Name: fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues
Uploaded: 2014-02-24T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues at JoVE.com

Ghanim laboratuarda araştırma hiçbir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Alman-İsrail Vakfı (GIF) dan 908-42.12/2006, hiçbir hibe. IS-4062-07 Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (Bard), ve araştırma hibe hayır dan. MG İsrail Bilim Vakfı (ISF) için 884/07

1.. FISH Analizi Genel Sinek, Bitki ve Virüs Hazırlıklar <ol><li> Arka B ve Q biyotipindeki pamuk fidelerinin (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) üzerinde sinekler ve 25 ± 2 ° C,% 60 bağıl nem standart koşullar altında böcek geçirmez kafesleri ve büyüme odaların içinde korumak, ve 14 saat ışık / 10 saat karanlık fotoperiyot. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 15-19 endosymbiont-özgü primerler kullanılarak endosimbiyont ile enfeksiyonu test etmek için PCR yapın. </li><li> Ticari bir kreş veya bitki domates tohumları Domates fideleri (Solanum esculentum cv. Beefsteak) satın alın. </li><li> Bitkiler TYLCV 15 beyazsineği-aracılı aşılama için en uygun yaş (bölüm 4.1 &#39;e bakınız), dört gerçek yaprak aşamasına gelinceye kadar, yukarıda açıklanan aynı yetiştirme koşullarında koruyun. </li></ol> 2. Endo için böcek Taşıma, Fixation, Probe Tasarım, Hibritleşme ve Görselleştirmesymbiont BALIK <ol><li> Pamuk bitkilerinden aspirasyonu ile 10 yetişkin sinekleri toplayın, ya da pamuk yaprakları 10 3 üncü veya 4. evre perileri almak. </li><li> Hemen Eppendorf tüpleri içine Carnoy fiksatif (kloroform-etanol buzlu asetik asit, 06:03:01, hac / hac) içinde bırakın. (Tercihen bir gece) gece 2 saat için düzelt. </li><li> Tamamen fiksatif çıkarın ve 2 saat boyunca, etanol içinde% 6 H 2 O 2&#39;de renginin. </li><li> Oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde örnekleri korumak, veya bir sonraki adıma geçin. </li><li> Design probları, her bir bakterinin, 16S ribozomal RNA genlerinin göre tamamlayıcı DNA, ters primerler. Sondalar tasarımı için, hesaba PCR primerleri tasarımı için aynı düşünceler almak. Oligonükleotid probları kullanarak BTP1 5&#39;-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, 5&#39;-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, 5&#39;-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &#39;ve 5&#39;-Cy3 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &#39;sırasıyla Portiera, Rickettsia, Hamilonella ve Arsenophonus, spesifik hedefleme için. </li><li> , Ml başına hibridizasyon tamponu içinde karanlıkta gece boyunca melezleşme numuneleri (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.9 M NaCl,% 0.01 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat,% 30 [hacim / hacim] formamid) 10 pmol içeren floresan probe . Gerektiğinde farklı floresan boyalar ile birden fazla probun birleştirin. Hedeflenen bakteri ve hiçbir prob örneklerinin negatif kontroller ile enfekte olmayan whiteflies kullanın. </li><li> Bir sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde, bir mikroskop lamı üzerine, bütün numunelerin bir kapak monte kayma ile kapak, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile sağlanır. </li></ol> 3. Beyazsineği Organ Diseksiyon, Fixation, Hibritleşme ve TYLCV FISH için Görselleştirme <ol><li> Sürekli aspirasyon ve ane tarafından TYLCV enfekte domates bitkileri yetiştirilen yetişkin sinekleri toplayınaseton ile emprenye kağıt havlu maruz bırakılarak sthetize. Aseton çok uzun pozlama whiteflies dokuları çözebilirsiniz gibi sadece 1-2 dakika whiteflies Açığa. Ibridazyonunu onaylamak için enfekte olmayan domates bitkileri ve denetimler için hiçbir prob örnekler üzerinde yetiştirilen nonviruliferous whiteflies kullanın. </li><li> Depresyon mikroskop Mount whiteflies stereo mikroskop kullanarak organı diseksiyon için kayar. </li><li> Prothorax gelen böcek başını çekmeye ve 1x PBS içinde tükürük bezlerini incelemek nedeniyle küçük boyutu, daha iyi görüntülenmesi için% 1 toluidin mavisi boyası ile desteklenmiş. 2-3 dakika boyunca, lekenin emme izin verir. </li><li> Göğüs ve gözlemlemek ve midgut dışarı çıkarmak için karın arasındaki noktada ayrı böcek çekin. Karın ucunda forseps ile iterek karın içeriğini kovun. </li><li> Yavaşça başarılı kesitlerden PBS ve toluidin mavisi çıkarın ve yavaşça 5 dakika boyunca organlarını düzeltmek için Carnoy fiksatifi 300 ul ekleyin. </li><li> Akesilen organlarda kontrolsüz hareketini önlemek üzere depresif kuyunun bir taraftan olup üstten fiksatif dd. Bir kez fiksatif dokunmadan, organları cama yapışacak ve süreç boyunca onlar hareket etmez. </li><li> Fiksatif çıkarın ve TYLCV kat protein geninde bir diziye tamamlayıcı olan floresan DNA probu Cy5-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;, 10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul ekleyin. </li><li> Altındaki ıslak havlu kağıt ile birlikte küçük bir plastik kutu içinde oluşan küçük bir nemli odası içinde örnek ile inkübe edilmesi slayt ile karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca hibridize olur. </li><li> Hibridizasyon sonra, ince bir diseksiyon aleti ile organları almak ve hızla DAPI (1 x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile içerdiği yeni hibridizasyon tamponu 30 ul ihtiva eden taze bir mikroskop lamı taşıyın. </li><li> Bir kapak kayma örnekleri örtün, zekâ mühürBir floresan veya konfokal mikroskop altında h oje ve görünümü. </li></ol> 4. Bitki Taşıma, TYLCV FISH için El-kesit, Fiksasyon ve Hibritleşme <ol><li> Virüliferöz beyaz sinek aracılı aşılama kullanılarak TYLCV olan domates fideleri inoküle. Virüs symptomless bitkilerde bu FISH yöntemi aşılamadan bir hafta sonra kullanılarak tespit edilebilir. Tipik hastalık belirtileri görülebilir üç hafta sonrası aşılama vardır. Belirli bir hibridizasyon teyit etmek için kontrol enfekte olmamış domates bitkileri ve prob örnekleri kullanın. </li><li> Domates el kesme 2-4 cm uzun boyuna veya enine kesitler hazırlamak için keskin bir histolojik jilet kullanın sapları ve yaprakları. </li><li> Eppendorf tüpleri içinde, 2 saat için oda sıcaklığında gece boyunca Carnoy sabitleyici olarak bölümleri düzeltin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde muhafaza bölümleri, ya da bir sonraki adıma geçin. </li><li> Bölümleri yıkayınHibridizasyon tamponu ile üç kez, her biri 1 dakika. </li><li> TYLCV kılıf proteini genine bir diziye tamamlayıcı olan oligonükleotid prob, floresan Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul bölümleri hibridize. </li><li> Melezleme tamponu, bölümleri üç kez, her biri 1 dakika yıkayın. </li><li> DAPI (1x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde bütün montaj bölümleri, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile mühür, bir lamel ile kapsamaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Czosnek, H., Laterrot, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+worldwide+survey+of+Tomato+yellow+leaf+curl+viruses.">A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses.</a> Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).</li><li>Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Tomato+Yellow+Leaf+Curl+Virus+in+South+Carolina.">First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina.</a> Plant Dis. 90, 379 (2006).</li><li>Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+Florida+and+implications+for+the+spread+of+this+and+other+geminiviruses+of+tomato.">Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato.</a> Plant Dis. 83, 984-988 (1999).</li><li>Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+North+Carolina.">Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina.</a> Plant Dis. 86, 73 (2002).</li><li>Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogeographical+analysis+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex+based+on+mitochondrial+DNA+markers.">A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers.</a> Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+translocation+in+the+circulative+transmission+pathway+of+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Phytopathology. 91, 188-196 (2001).</li><li>Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive++salivary+and+reproductive+organs+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+Hemiptera:+Aleyrodidae)+B+type.">Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type.</a> J. Morphol. 248, 22-40 (2001).</li><li>Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+geminiviruses+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci+(Homoptera:+Aleyrodidae).">Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae).</a> Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).</li><li>Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pathway+of+geminivirus+in+whitefly+extracts,+saliva,+hemolymph+and+honeydew.">Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew.</a> Phytopathology. 89, 239-246 (1999).</li><li>Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulative+pathway+of+begomoviruses+in+the+whitefly+vector+Bemisia+tabaci&#8212;insights+from+studies+with+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci&#8212;insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus.</a> Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virusby+the+whitefly+Bemisiatabaciis+correlated+with+the+presence+of+aspecificsymbiotic+bacterium+species.">The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species.</a> J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).</li><li>Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+Rickettsia+spp.+and+organ-specific+infection+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).</li><li>Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).</li><li>Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+and+inexpensive+method+for+localization+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+and+Potato+leafroll+virus+in+plant+and+insect+vectors.">A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors.</a> J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).</li><li>Nirgianaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).</li><li>Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+bacteriocyte-associated+endosymbionts+of+plant+sap-sucking+insects.">Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects.</a> Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+(Homoptera)+Aleyrodidae).">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae).</a> App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).</li><li>Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Wolbachia+infection+in+Bemisia+tabaci.">Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).</li><li>Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+localization+of+bacterial+symbionts+in+three+whitefly+species+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+from+the+east+coast+of+the+Adriatic.">Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic.</a> Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Aynı zamanda bitki ve böcek ev sahibi vektör bir bitki virüsünün lokalizasyonu ve onların özel sineği konukçuda endosimbiyotik bakteriler için burada açıklanan protokol, bitki ve hatta hayvan dokularında diğer virüslerin lokalizasyonu için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol endosimbiyotik ve patojenik bakteri ve bitki ve hayvan sistemlerinin diğer mikroorganizmaları lokalize etmek için de kullanılabilir. Tarif edilen yöntemler, kısa, flüoresan-işaretli oligonükleotid DNA prob ve hücredeki hedef DNA ya da RNA molekülü arasındaki hibridizasyonun basit kavramına dayanmaktadır. Sonuç en az bir arka plan ile, belirli bir melezleştirme, ve floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak tespit bir sinyaldir. Birden fazla geni hedef farklı floresan boyalar ile çeşitli problar, aynı anda kullanılabilir. Bu, tek bir hücre ya da doku içinde birden fazla hedef görselleştirme sağlar. Bu protokollerin açıklanan işlemleri basit ve örnek işleme zaman vardıraz. Bu tür yüksek bir zemin sinyali, numuneler için uzun işlem süresi ve analizi için çok sayıda ve yüksek maliyetli malzemelerin kullanılması gibi başka protokolleri ile ilgili problemler, burada anlatılan protokolde, kısıtlamaları değildir. B. B ve Q biyotipleri koşulları kendi ana tesisi ile, herhangi bir sineği biyotipinin için geçerli yetiştirme, ancak; tabaci whiteflies bu yazının protokolleri tanımlamak için kullanılmıştır. Beyaz sinek, belirtilen koşullar altında, üç hafta içinde yaşam döngüsü tamamlanır. Kullanılan B biyotipindeki nüfusun her birey birincil endosymbiont Portiera ile enfekte edilmiş ve ikincil endosimbiyotik bakteri Hamiltonella ve Rickettsia. Q biyotipindeki bireyler Portiera ve Arsenophonus ile enfekte edildi. Dünyada Diğer sineği popülasyonları bu ya ile enfekte olduğu gösterilmiştir Diğer endosimbiyotik bakteri türleri ve farklı uzamsal localizati ilevücut 16-20 desenleri üzerinde. TYLCV enfekte bitkiler tipik hastalık semptomlarının aşılamadan aşağıdaki üç hafta gösterir. TYLCV lokalizasyonu için semptomatik bitkiler, 24 saat için ak sinekler yolu ile virüs satın alınması için kullanılabilir ve virüs, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak FISH enfekte olmuş bitkilerde ve böceklerde tespit edilebilir. Böcek kullanılan sondalar bitkilerde Cy3 en uygun olan ve kloroplast, bitki hücresinde en bol organel olarak benzer dalga boyunda floresan değildir, Cy3 ve Cy5 dahil olmak üzere farklı dalga boyları ile kesilip birçok florofor ile konjuge edilebilir iken. Bakteri ve bitki ve böcek virüsleri lokalizasyonu için tarif edilen protokollere başarılı bir şekilde uygulanması daha iyi bir görünüm ve prob penetrasyon, özgüllük için iyi bir prob için tasarım ve bütün böceklerin halinde 2 O 2 H ile temizlenmesi için örneklerin iyi tespit bağlıdır better sinyal görselleştirme. Bitkilerde FISH durumunda, el yapımı bölümler iyi nüfuz sondası ve sinyalin daha iyi görüntülenmesi için mümkün olduğu kadar az olmasının sağlanması gerekir. Bu kesim yardımcı olması için iki strafor parçaları arasındaki yaprak koyarak ve çeşitli satıcılardan bu amaç için satın alınabilir profesyonel jilet kullanarak geliştirilebilir. Protokol ancak bu prob biçimi hücre-altı lokalizasyonu için uygun bir yöntem olarak, burada tarif kullanılarak geliştirilebilir potansiyeline sahip, hedef hücre içi lokalizasyonu için uygun değildir. Örneğin, burada tarif edilen kısa problar gibi biotin ve sırayla TEM ile görselleştirilebilir streptavidin konjüge edilmiş altın parçacıkları ile hedeflenebilir floresan olmayan moleküller gibi moleküller konjuge edilebilir. Bu daha sonra değişiklik gen transkript ve mikroorganizmalar dahil olmak üzere çeşitli hedeflerin hücre içi lokalizasyonu için uygun olabilir. Son olarak, tarif edilen protokols, DNA ve RNA değil, proteinler gibi nükleik asitlerle hibridizasyona için uygundur. Burada anlatılan protokollerin FISH en iyi sonuçları elde etmek için, taze böcek ve bitki malzemesi, hem de taze sabitleyici ve melezleştirme tamponları kullanmak en iyisidir. Problar, her zaman tekrar dondurma ve buz çözme önlemek için küçük parçalar halinde -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. Her açıklanan adımın işlem süresi okudu organizmalar bağlı olarak kalibre edilebilir. Protokolde belirtildiği gibi, sabitleme ve renk açma sonra, beyaz sinek ve bitki numunesi, oda sıcaklığında mutlak etanol içinde uzun bir süre için muhafaza edilebilir. Başka bir yerden oluşu örnekleri gönderirken, veya uzun zaman süreci deneyler Bu adım özellikle yararlıdır. Hibridizasyon sinyalinin kalitesi, bu uzun bir süre muhafaza aşağıdaki etkilenmedi.

Onların hastalıklı bitki barındıran bitki virüs ve diğer patojenleri arasındaki etkileşimleri inceleyerek, bu onların bilgisayarlar üzerinde olumsuz etkilere neden bakılmaksızın, in situ patojenleri ve kendi nükleik asitleri görselleştirmek için önemlidir. Bitki hücreleri içinde ve arasında patojen hareketini incelemek bu çok önemlidir. Patojenin gen ürünlerinin yerinde Yerleştirmede patojenite sürecini incelemek için diğer yaklaşımları tamamlamaktadır önemli bir adımdır. Birçok bitki patojenleri, özellikle virüsler, kendi vektörleri ile karmaşık ve samimi etkileşimleri olan, böcekler tarafından iletilir. Kendi vektörlerde bu virüslerin lokalizasyonu iletim yolunu incelemek için önemlidir ve vektör içinde olası etkileşim siteleri. Bazı böcek-vectored bitki virüsleri iletim bu böceklerin içinde ikamet endosimbiyotik bakteriler tarafından destekli. Iyi bu bitki virüsleri b iletim incelemek içinbunların vektörleri, genel olarak endosimbiyotik bakteriler görsel ve özellikle virüs aktarımı dahil olanlar, için de gereklidir y. Virüs ve endosimbiyotik bakteriler yardımcı sınırlama böylece böcek ev sahibi olan bu organizmalar arasındaki olası ilişkileri araştırmak için arzu edilir. Kenara virüs iletim, endosimbiyotik bakteri böcek vektörlerin biyolojinin çeşitli yönlerini etkileyen, böceklere olan bu bakterilerin, böylece mekansal lokalizasyonu yüksek ilgi ve önem taşımaktadır. Domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV) (Begomovirüs, Geminiviridae), tüm dünyada yetiştirilen 1-4 domates en önemli viral bir hastalıktır karmaşıktır. TYLCV floem sınırlı bir virüs olduğunu ve sadece beyaz sinek Bemisia tabaci 5,6 ile vectored edilir. Onların beyaz sinek vektörlerinde begomovirüslerinden translokasyon açıklayan bir model 6-9 önerilmiştir. İki özel bariyerler aktif dur kesilmişlerdirmidgut / hemolenfi ve hemolenfi / tükürük bezi bariyerler: Bu circulative iletimini ing. Bu iletim işlemi virüs kapsidine kabul bilinmeyen alıcıları tarafından aracılık ettiği varsayılmaktadır. TYLCV B. çapraz düşünülmektedir Bu bitki içine enjekte edilmeden önce orta bağırsak tabaci 6,10 ve birincil salya bezi 6 boyunca emilir. Beyaz sinek hemolimf ise, TYLCV böcek ikinci endosimbiyotik Hamiltonella bakteri tarafından üretilen bir proteinin GroEL ile etkileşime girer. Bu etkileşim hemolimfteki TYLCV güvenli taşıma sağlayan ve böcek bağışıklık sistemi 11. Hamiltonella ve Portiera birincil endosymbiont tarafından saldırılara karşı korur beyaz sinek, bacteriocytes yerleştirilmiştir, hemolenfi ve ev endosimbiyotik bakteriler 11. B. bulunan böcek hücreleri tabaci Rickettsia&#39;lara, Arsenophonus, Wolbachia ve Fritsch gibi ek endosimbiyotik bakteri barındırırbacteriocytes içinde veya dışında lokalize edilebilir ve adet, böceğin biyolojisi 12 farklı etkileri vardır. Çeşitli raporlar mikroskobik kalın bölümünde 10,13 üzerinde yerinde böyle Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), antikorlar ve RNA gibi zaman alıcı ve masraflı protokolleri kullanarak bitki ve limonluk içinde TYLCV yerelleştirme çalışması için çalıştılar, yeni bir çalışma lokalizasyonu tarif basit bir protokol 14 ile kendi tesis ve vektör konak içindeki bitki virüsleri. Burada B. TYLCV lokalizasyonu için basit bir protokol açıklar tabaci midguts ve tükürük bezleri disseke ve bölümlerde TYLCV-enfekte bitkilerden hazırladı. Biz daha Portiera, B. birincil endosymbiont lokalizasyonunu tarif tabaci ve ikincil endosimbiyontlar Hamitonella, Rickettsia ve Arsenophonus. Bu protokol, kısa DNA sondaları kullanılarak dayalı olduğunufloresan, 5 &#39;ucunda etiketlenmiştir ve özellikle viral ya da bakteriyel gen dizilerinde tamamlayıcı dizilere hibridize edilir. Numune işleme nispeten kolaydır ve elde edilen sinyal çok özeldir. Açıklanan protokol, bunların bitki, hayvan ve böcek ana virüs, bakteri ve diğer patojenleri lokalize etmek için kullanılabilir ve ayrıca herhangi bir dokuda mRNA lokalize etmek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Fluorescently labeled&amp;nbsp; Probes</td><td>Metabion</td><td>20 bp HPLC purified</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues

In situ hibridizasyon (FISH) floresan yaygın ökaryotik hücrelerde gen transkript görselleştirme ve bundan başka, virüs ve bakteri enfeksiyonu gibi hücreye diğer bileşenleri görselleştirmek için modifiye edilebilir için kullanılan çeşitli teknikler verilen bir isimdir. Mekansal yerelleştirme ve enfeksiyon sırasında virüs ve bakterilerin görselleştirme farklı uyaranlara tepki olarak böyle mikroarray&#39;ler ve RNAseq olarak ifade profilleme deneyler tamamlayan önemli bir adımdır. Bu maddelerle zamanmekansal enfeksiyonları anlama hücresel bileşenler ile etkileşimi anlamaya yönelik biyolojik deneyler tamamlar. Bu tür raportör gen sistemleri veya immünohistokimyasal yöntemler gibi virüs ve bakterileri görselleştirmek için çeşitli teknikler zaman alıcıdır ve bazı model organizmalar ile çalışmak ve karmaşık yöntemler dahil sınırlıdır. Hücreye RNA ya da DNA türleri hedef FISH nispeten kolay ve hızlı bir benimgenlerin zamanmekansal lokalizasyonu eğitim ve tanı amaçlı ThOD. Bu yöntem sağlam ve protokolleri pahalı değil kısa hibritlenmesini, ticari olarak satın sondalar, istihdam zaman uygulanması nispeten kolay olabilir. Örnek hazırlama, tespit, melezleme ve mikroskopik görüntüleme karmaşık adımlar içermeyen bu özellikle sağlamdır. Burada böcek ve bitki dokularında bakteri ve virüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu yöntem, 5 &#39;ya da 3&#39; floresan boyalar konjüge kısa DNA probları uçları 20 baz çifti ile basit bir hazırlama, tespit ve böcek bütün bağlar ve kesilen organlarda veya el yapımı bitki bölümlerinin hibridizasyona dayanır. Bu protokol, başarılı bir şekilde böcek ve bitki dokularının, bir dizi tatbik edilmiştir ve hücrede mRNA veya başka RNA veya DNA türleri ifadesini analiz etmek için kullanılabilir.

Bu yazıda incelenen sistem Şekil 1 &#39;de gösterilen ve TYLCV ile enfekte olmuş bir bitki, bir yetişkin beyaz sinek ve B&#39;nin bir peri içerir tabaci ve böcek TYLCV translokasyon için yol gösteren beyaz sinek iç anatomisi. 2. birincil simbiyonudur Portiera ve ikincil simbiyonudur için bir yetişkin beyaz sineğe çift BALIK göstermektedir Arsenophonus. Şekil 3. Portiera ve Hamiltonella için çift BALIK gösterir ve Şekil 4 Portiera ve Rickettsia&#39;lara, B. Her iki figür çift FISH gösterir tabaci 4. evre perisi. 5. Bir sineği disseke midgut TYLCV ve DAPI boyama için FISH gösterir ve Şekil 6 disseke sineği birincil tükürük bezlerinde TYLCV ve DAPI boyama için bir BALIK göstermektedir. 7. TYLCV ve DAPI boyama için FISH göstermektedirel-cut TYLCV enfekte bitki bölümleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig1.jpg" /> Şekil 1. Bu yazıda incelenen sistemin genel bakış Domates sarı yaprak kıvırcık virüsün (TYLCV). B) ile enfeksiyonun neden. A) Tipik hastalık belirtileri bir yetişkin beyaz sineğe 4. nimf aşamasında. C) Dış görünümü dış görünümü beyaz sinek gelişim yaşam döngüsünde. Diğer nimf aşamalar genel dış görünüşü benzer ancak daha küçük boyutta bulunmaktadır. D) Bir yetişkin B&#39;nin iç anatomisinin şematik görünümü tabaci bitki elek elemanları, dolaşım ve iletim (siyah oklar) TYLCV edinme yolunu gösteren. Kırmızı parçacıklar TYLCV viryonlara bakın. p: floem; s: s<html> tylet; E: özofagus; fc: filtre haznesi; dm: azalan ortabağırsak; Cinsiyetim:,: çekumlar; hg: ca midgut artan hindgut; bc: bacteriocytes; PSG:. birincil tükürük bezi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig2.jpg" /> Şekil 2. B. Portiera ve Arsenphonus Çift BALIK tabaci Q biyotip yetişkin (A) ve işaretlenmiş bölgede (B) parlak alan bir kanal altında. Portiera spesifik prob (kırmızı) ve Cy5 Arsenphonus spesifik sonda (konjüge her sonda tarafından yayılan flüoresans sinyallerini tespit birleşik optik bölümleri, iki yakınlaştırmak Cy3 konjüge edilmiş) sarı kullanılmıştır. e: Yumurta.pg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig3.jpg" /> Şekil 3. B. Portiera ve Hamiltonella Çift BALIK Cy5 ve Cy3 konjüge Hamiltonella spesifik sonda (yeşil) konjuge tabaci nimf. Portiera spesifik prob (kırmızı) kullanılmıştır. A) Hamiltonella hibridizasyon sinyali kombine optik kesit elde edilmiş ve. oda karanlık alan altında izlendi) &#39;dan elde Portiera hibridizasyon sinyali optik bölümleri birleştirilmiş ve karanlık alan altında izlendi. C) Portiera ve Hamiltonella parlak alanının altındaki sinyalleri birleşti. D) Portiera ve Hamiltonella Kombine sinyaller dekar altında inceledirk alan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig4.jpg" /> Şekil 4. B. Portiera ve Rickettsia&#39;nin Çift BALIK Cy5 ve Rickettsia spesifik sonda Cy3 konjüge edilmiş (mavi) konjuge tabaci nimf. Portiera spesifik prob (kırmızı) kullanılmıştır. A) bir araya getirilmiş optik kesit elde edilmiş ve koyu alan altında izlendi Rickettsia hibridizasyon sinyali. B&#39;den elde edilmiş) Portiera hibridizasyon sinyali Aydınlık alan altında optik bölümleri birleştirildi ve karanlık alan altında izlendi. C) Portiera ve Rickettsia kombine sinyaller. D) <eKaranlık alan altında m&gt; Portiera ve Rickettsia Kombine sinyaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig5.jpg" /> Bir yetişkin B. disseke ortabağırsak üzerine TYLCV Şekil 5. BALIK Cy3 konjüge edilmiş bir enfekte olmuş domates bitki. TYLCV-özgü prob (kırmızı) ile 48 saat boyunca bu virüsü elde ettiği tabaci kadın kullanıldı ve midgut birleşik görüldüğü gibi kesilmiş midgut montaj ve görselleştirme. A) önce DAPI ile boyanmıştır Aydınlık alan altında optik bölümleri. B) TYLCV BALIK sinyali (kırmızı) ve DAPI lekeli çekirdekleri koyu alanın altındaki kombine optik bölümlerde görüldüğü gibi (mavi). fc: filtre haznesi; dm: descendi<html> ng ortabağırsak; duyuyorum: artan ortabağırsak; ca: çekumlar; hg: hindgut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig6.jpg" /> Bir yetişkin B. disseke birincil tükürük bezi üzerine TYLCV Şekil 6.. BALIK Cy3 konjüge edilmiş bir enfekte olmuş domates bitki. TYLCV-özgü prob (kırmızı) ile 48 saat boyunca bu virüsü elde ettiği tabaci dişi kullanıldı ve montaj ve görselleştirme. A) kesilir ve DAPI lekeli birincil salya önce DAPI ile boyanmış tükürük bezi Aydınlık alan altında birleştirildi bölümlerde. B) TYLCV BALIK sinyali (kırmızı) ve karanlık alanda altında birleştirildi bölümlerde görüldüğü gibi DAPI lekeli çekirdekleri (mavi) görüldüğü bezi gibi.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51030/51030fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51030/51030fig7.jpg" /> Şekil 7. TYLCV-enfekte bitkinin kök yoluyla el kesme uzunlamasına bölümünde TYLCV BALIK. TYLCV-spesifik prob Cy3&#39;e konjuge (kırmızı) kırmızı ile gösterilen bir bölümü montaj ve görselleştirme. A) daha önce kullanılan ve DAPI boyama ile kombine edildi TYLCV floem elek elemanı sinyal, ve karanlık alan altında birleştirildi bölümlerde. B) yönelimi için parlak bir alan altında (A) gösterilen aynı kombine bölümlerde görüldüğü DAPI lekeli çekirdekler. ph: floem; xy:. ksilem <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig7highres.jpg" target="_blank">büyük im görmek için buraya tıklayın</a>yaş.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues at JoVE.com

Bitki ve Böcek Dokularındaki Virüslerin ve Endosimbiyotik Bakterilerin Lokalizasyonunda Floresan Yerinde Hibritlemeler FISH | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

fluorescence-situ-hybridizations-fish-for-localization-viruses

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

23.4K Görüntüleme.  Volcani Center.  Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir. 

Video: Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Nörobilim

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Biyoloji

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. Considering the extensive damage caused by begomoviruses to crop production worldwide, it is imperative to understand the interaction between begomoviruses and their whitefly vector. To do so, localization and quantification of the virus in the vector tissues is crucial. Here, using tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) as an example, we describe a detailed protocol to localize begomoviruses in whitefly midguts, primary salivary glands, and ovaries by immunofluorescence. The method is based on the use of specific antibodies against a virus coat protein, dye-labeled secondary antibodies, and a confocal microscope. The protocol can also be used to colocalize begomoviral and whitefly proteins. We further describe a protocol for the quantification of TYLCV in whitefly midguts, primary salivary glands, hemolymph, and ovaries by quantitative PCR (qPCR). Using primers specifically designed for TYLCV, the protocols for quantification allow the comparison of the amount of TYLCV in different tissues of the whitefly. The described protocol is potentially useful for the quantification of begomoviruses in the body of a whitefly and a virus-infected plant. These protocols can be used to analyze the circulation pathway of begomoviruses in the whitefly or as a complement to other methods to study whitefly-begomovirus interactions.

We describe an immunofluorescence and quantitative PCR method for the localization and quantification of begomoviruses in insect tissues. The immunofluorescence protocol can be used to colocalize viral and vector proteins. The quantitative PCR protocol can be extended to quantify viruses in whole whitefly bodies and virus-infected plants.

Whitefly Dokularında Begomovirüslerin İmmünfloresan ve Kantitatif PCR ile Lokalizasyonu ve Nicel Olarak Ölçülmesi

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Floresan

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Melezleme