletim molekülleri ifade için kullanılır ve daha sonra bu sinyal fonksiyonu çalışma olabilirgörsel işleme yollar. Ancak morpholinos sadece yeni protein çeviri etkileyebilir, önce bir test olabilir endojen protein döngüsü oluşuncaya kadar bekleyin olurdu. Protein istikrar bağlı olarak, bu gün 18 saat arasında değişmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT veya CUY21-SC Kare dalga Elektroporatör </td><td> Protech Uluslararası </td><td> CUY21EDIT veya CUY21SC </td><td> Her iki ünite de bu protokol için çalışıyor </td></tr><tr><td> 3-mm çapa kürek elektrotlar </td><td> Protech Uluslararası </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino ilgi proteine ​​özel tasarlanmış olmalıdır </td></tr><tr><td> 2-fenoksietanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anestezi; işlem için balık sistem su ile seyreltilmiş 1:1000, ötenazi için 1:500 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 cımbız </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td>14095 </td><td> # 5 cımbız ile herhangi bir çalışma </td></tr><tr><td> Dumont # 5B cımbız açılı ipuçları </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500234 </td><td> Aydınlatmak göz aşağıdaki ötenazi için kullanılır. </td></tr><tr><td> Sapphire bıçak, çift kenar ucu, Sapphire bıçak sapı ile 1 mm genişliğinde, </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> Blade: 500.314 Kulp: 500.317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton enjektörü ile çıkarılabilir göstergesi 33 künt uç iğne </td><td> Hamilton şirketi </td><td> Şırınga: 87.930 İğne: 7762-06 </td><td> Şırınga ile iğne çıkarın ve 33-gauge künt uç iğne ile değiştirin </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Birçok yıkıcı kalıtsal göz hastalıkları retina nöronlar ölüyor insanlar ya da hastalıklı yeniden çünkü ilerleyici ve geri dönüşümsüz körlük sonuçlanır. Buna karşın, yetişkin zebrafish retinanın retina ponksiyon, kimyasal ablasyonu, konsantre, yüksek sıcaklık ve yoğun ışık tedavisi 1-8 gibi farklı bir retinal hasar modelleri çeşitli kaybetmiş herhangi bir nöronal sınıf kendiliğinden yeniden oluşturmak için güçlü yeteneğine sahiptir . Bizim laboratuvar yoğun fotoreseptörlerin rejenerasyon karakterize ouabain intravitreal enjeksiyon 2, 5, 9 sonra sürekli yoğun ışık tedavisi ve iç retinal nöronların. Tüm durumlarda, Müller glia ikamet eksik nöronlar ayırt uygun retina tabakasının, çoğalırlar ve göç devam nöronal progenitörlerle üretmek için hücre döngüsü yeniden girin. Biz ışık dama rejenerasyon sırasında beş farklı aşamalarında karakterizeged retina spesifik hücresel yanıtları tarafından çizildi. Biz mRNA mikroarray analizi 10 retina yenilenme her aşamasında pek çok farklı genlerin belirledi. Bu genlerin çoğu aynı zamanda göz gelişimi için kritik öneme sahiptir. Retina rejenerasyon sırasında her aday gen / proteinin rolünü test için, biz sadece yetişkin retina rejenerasyon sırasında zaman şartlı aday protein ifadesini sınırlamak için bir yöntem geliştirmek için gerekli. Morfolino oligos zebrafish, Xenopus, civciv, fare gelişimi sırasında spesifik proteinlerin fonksiyon kaybı çalışma yaygın olarak kullanılan ve insan xenografts tümörler 11-14. Bu tamamlayıcı RNA dizisi ile değiştirilmiş oligos basepair ya hedef RNA kırpılması ya da çeviri engellemek için. Morpholinos hücre istikrarlı ve ortadan kaldırmak ya da 3-5 gün 12 için &quot;demonte&quot; protein ekspresyonu. Burada,biz verimli bir şekilde demonte yetişkin zebrafish retinada hedef protein ekspresyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, yetişkin zebrafish göz vitreus içine enjekte edilir lissamine etiketli antisens morpholinos kullanmaktadır. Morfolino elektrot forseps kullanarak, sonra dorsal ve merkezi retina hücre tipleri haline electroporated. Lissamine elektroporasyon morfolino şarj sağlar ve retina hücreleri morfolino varlığını değerlendirmek için görüntülenebilmekte. Retinada Koşullu demonte rejenerasyon sırasında farklı zamanlarda spesifik proteinlerin rolünü incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım, ikinci dereceden nöronlar görsel iletimi ve görsel işleme gibi süreçleri hasarsız retinada spesifik proteinlerin rolünü incelemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

in-vivo-electroporation-of-morpholinos-into-the-adult-zebrafish-retina

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.0K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.