Ghanim laboratuarda araştırma hiçbir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Alman-İsrail Vakfı (GIF) dan 908-42.12/2006, hiçbir hibe. IS-4062-07 Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (Bard), ve araştırma hibe hayır dan. MG İsrail Bilim Vakfı (ISF) için 884/07

1.. FISH Analizi Genel Sinek, Bitki ve Virüs Hazırlıklar <ol><li> Arka B ve Q biyotipindeki pamuk fidelerinin (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) üzerinde sinekler ve 25 ± 2 ° C,% 60 bağıl nem standart koşullar altında böcek geçirmez kafesleri ve büyüme odaların içinde korumak, ve 14 saat ışık / 10 saat karanlık fotoperiyot. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 15-19 endosymbiont-özgü primerler kullanılarak endosimbiyont ile enfeksiyonu test etmek için PCR yapın. </li><li> Ticari bir kreş veya bitki domates tohumları Domates fideleri (Solanum esculentum cv. Beefsteak) satın alın. </li><li> Bitkiler TYLCV 15 beyazsineği-aracılı aşılama için en uygun yaş (bölüm 4.1 &#39;e bakınız), dört gerçek yaprak aşamasına gelinceye kadar, yukarıda açıklanan aynı yetiştirme koşullarında koruyun. </li></ol> 2. Endo için böcek Taşıma, Fixation, Probe Tasarım, Hibritleşme ve Görselleştirmesymbiont BALIK <ol><li> Pamuk bitkilerinden aspirasyonu ile 10 yetişkin sinekleri toplayın, ya da pamuk yaprakları 10 3 üncü veya 4. evre perileri almak. </li><li> Hemen Eppendorf tüpleri içine Carnoy fiksatif (kloroform-etanol buzlu asetik asit, 06:03:01, hac / hac) içinde bırakın. (Tercihen bir gece) gece 2 saat için düzelt. </li><li> Tamamen fiksatif çıkarın ve 2 saat boyunca, etanol içinde% 6 H 2 O 2&#39;de renginin. </li><li> Oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde örnekleri korumak, veya bir sonraki adıma geçin. </li><li> Design probları, her bir bakterinin, 16S ribozomal RNA genlerinin göre tamamlayıcı DNA, ters primerler. Sondalar tasarımı için, hesaba PCR primerleri tasarımı için aynı düşünceler almak. Oligonükleotid probları kullanarak BTP1 5&#39;-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 &#39;, 5&#39;-Cy3 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3&#39;, 5&#39;-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 &#39;ve 5&#39;-Cy3 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 &#39;sırasıyla Portiera, Rickettsia, Hamilonella ve Arsenophonus, spesifik hedefleme için. </li><li> , Ml başına hibridizasyon tamponu içinde karanlıkta gece boyunca melezleşme numuneleri (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.9 M NaCl,% 0.01 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat,% 30 [hacim / hacim] formamid) 10 pmol içeren floresan probe . Gerektiğinde farklı floresan boyalar ile birden fazla probun birleştirin. Hedeflenen bakteri ve hiçbir prob örneklerinin negatif kontroller ile enfekte olmayan whiteflies kullanın. </li><li> Bir sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde, bir mikroskop lamı üzerine, bütün numunelerin bir kapak monte kayma ile kapak, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile sağlanır. </li></ol> 3. Beyazsineği Organ Diseksiyon, Fixation, Hibritleşme ve TYLCV FISH için Görselleştirme <ol><li> Sürekli aspirasyon ve ane tarafından TYLCV enfekte domates bitkileri yetiştirilen yetişkin sinekleri toplayınaseton ile emprenye kağıt havlu maruz bırakılarak sthetize. Aseton çok uzun pozlama whiteflies dokuları çözebilirsiniz gibi sadece 1-2 dakika whiteflies Açığa. Ibridazyonunu onaylamak için enfekte olmayan domates bitkileri ve denetimler için hiçbir prob örnekler üzerinde yetiştirilen nonviruliferous whiteflies kullanın. </li><li> Depresyon mikroskop Mount whiteflies stereo mikroskop kullanarak organı diseksiyon için kayar. </li><li> Prothorax gelen böcek başını çekmeye ve 1x PBS içinde tükürük bezlerini incelemek nedeniyle küçük boyutu, daha iyi görüntülenmesi için% 1 toluidin mavisi boyası ile desteklenmiş. 2-3 dakika boyunca, lekenin emme izin verir. </li><li> Göğüs ve gözlemlemek ve midgut dışarı çıkarmak için karın arasındaki noktada ayrı böcek çekin. Karın ucunda forseps ile iterek karın içeriğini kovun. </li><li> Yavaşça başarılı kesitlerden PBS ve toluidin mavisi çıkarın ve yavaşça 5 dakika boyunca organlarını düzeltmek için Carnoy fiksatifi 300 ul ekleyin. </li><li> Akesilen organlarda kontrolsüz hareketini önlemek üzere depresif kuyunun bir taraftan olup üstten fiksatif dd. Bir kez fiksatif dokunmadan, organları cama yapışacak ve süreç boyunca onlar hareket etmez. </li><li> Fiksatif çıkarın ve TYLCV kat protein geninde bir diziye tamamlayıcı olan floresan DNA probu Cy5-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;, 10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul ekleyin. </li><li> Altındaki ıslak havlu kağıt ile birlikte küçük bir plastik kutu içinde oluşan küçük bir nemli odası içinde örnek ile inkübe edilmesi slayt ile karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca hibridize olur. </li><li> Hibridizasyon sonra, ince bir diseksiyon aleti ile organları almak ve hızla DAPI (1 x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile içerdiği yeni hibridizasyon tamponu 30 ul ihtiva eden taze bir mikroskop lamı taşıyın. </li><li> Bir kapak kayma örnekleri örtün, zekâ mühürBir floresan veya konfokal mikroskop altında h oje ve görünümü. </li></ol> 4. Bitki Taşıma, TYLCV FISH için El-kesit, Fiksasyon ve Hibritleşme <ol><li> Virüliferöz beyaz sinek aracılı aşılama kullanılarak TYLCV olan domates fideleri inoküle. Virüs symptomless bitkilerde bu FISH yöntemi aşılamadan bir hafta sonra kullanılarak tespit edilebilir. Tipik hastalık belirtileri görülebilir üç hafta sonrası aşılama vardır. Belirli bir hibridizasyon teyit etmek için kontrol enfekte olmamış domates bitkileri ve prob örnekleri kullanın. </li><li> Domates el kesme 2-4 cm uzun boyuna veya enine kesitler hazırlamak için keskin bir histolojik jilet kullanın sapları ve yaprakları. </li><li> Eppendorf tüpleri içinde, 2 saat için oda sıcaklığında gece boyunca Carnoy sabitleyici olarak bölümleri düzeltin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında birkaç gün ila birkaç hafta boyunca mutlak etanol içinde muhafaza bölümleri, ya da bir sonraki adıma geçin. </li><li> Bölümleri yıkayınHibridizasyon tamponu ile üç kez, her biri 1 dakika. </li><li> TYLCV kılıf proteini genine bir diziye tamamlayıcı olan oligonükleotid prob, floresan Cy3-5&#39;-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 &#39;10 pmol ile takviye edilmiş hibritleme tampon 500 ul bölümleri hibridize. </li><li> Melezleme tamponu, bölümleri üç kez, her biri 1 dakika yıkayın. </li><li> DAPI (1x PBS içinde 0.1 mg / ml) ile takviye edilmiş ve sıvı engelleyicisi ile yer hibridizasyon tamponu içinde bütün montaj bölümleri, bir floresan veya konfokal mikroskop altında oje ve görünümü ile mühür, bir lamel ile kapsamaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Czosnek, H., Laterrot, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+worldwide+survey+of+Tomato+yellow+leaf+curl+viruses.">A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses.</a> Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).</li><li>Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Tomato+Yellow+Leaf+Curl+Virus+in+South+Carolina.">First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina.</a> Plant Dis. 90, 379 (2006).</li><li>Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+Florida+and+implications+for+the+spread+of+this+and+other+geminiviruses+of+tomato.">Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato.</a> Plant Dis. 83, 984-988 (1999).</li><li>Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+North+Carolina.">Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina.</a> Plant Dis. 86, 73 (2002).</li><li>Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phylogeographical+analysis+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex+based+on+mitochondrial+DNA+markers.">A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers.</a> Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+translocation+in+the+circulative+transmission+pathway+of+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Phytopathology. 91, 188-196 (2001).</li><li>Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive++salivary+and+reproductive+organs+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+Hemiptera:+Aleyrodidae)+B+type.">Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type.</a> J. Morphol. 248, 22-40 (2001).</li><li>Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+geminiviruses+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci+(Homoptera:+Aleyrodidae).">Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae).</a> Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).</li><li>Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pathway+of+geminivirus+in+whitefly+extracts,+saliva,+hemolymph+and+honeydew.">Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew.</a> Phytopathology. 89, 239-246 (1999).</li><li>Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulative+pathway+of+begomoviruses+in+the+whitefly+vector+Bemisia+tabaci&#8212;insights+from+studies+with+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci&#8212;insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus.</a> Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmission+efficiency+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virusby+the+whitefly+Bemisiatabaciis+correlated+with+the+presence+of+aspecificsymbiotic+bacterium+species.">The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species.</a> J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).</li><li>Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transovarial+transmission+of+Rickettsia+spp.+and+organ-specific+infection+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).</li><li>Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).</li><li>Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+and+inexpensive+method+for+localization+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+and+Potato+leafroll+virus+in+plant+and+insect+vectors.">A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors.</a> J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).</li><li>Nirgianaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).</li><li>Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+bacteriocyte-associated+endosymbionts+of+plant+sap-sucking+insects.">Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects.</a> Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).</li><li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+(Homoptera)+Aleyrodidae).">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae).</a> App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).</li><li>Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Wolbachia+infection+in+Bemisia+tabaci.">Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).</li><li>Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+localization+of+bacterial+symbionts+in+three+whitefly+species+(Hemiptera:+Aleyrodidae)+from+the+east+coast+of+the+Adriatic.">Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic.</a> Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Aynı zamanda bitki ve böcek ev sahibi vektör bir bitki virüsünün lokalizasyonu ve onların özel sineği konukçuda endosimbiyotik bakteriler için burada açıklanan protokol, bitki ve hatta hayvan dokularında diğer virüslerin lokalizasyonu için uyarlanabilir. Ayrıca, protokol endosimbiyotik ve patojenik bakteri ve bitki ve hayvan sistemlerinin diğer mikroorganizmaları lokalize etmek için de kullanılabilir. Tarif edilen yöntemler, kısa, flüoresan-işaretli oligonükleotid DNA prob ve hücredeki hedef ...

Onların hastalıklı bitki barındıran bitki virüs ve diğer patojenleri arasındaki etkileşimleri inceleyerek, bu onların bilgisayarlar üzerinde olumsuz etkilere neden bakılmaksızın, in situ patojenleri ve kendi nükleik asitleri görselleştirmek için önemlidir. Bitki hücreleri içinde ve arasında patojen hareketini incelemek bu çok önemlidir. Patojenin gen ürünlerinin yerinde Yerleştirmede patojenite sürecini incelemek için diğer yaklaşımları tamamlamaktadır önemli bir adımdır. Birçok bitki patojenleri, özellikle virüsler, kendi vektörleri ile karmaşık ve samimi etkileşimleri olan, böcekler tarafından iletilir. Kendi vektörlerde bu virüslerin lokalizasyonu iletim yolunu incelemek için önemlidir ve vektör içinde olası etkileşim siteleri. Bazı böcek-vectored bitki virüsleri iletim bu böceklerin içinde ikamet endosimbiyotik bakteriler tarafından destekli. Iyi bu bitki virüsleri b iletim incelemek içinbunların vektörleri, genel olarak endosimbiyotik bakteriler görsel ve özellikle virüs aktarımı dahil olanlar, için de gereklidir y. Virüs ve endosimbiyotik bakteriler yardımcı sınırlama böylece böcek ev sahibi olan bu organizmalar arasındaki olası ilişkileri araştırmak için arzu edilir. Kenara virüs iletim, endosimbiyotik bakteri böcek vektörlerin biyolojinin çeşitli yönlerini etkileyen, böceklere olan bu bakterilerin, böylece mekansal lokalizasyonu yüksek ilgi ve önem taşımaktadır. Domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV) (Begomovirüs, Geminiviridae), tüm dünyada yetiştirilen 1-4 domates en önemli viral bir hastalıktır karmaşıktır. TYLCV floem sınırlı bir virüs olduğunu ve sadece beyaz sinek Bemisia tabaci 5,6 ile vectored edilir. Onların beyaz sinek vektörlerinde begomovirüslerinden translokasyon açıklayan bir model 6-9 önerilmiştir. İki özel bariyerler aktif dur kesilmişlerdirmidgut / hemolenfi ve hemolenfi / tükürük bezi bariyerler: Bu circulative iletimini ing. Bu iletim işlemi virüs kapsidine kabul bilinmeyen alıcıları tarafından aracılık ettiği varsayılmaktadır. TYLCV B. çapraz düşünülmektedir Bu bitki içine enjekte edilmeden önce orta bağırsak tabaci 6,10 ve birincil salya bezi 6 boyunca emilir. Beyaz sinek hemolimf ise, TYLCV böcek ikinci endosimbiyotik Hamiltonella bakteri tarafından üretilen bir proteinin GroEL ile etkileşime girer. Bu etkileşim hemolimfteki TYLCV güvenli taşıma sağlayan ve böcek bağışıklık sistemi 11. Hamiltonella ve Portiera birincil endosymbiont tarafından saldırılara karşı korur beyaz sinek, bacteriocytes yerleştirilmiştir, hemolenfi ve ev endosimbiyotik bakteriler 11. B. bulunan böcek hücreleri tabaci Rickettsia&#39;lara, Arsenophonus, Wolbachia ve Fritsch gibi ek endosimbiyotik bakteri barındırırbacteriocytes içinde veya dışında lokalize edilebilir ve adet, böceğin biyolojisi 12 farklı etkileri vardır. Çeşitli raporlar mikroskobik kalın bölümünde 10,13 üzerinde yerinde böyle Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), antikorlar ve RNA gibi zaman alıcı ve masraflı protokolleri kullanarak bitki ve limonluk içinde TYLCV yerelleştirme çalışması için çalıştılar, yeni bir çalışma lokalizasyonu tarif basit bir protokol 14 ile kendi tesis ve vektör konak içindeki bitki virüsleri. Burada B. TYLCV lokalizasyonu için basit bir protokol açıklar tabaci midguts ve tükürük bezleri disseke ve bölümlerde TYLCV-enfekte bitkilerden hazırladı. Biz daha Portiera, B. birincil endosymbiont lokalizasyonunu tarif tabaci ve ikincil endosimbiyontlar Hamitonella, Rickettsia ve Arsenophonus. Bu protokol, kısa DNA sondaları kullanılarak dayalı olduğunufloresan, 5 &#39;ucunda etiketlenmiştir ve özellikle viral ya da bakteriyel gen dizilerinde tamamlayıcı dizilere hibridize edilir. Numune işleme nispeten kolaydır ve elde edilen sinyal çok özeldir. Açıklanan protokol, bunların bitki, hayvan ve böcek ana virüs, bakteri ve diğer patojenleri lokalize etmek için kullanılabilir ve ayrıca herhangi bir dokuda mRNA lokalize etmek için de kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Fluorescently labeled&#160; Probes</td>
			<td style="width:95px;">Metabion</td>
			<td style="width:129px;">20 bp HPLC purified</td>
			<td style="width:212px;">Sequence designed by customer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Toluidine blue</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">89640</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">L3771</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Formamide</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">F9037</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">T5941</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">320099</td>
			<td style="width:212px;">Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Blocker</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>22309</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence in situ hybridizations (fish) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues

In situ hibridizasyon (FISH) floresan yaygın ökaryotik hücrelerde gen transkript görselleştirme ve bundan başka, virüs ve bakteri enfeksiyonu gibi hücreye diğer bileşenleri görselleştirmek için modifiye edilebilir için kullanılan çeşitli teknikler verilen bir isimdir. Mekansal yerelleştirme ve enfeksiyon sırasında virüs ve bakterilerin görselleştirme farklı uyaranlara tepki olarak böyle mikroarray&#39;ler ve RNAseq olarak ifade profilleme deneyler tamamlayan önemli bir adımdır. Bu maddelerle zamanmekansal enfeksiyonları anlama hücresel bileşenler ile etkileşimi anlamaya yönelik biyolojik deneyler tamamlar. Bu tür raportör gen sistemleri veya immünohistokimyasal yöntemler gibi virüs ve bakterileri görselleştirmek için çeşitli teknikler zaman alıcıdır ve bazı model organizmalar ile çalışmak ve karmaşık yöntemler dahil sınırlıdır. Hücreye RNA ya da DNA türleri hedef FISH nispeten kolay ve hızlı bir benimgenlerin zamanmekansal lokalizasyonu eğitim ve tanı amaçlı ThOD. Bu yöntem sağlam ve protokolleri pahalı değil kısa hibritlenmesini, ticari olarak satın sondalar, istihdam zaman uygulanması nispeten kolay olabilir. Örnek hazırlama, tespit, melezleme ve mikroskopik görüntüleme karmaşık adımlar içermeyen bu özellikle sağlamdır. Burada böcek ve bitki dokularında bakteri ve virüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu yöntem, 5 &#39;ya da 3&#39; floresan boyalar konjüge kısa DNA probları uçları 20 baz çifti ile basit bir hazırlama, tespit ve böcek bütün bağlar ve kesilen organlarda veya el yapımı bitki bölümlerinin hibridizasyona dayanır. Bu protokol, başarılı bir şekilde böcek ve bitki dokularının, bir dizi tatbik edilmiştir ve hücrede mRNA veya başka RNA veya DNA türleri ifadesini analiz etmek için kullanılabilir.

Bu yazıda incelenen sistem Şekil 1 &#39;de gösterilen ve TYLCV ile enfekte olmuş bir bitki, bir yetişkin beyaz sinek ve B&#39;nin bir peri içerir tabaci ve böcek TYLCV translokasyon için yol gösteren beyaz sinek iç anatomisi. 2. birincil simbiyonudur Portiera ve ikincil simbiyonudur için bir yetişkin beyaz sineğe çift BALIK göstermektedir Arsenophonus. Şekil 3. Portiera ve Hamiltonella</em...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues at JoVE.com

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues | Immunology and Infection | Video

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

fluorescence-situ-hybridizations-fish-for-localization-viruses

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

23.2K Görüntüleme.  Volcani Center.  Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir. 

Video: Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Pamuk Yeşilkurt bir densovirüs Host Fitness Host doku Dağılımı, İletim-modunu ve Etkisi incelenmesi için Protokoller

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. Considering the extensive damage caused by begomoviruses to crop production worldwide, it is imperative to understand the interaction between begomoviruses and their whitefly vector. To do so, localization and quantification of the virus in the vector tissues is crucial. Here, using tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) as an example, we describe a detailed protocol to localize begomoviruses in whitefly midguts, primary salivary glands, and ovaries by immunofluorescence. The method is based on the use of specific antibodies against a virus coat protein, dye-labeled secondary antibodies, and a confocal microscope. The protocol can also be used to colocalize begomoviral and whitefly proteins. We further describe a protocol for the quantification of TYLCV in whitefly midguts, primary salivary glands, hemolymph, and ovaries by quantitative PCR (qPCR). Using primers specifically designed for TYLCV, the protocols for quantification allow the comparison of the amount of TYLCV in different tissues of the whitefly. The described protocol is potentially useful for the quantification of begomoviruses in the body of a whitefly and a virus-infected plant. These protocols can be used to analyze the circulation pathway of begomoviruses in the whitefly or as a complement to other methods to study whitefly-begomovirus interactions.

We describe an immunofluorescence and quantitative PCR method for the localization and quantification of begomoviruses in insect tissues. The immunofluorescence protocol can be used to colocalize viral and vector proteins. The quantitative PCR protocol can be extended to quantify viruses in whole whitefly bodies and virus-infected plants.

Whitefly Dokularında Begomovirüslerin İmmünfloresan ve Kantitatif PCR ile Lokalizasyonu ve Nicel Olarak Ölçülmesi

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...