Die Autoren möchten Xixia Luo für exzellente Fisch Tierhaltung und technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschüsse R21EY019401 (RT) und P30EY04068 (RT) finanziert, und Start-up-Fonds auf RT, darunter eine nicht zweckgebundene Zuwendung von der Forschung bis zur Blindheit Wayne State University, Department of Ophthalmology verhindern. JT wurde von einem Thomas C. Rumble Fellowship von der Wayne State University Graduate School vorgesehen ist.

Alle Vorgänge in diesem Protokoll beschrieben wurden durch die Verwendung von Tieren Ausschuss an der Wayne State University School of Medicine genehmigt. 1. Dunkle Anpassung <ol><li> Übertragen ~ 10 erwachsene Albino oder pigmentierte Fisch aus dem normalen Gehäuse-System in einen dunklen Schrank. Wenn vorhanden, mit einem dunklen Gehäuse, in das Gehäuse Zebrafisch-Modul, das für die normale Wassermenge durch den Tank ermöglicht gebaut wird. (Wenn ein solches System nicht verfügbar ist, legen Sie das Aquarium in einem völlig dunklen Gehäuse, achten Sie darauf, die Fische mit Sauerstoff belüften). </li><li> Halten Sie den Fisch in der Dunkelheit für 10 Tage. Bei der Fütterung der Tiere oder das Hinzufügen neuer Fisch an den dunklen Kasten, vergewissern Sie sich so schnell wie möglich zu bewegen, um zu vermeiden, dass die Fische mit einem langen Zeitraum des Lichts. </li></ol> 2. UV-Licht Exposition <ol><li> Sicherstellen, dass die Stromversorgung der UV-Quelle ist AUS. Entfernen Sie das UV-Licht fluoreszierenden Filament aus Stereomikroskop. <ol><li> Verwenden Sie einen umgekehrten15 cm Durchmesser Glas Petrischale (oder etwas von einem ähnlichen 2 cm Höhe) als Ständer für die UV-Filament. Kleben Sie die Petrischale auf dem Labortisch. </li><li> Kleben Sie die UV-Licht Filament des umgekehrten Petrischale oben. So anzuordnen, dass ca. 2 mm von dem Ende des Filaments Überhänge die Petrischale. </li></ol></li><li> Besorgen Sie sich einen 250 ml Becherglas. Titelbild ½ der Boden, Seiten und Rückseite des Bechers mit Alufolie, so dass das &quot;glänzende&quot; Seite der Folie steht das Innere des Bechers. Wenn der Becher ist abgestuft, decken Sie den Wortlaut Hälfte des Bechers mit Folie, so dass die klare Hälfte des Bechers ausgesetzt. </li><li> Füllen Sie den 250-ml-Becherglas mit 100 ml Wasser aus dem Fisch Facility Systeme. </li><li> Legen Sie die 250 ml Becherglas in einem 4 L Becherglas. Füllen Sie den 4 L Becherglas mit Wasser, bis der Wasserstand sogar mit dem 100 ml Wasser-Linie in der 250 ml-Becher ist. </li><li> In maximal 10 dunkel-behandelten Tieren der 250-ml-Becherglas. Bedecken Sie den 250-ml-Becherglas mit einem kleinen Stück aus Aluminiumvereiteln. </li><li> Platzieren Sie den ganzen Becher Apparat unmittelbar neben dem UV-Filament. Der Faden soll an die Außenseite des 4 L-Becherglas gegeben und mit Blick auf den freiliegenden Teil der 250-ml-Becherglas. Stellen Sie sicher, dass die 250-ml-Becherglas in den Boden des 4 L Becherglas zentriert ist. </li><li> Positionieren Sie einen großen, undurchsichtigen Schirm hinter dem 4L Becherglas, so dass für die Tiere ausgesetzt werden, sondern die Verhinderung jeglicher Laborpersonal vom Sehen der Spitze des UV Filament. WARNUNG: Stellen Sie sicher, dass diese Barriere ist, bevor Sie das Gerät einschalten, um die UV-Quelle. </li><li> Schalten Sie die UV-Stromquelle. Set Timer für 30 min. Platzieren, was notwendig Warnschilder um sicherzustellen, dass ahnungslose Laborpersonal nicht versehentlich setzen sich gegen UV-Strahlung. </li><li> Nach 30 min, Absperren der UV Stromquelle. Nehmen Sie die 250 ml-Becher mit dem Fisch. Hinweis: Wenn mehrere Runden von UV-Belichtung, die erforderlich sind, lassen Sie die Stromquelle abkühlen (~ 20 min) vor der Wiederholung der Exposition Protokoll. Achten Sie darauf, t ersetzener 100 ml Wasser mit frischem Wasser-System für jede Aufnahme. Das Wasser im 4 L Becherglas nicht ersetzt werden müssen. </li></ol> 3. Halogen Lamp Light Exposure <ol><li> Übertragen Sie die Fische aus 250 ml Becherglas in einem 1,8 L klaren Acryl-Aquarium. Füllen Sie den Tank bis zum Überlauf Marke. </li><li> Richten Sie das Licht einer Halogenlampe Behandlungsbereich. Erhalten vier 250 W Halogen-Lampen-Dienstprogramm von einem lokalen Baumarkt. Mit Blick auf zwei Lampen in der gleichen Richtung, ordnen 29 cm auseinander auf Mitte. Ordnen Sie die anderen zwei Lampen in einer ähnlichen Weise. <ol><li> Platzieren des zweiten Satzes von Lampen, so dass sie gegenüber dem ersten Satz von Lampen, wobei ~ 73 cm zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Dies erzeugt eine Rechteck-Form-Licht Behandlung Fläche von 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Besorgen Sie sich einen kleinen Ventilator von einem lokalen Baumarkt. Platzieren Sie den Lüfter genau zwischen den beiden Gruppen von Lampen, etwas außerhalb des Licht-Behandlung Bereich. </li><li> Legen Sie zwei 1,8 L Behälter voll Wasser in der Mitte desLicht Behandlungsbereich, genau zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Der Abstand zwischen den Lampen und der Außenwand des Behälters sollte ~ 29 cm betragen. Hinweis: Selbst wenn nur die Behandlung von 10 Fische in einem 1,8 l-Tank, verwenden diese Anordnung. Beide Behälter sind erforderlich, um die Temperatur des Wassers von jedem Behälter in dem geeigneten Bereich zu halten. </li><li> Legen Sie ein Sauerstoff-Luftsprudler in jedem Tank. </li><li> Cover jede Tank mit klarem Acryl Deckel, so dass ein ~ 2 cm Lücke am Ende in der Nähe des Lüfters. Ordnen Sie den Lüfter so, dass es Luft in diesen Spalt blasen wird. Setzen Sie ein Thermometer in einem oder beiden der Tanks. </li><li> Schalten Sie das Gerät auf die Lichter, Lüfter-und Belüfter. Pflegen Licht-Behandlung für bis zu 4 Tage. Der Fisch sollte nicht während der Licht-Behandlung zugeführt werden, da dies die Wasserqualität und führen zu mehr Stress für die Tiere zu beeinträchtigen. </li><li> Überwachen Temperatur und Wasserstand auf einer täglichen Basis. Pflegen Sie die Temperatur bei 30-33 ° C. Wenn nötig, stellen Sie die Lüftergeschwindigkeit und / oder den Abstand zwischen den Tanks und der lights. <ol><li> Krönung jeder Tank mit Wasser-System nach Bedarf, in der Regel täglich. </li><li> Verwenden Sie immer gesunden erwachsenen Zebrafisch (in der Regel 6-9 Monate alt), um eine Überlebensrate von nahezu 100% zu halten. Allerdings, wenn ein Fisch tot im Becken gefunden, entfernen Sie es sofort, und ersetzen Sie das Wasser im gesamten Tank. </li></ol></li></ol> 4. Gewebeentnahme <ol><li> 48 Stunden nach Beginn der Behandlung zu entfernen Halogenlicht die Fische aus dem Behandlungsbereich. <ol><li> Bereiten Sie frischen ethanolischen Formaldehyd Fixativ (1 Teil 37% Formaldehyd, 9 Teilen 100% Ethanol). </li><li> Euthanize Zebrafisch mit einem Anästhetikum Überdosierung von 2-Phenoxyethanol (0,4 mg / L). </li><li> Übertragen Sie die eingeschläfert Zebrafisch zu einem Papiertuch. Enucleate das Auge mit einer gebogenen Pinzette. </li><li> Zeigen entkernte Augen in Fixiermittel und Speicher O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect die Augen. <ol><li> Waschen der Augen in 5% Saccharose 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur gerührt, dann mit ersetzenfrische 5% Saccharose 1x PBS für 2 Stunden. Anschließend waschen Sie die Augen in 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C. Waschen der Augen in einem 1:1 (gleiche Teile) des Gewebes Einfriermedium und 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Integrieren Sie die Augen in 100% Gewebe Einfrieren Medium und bei -80 ° C Orient die Augen, so daß Kryoschneiden des Gewebes auf der dorsal / ventral Achse. </li><li> Kryoschnitt das Gewebe und auf Glasplatten. Warm Folien für 2 Stunden bei 55 ° C. Shop Objektträger bei -80 ° C oder sofort ausführen Standard Immunhistochemie. </li><li> Führen Standard Immunhistochemie auf geschnittene Gewebe und Bild mit Fluoreszenzmikroskopie 40,51. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier zeigen wir, dass die Kombination eine kurze UV-Bestrahlung mit einer kontinuierlichen helles Licht Exposition Ergebnisse in weit verbreiteten Photorezeptor Verlust und eine robuste Regeneration Antwort. Verglichen mit den einzelnen LIRD Methoden ist dies kombiniert Verfahren auch die effektivste Protokoll sowohl Stäbchen und Zapfen in beiden Hälften der Netzhaut beschädigen. Wichtig ist, dass diese Behandlung wirksam bei pigmentierten Tieren sowie Albinos. Obwohl wir den Bew...

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV light source</td>
			<td style="width:215px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">EL600</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS3160152BO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS1000250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 L glass beaker</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td>
			<td>CLS10004L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-105</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 W halogen lamps</td>
			<td>Workforce</td>
			<td>265-669</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tanks</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.8 L clear acrylic tank lids</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT180LCL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fan</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>HT-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aerator</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>77853-900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermometer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>YO-08008-58</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent forceps (5/45)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

Die bisher beschriebenen Licht-Behandlung Protokoll wurde zu jedem einzelnen Verfahren LIRD verglichen. In dunkel-behandelten erwachsenen Albinos (Abbildungen 3-5), führte die einzelnen Licht-Behandlungen in signifikanten Verlust der Stange (Abbildung 3) und Kegel (Abbildung 4) Photorezeptoren. Doch sowohl die einzelnen Behandlungen in erster Linie Photorezeptoren in der dorsalen Hälfte der Netzhaut beschädigt, so dass der ventralen Retina relativ von den Li...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish at JoVE.com

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

a-novel-light-damage-paradigm-for-use-retinal-regeneration-studies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Aufrufe.  Wayne State University School of Medicine.  Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut. 

Serie: A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Konstruktion und Montage eines Ultra-light Motorisierte Microdrive für chronische Neural Recordings in Kleintiere

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Aufnahme und Analyse der zirkadianen Rhythmen in Laufen-Rad-Aktivität in Nagetiere

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding diseases, and future therapies hinge on fundamental understandings about how different retinal cells function normally. Gaining such information with biochemical methods has proven difficult because contributions of particular cell types are diminished in the retinal cell milieu. Live retinal imaging can provide a view of numerous biological processes on a subcellular level, thanks to a growing number of genetically encoded fluorescent biosensors. However, this technique has thus far been limited to tadpoles and zebrafish larvae, the outermost retinal layers of isolated retinas, or lower resolution imaging of retinas in live animals. Here we present a method for generating live ex vivo retinal slices from adult zebrafish for live imaging via confocal microscopy. This preparation yields transverse slices with all retinal layers and most cell types visible for performing confocal imaging experiments using perfusion. Transgenic zebrafish expressing fluorescent proteins or biosensors in specific retinal cell types or organelles are used to extract single-cell information from an intact retina. Additionally, retinal slices can be loaded with fluorescent indicator dyes, adding to the method&#39;s versatility. This protocol was developed for imaging Ca2+ within zebrafish cone photoreceptors, but with proper markers it could be adapted to measure Ca2+ or metabolites in M&#252;ller cells, bipolar and horizontal cells, microglia, amacrine cells, or retinal ganglion cells. The retinal pigment epithelium is removed from slices so this method is not suitable for studying that cell type. With practice, it is possible to generate serial slices from one animal for multiple experiments. This adaptable technique provides a powerful tool for answering many questions about retinal cell biology, Ca2+, and energy homeostasis.

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Imaging retinal tissue can provide single-cell information that cannot be gathered from traditional biochemical methods. This protocol describes preparation of retinal slices from zebrafish for confocal imaging. Fluorescent genetically encoded sensors or indicator dyes allow visualization of numerous biological processes in distinct retinal cell types.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Eine neuartige In-vitro- Modell von traumatischen Hirnverletzungen Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...